Результат интеллектуальной деятельности: КОМБИНИРОВАННЫЕ СПОСОБЫ ТЕРАПИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к лечению злокачественной опухоли и комбинированным способам ее терапии.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СОКРАЩЕННЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ: Bchl: бактериохлорофилл: Bchl-D: производное бактериохлорофилла; BLI, биолюминесцентная визуализация; Bpheid: бактериофеофорбид a (C-17²-свободная карбоновая кислота, образованная из Bphe, без центрального атома металла); CTX, CY: циклофосфамид; DC: дендритные клетки; DDW, дважды дистиллированная вода; GEM: Гемзар, гемцитабин: GFP, зеленый флуоресцентный белок; IVIS, система оптической визуализации in vivo; Luc, люциферин, люцифераза; IVIS, система оптической визуализации in vivo; luc, люцифераза; Ly6G, комплекс лимфоцитарного антигена 6, представляющий собой гликозилфосфатидилинозитол (GPI)-связанный антиген дифференцировки массой 21-25 кДа, который экспрессируется клетками миелоидного происхождения; Ly6G, комплекс лимфоцитарного антигена 6, представляющий собой гликозилфосфатидилинозитол (GPI)-связанный антиген дифференцировки массой 21-25 кДа, который экспрессируется клетками миелоидного происхождения; MDSC: клетки-супрессоры миелоидного происхождения; родобактериохлорин: тетрациклический 7,8,17,18-тетрагидропорфирин, имеющий группу -CH₂CH₂COOH в положении 17, -COOH в положении 13, метильные группы в положениях 2, 7, 12, 8, и этильные группы в положениях 3 и 8; Pd-Bpheid: Pd-бактериофеофорбид a; NIR: ближняя инфракрасная область; PDT: фотодинамическая терапия; RGD-4C: циклический нонапептид CDCRGDCFC-N6H₂; ROS: активные формы кислорода; VTP: нацеленная на сосуды PDT.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Комбинирование способов терапии, которые нацелены на злокачественную опухоль и подавляющие иммунную систему клетки, представляет собой перспективное направление для контроля роста первичных опухолей и предупреждения роста метастазов.

Клетки-супрессоры миелоидного происхождения (MDSC) представляют собой гетерогенную популяцию клеток, которые определяются их миелоидным происхождением, незрелым состоянием и способностью значительно подавлять T-клеточные ответы. Они регулируют иммунные ответы и репарацию тканей у здоровых индивидуумов, и их популяция быстро растет при воспалении, инфекции и злокачественной опухоли. MDSC в целом состоят из двух подгрупп - гранулоцитарные (G-MDSC) и моноцитарные (M-MDSC), которые морфологически сходны с гранулоцитами и моноцитами, соответственно (Gabrilovich, 2017).

MDSC демонстрируют мощную иммуносупрессорную активность при злокачественной опухоли. MDSC инфильтрируют опухоли и эффективно ингибируют специфичные к злокачественной опухоли цитотоксические T-клетки (Gabrilovich, 2017). Опухоли эволюционировали для "приспособления" этих свойств MDSC для препятствования противоопухолевой активности и для обеспечения экспансии опухоли в окружающие ткани и в отдаленные области, посредством эффектов на ангиогенез и метастазов. Новые способы терапии для сдерживания активности MDSC имеют ключевое значение для эффективного контроля опухолевых клеток посредством иммунного ответа (Condамин et al., 2015; Diaz-Montero et al., 2009; Gabrilovich, 2017; Marvel and Gabrilovich, 2015; Najjar and Finke, 2013; Quail, 2013 #18).

Супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC) моно- или полиморфноядерного типа осуществляют подавление иммунной системы и, тем самым, ускользание злокачественных клеток от противоопухолевого иммунитета путем нейтрализации цитотоксических T-клеток посредством образования оксида азота и пероксинитрита (Condамин et al., 2015; Gabrilovich и Nagaraj, 2009). Кроме того, ранняя дифференцировка миелоидных клеток-предшественников в MDSC происходит за счет созревания дендритных клеток (Gabrilovich, 2017), необходимого для профессионального представления ассоциированных с опухолью антигенов (TAA), врожденного иммунитета и инициации адаптивного иммунного ответа. Было обнаружено, что прогрессирование рака молочной железы, предстательной железы, легкого, почки и других злокачественных опухолей от ранней локализованной стадии к диссеминированию и метастазам строго коррелирует с пролиферацией MDSC (на периферии, в селезенке, лимфатических узлах и микроокружении опухоли пациента (Brusa et al., 2013; Condамин et al., 2015; Gabrilovich, 2017; Gabrilovich and Nagaraj, 2009; Najjar and Finke, 2013)). Повышение уровня MDSC усиливает иммунное подавление путем блокирования активации CD4 и CD8 T-клеток (Gabrilovich, 2017). Это повышение уровня в первую очередь коррелирует с секрецией цитокинов, таких как G-CSF, GM-CSF, IL-6 и другие, из злокачественных клеток, за которой следует аутокринная стимуляция через IL-6 и прочие из MDSC (Gabrilovich and Nagaraj, 2009). В увеличенных концентрациях MDSC обеспечивают защиту первичных опухолей и циркулирующих злокачественных клеток от иммунного надзора и токсичности и помогают сформировать нишу для опухоли.

В настоящее время проводятся исследования множества способов ингибирования MDSC. Их можно ориентировочно подразделить на способы, которые (a) обеспечивают дифференцировку MDSC в зрелые не являющиеся супрессивными клетки (полностью транс-ретиноевая кислота (ATRA), витамин D) (Najjar and Finke, 2013), (b) снижают уровни MDSC (сунитиниб, гемцитабин (GEM), фторурацил (f-5U), бардоксолон метил (CDDO-Me) (Najjar and Finke, 2013), или (c) функционально ингибируют MDSC (ингибиторы фосфодиэстеразы 5 типа (PDE-5), ингибиторы циклооксигеназы 2 (COX-2)) (Najjar and Finke, 2013).

Было выявлено, что гемцитабин (GEM, Гемзар), фторурацил (f-5U) и другие одобренные FDA химиотерапевтические средства, которые используют для лечения различных злокачественных опухолей в клинке, селективно снижают содержание MDSC как у имеющих опухолей мышей, так и у человека (Le et al., 2009; Suzuki et al., 2005; Vincent et al., 2010). Однако, несмотря на замедление прогрессирования злокачественной опухоли, ни одно из этих лекарственных средств не увеличивало в значительной степени время до появления метастазов и выживаемость пациентов (например, при лечении рака поджелудочной железы).

Было показано, что фотодинамическая терапия (PDT) в общем и нацеленная на сосуды PDT (VTP) в частности с использованием новых производных бактериохлорофилла (далее Bchl-D) селективно устраняет локализованные солидные опухоли в различных мишенях (WO 00/33833; WO 2004/045492). В частности, VTP с Bchl-D, обозначаемым как WST11, после успешных клинических испытаний (Azzouzi et al., 2013, 2017; Eymerit-Morin et al., 2013) недавно была одобрена для применения для лечения рака предстательной железы на ранней стадии.

Периодическая химиотерапия, которая первоначально была предназначена для ингибирования ангиогенеза, вовлекает химиотерапевтические средства в низкой дозе, вводимые по схеме с частыми регулярными введениями без длительных перерывов, и она минимизирует тяжелую токсичность (Ge et al., 2012; Ghiringhelli et al., 2007). Было обнаружено, что такие способы лечения, в частности, воздействуют на пролиферацию проопухолевых иммунных клеток со специфичностью к популяции клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящее изобретение относится средству, направленному против супрессорных клеток миелоидного происхождения (далее "средство против MDSC") и производному бактериохлорофилла (далее ʺBchl-D) для применения в комбинированной терапии злокачественной опухоли, где средство против MDSC и Bchl-D вводят последовательно и после введения Bchl-D следует фотодинамическая терапия (PDT).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли посредством комбинированной терапии, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом: (i) терапевтически эффективного количества средства против супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC) (далее "средство против MDSC"); и (ii) терапевтически эффективного количества производного бактериохлорофилла (Bchl-D) с последующей фотодинамической терапией (PDT) (далее "Bchl-D PDT").

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Материалы патента или заявки содержат по меньшей мере один чертеж, выполненный в цвете. Копии публикации этого патента или патентной заявки с цветными чертежами будут предоставлены Бюро по регистрации патентов и торговых марок США по запросу и при оплате необходимой пошлины.

На фиг.1A представлено накопление и выведение in vivo STL-6014 (верхний ряд) и STL-7012 (нижний ряд) у мышей, имеющих опухоль молочной железы 4T1. На фиг.1B представлено накопление и/или удерживание STL-6014 в опухоли и различных органах через 16 ч после введения.

На фиг.2 представлено: (2A) схема лечения 1 мышей, имеющих опухоли 4T1 в их молочных железах с использованием комбинированного проведения STL-6014 PDT и введения Гемзара, начинавшегося либо за двое суток до PDT (синие стрелки), либо через одни сутки после PDT (оранжевые стрелки); (2B) облученные светом опухоли через 6 ч после полюсной инъекции STL-6014; (2C) биолюминесценция люциферина у мышей с первичной и метастазирующей опухолью (слева), только первичной опухолью (середина) и вылеченных мышей (справа).

На фиг.3 представлен процент животных, свободных от ортотопных опухолей 4T1 на 7 сутки (бесцветный) и 30 сутки (черный) после одного из пяти режимов лечения. Лечение STL-6014 PDT проводили на 7 сутки после пересадки 4T1 в молочную железу и введение Гемзара (GEM) проводили согласно схеме лечения 1, представленной на фиг.2. Использовали следующие режимы лечения: (1) без лечения (контроль, N=18); (2) STL-6014 PDT (PDT, N=29); (3) периодическое введение Гемзара (GEM, N=11), начиная на 5 сутки после трансплантации; (4) периодическое введение Гемзара, начиная на 1 сутки после применения STL-6014 PDT (N=19) PDT через 6 ч после инъекции STL-6014); и (5) периодическое введение Гемзара, начиная за 2 суток до STL-6014 PDT (N=20, PDT 6 ч после инъекции STL-6014).

На фиг.4 представлены кривые выживания Каплана-Мейера для мышей Balb/C, имеющих ортотопные опухоли 4T1 и подвергаемых лечению посредством различных терапевтических режимов, описанных на фиг.3. Контроль (N=18) (♦) - без лечения; STL-6014 (N=29) () - STL-6014 PDT в качестве монотерапии применяют на 7 сутки после пересадки опухоли, как описано в "Материалах и способах"; Gem ()(N=11) - 1-ое введение Гемзара проводят в качестве монотерапии на 5 сутки после пересадки опухоли; PDT 6 ч плюс GEM (N=19)- PDT применяют через 6 ч после введения STL-6014 в комбинации с введением Гемзара, начинающимся на 1 сутки после PDT и каждую неделю после этого в течение еще 5 недель; PDT 6 ч плюс GEM, начиная -2 (N=20) (•) - PDT проводят через 6 ч после введения STL-6014 в комбинации с введением Гемзара 5 раз, начиная за 2 суток до PDT и каждую неделю после этого в течение еще пяти недель.

На фиг.5 представлены круговые диаграммы, демонстрирующие процент животных, у которых были обнаружены метастазы 4T1 в легкие в день умерщвления животных после двух различных режимов STL-6014 PDT в комбинации с Гемзаром. (5A) STL-6014-PDT комбинируют с введением Гемзара, начиная через одни сутки после применения STL-6014-PDT (N=20). (5B) STL-6014-PDT комбинируют с введением Гемзара, начиная за 2 суток до применения STL-6014-PDT (N=19).

На фиг.6 проиллюстрировано прогрессирование опухоли 4T1 у мышей Balb/C, которым повторно пересаживали второй ортотопный трансплантат из 2×10⁵ клеток 4T1 после излечения от опухолей 4T1 посредством STL-6014 PDT в комбинации с Гемзаром, вводимым за 2 суток до PDT. Повторную пересадку проводили через 120 дней после первого излечения (240 суток после первой трансплантации опухоли). (6A) Выживание индивидуальных животных (N=10) после пересадки опухолей 4T1 у наивных животных, каждая кривая означает одно животное. (6B) Выживание индивидуальных животных (N=15) после пересадки опухолей 4T1 у животных, которых лечили и которые были вылечены после первой пересадки опухоли. Каждая кривая означает 1 животное, за исключением оранжевой/зеленой кривой, которая означает 10 животных. На 50 сутки после лечения 10/15 этих животных не имели ни первичной, ни метастатической опухоли.

На фиг.7 представлена схема лечения 2 для комбинированного проведения WST11 VTP и введения Гемзара для мышей, имеющих опухоли MB49 (мочевой пузырь). Злокачественные клетки MB49 (10⁶) пересаживали в заднюю конечность мышей Balb/C на -15 сутки. Первое введение Гемзара (50 мг/кг) проводили на -3 сутки, затем на 4 сутки и продолжали курсами по 2 раза/неделя, 3 недели/месяц с всего 12 введениями/90 суток. WST11 VTP проводили на 15 сутки трансплантации опухоли. WST11 (9 мг/кг) инфузировали в/в в течение 5 минут, после чего проводили облучение светом в течение 10 минут при 753 нм с использованием лазера Modulight при 120 мВт/см².

На фиг.8 представлен ответ мышей, которые трансплантировали опухоли MB49, на различные режимы лечения на основе схемы лечения 2 (фиг.7). (8A) Средний рост опухоли (планки погрешности-SEM). Черный-контроль (0/17 вылеченных, p<0,0001 против VTP+ Гемзар); синий-только Гемзар (0/19 вылеченных, p<0,0001 против VTP+Гемзар); красный-VTP отдельно (3/19 вылеченных, p<0,0005 против VTP +Гемзар); зеленый-VTP+Гемзар (11/17 вылеченных). Вычисление значений P основано на двухстороннем тесте Anova. (8B) Рост опухоли в задней конечности отдельных мышей после описанных выше комбинаций лечения WST11 VTP. Верхняя панель слева-контроль, 0/17 вылеченных; верхняя панель справа-только Гемзар, 0/19 вылеченных; нижняя панель слева-только VTP, 3/19 вылеченных; нижняя панель справа-VTP+Гемзар, 11/17 вылеченных. (8C) Предупреждение метастазов в легкое, демонстрируемых посредством биолюминесценции на 25 сутки после начала лечения: верхняя панель - средняя интенсивность излучения в легких отдельных мышей (*p<0,005, ** p<0,0001); нижняя панель верхний ряд - изображения контрольных животных и животных, которым вводили Гемзар отдельно; нижняя панель нижний ряд - изображения вылеченных животных. (8D) Общая выживаемость животных после различных режимов лечения.

На фиг.9 представлено развитие системного противоопухолевого ответа после различных режимов лечения. Злокачественные клетки MB49 трансплантировали в правую заднюю конечность мышей Balb/C на -15 сутки. (9A) Первое введение Гемзара (50 мг/кг) проводили на -3 сутки, затем на 4 сутки и продолжали курсами по 2 раза/неделя в течение 3 недель. Затем следовал перерыв, составляющий одну неделю, а затем вновь курс из трех недель с всего 12 введениями/90 суток. WST11 VTP проводили на 15 сутки после трансплантации посредством WST11 в дозе 9 мг/кг инфузированного в/в в течение 5 минут, с последующим освещением в течение 10 минут при 753 нм с использованием лазера Modulight при 120 МВт/см². Вторую опухоль трансплантировали в заднюю левую конечность через 1 сутки после VTP. (9B) Рост опухоли у индивидуальных животных второй опухоли, трансплантированную в левую заднюю конечность через 1 сутки после WST11 VTP; верхняя панель слева - контроль (рост у 14/20 животных), верхняя панель справа - Гемзар (рост у 15/20 животных), нижняя панель слева - WST11 VTP отдельно (рост у 12/19), нижняя панель справа - VTP+Гемзар (рост у 5/17). (9C) Кривые выживания Каплана-Мейера для животных, которые были вылечены от MB49 посредством PDT и которым затем инъецировали клетки MB49 в хвостовую вену.

На фиг.10 показано, что нехватка популяций T-клеток и B-клеток снижает терапевтический эффект VTP, гемцитабина и их комбинаций в опухолях MB49. (10A) Кривые Каплана-Мейера, демонстрирующие статистически значимое снижение общей выживаемости у иммунодефицитных (Rag1KO, n=22) мышей по сравнению с иммунокомпетентными ((WT N=19) мышами, которых лечили посредством WST11 VTP (p<0,0001). (10B) Общая выживаемость мышей, которым вводили Гемзар отдельно (WT N=10, Rag1KO N=10, p<0,05). (10C) Общая выживаемость мышей, которых лечили комбинацией (WT N=10, Rag1KO N=7, p<0,005).

На фиг.11 представлены репрезентативные диаграммы популяций иммунных клеток в селезенке мышей, имеющих 4T1, у не подвергнутых лечению (контрольных) животных: (11A) гранулоцитарные/моноцитарные супрессорные клетки миелоидного происхождения (G/M-MDSC) и нейтрофилы; (11B) дендритные клетки (DC); (11C) ассоциированные с опухолью макрофаги (TAM); (11D) CD4 и CD8 T-клетки; (11E) гейтирование регуляторных T-клеток (Treg).

На фиг.12 проиллюстрирован эффект лечения STL-6014-PDT в комбинации с введением Гемзара, как описано в схеме лечения 1 (представленной на фиг.2) на популяции иммунных клеток селезенки у мышей, имеющих 4T1, через 1-3 недели после лечения. (12A) G/M-MDSC (бесцветный), TAM (черный). (12B) DC (бесцветный), CD8 (черный); (12C) Treg.

На фиг.13 представлены изменения массы селезенки животных, которым ортотропно трансплантировали злокачественные клетки 4T1, через 1 и 3 недели без лечения с животными, имеющими опухоли через 7 суток после трансплантации, которым проводили лечение STL-6014 PDT отдельно, Гемзаром отдельно и комбинированное лечение. Схема лечения представлена на фиг.2.

На фиг.14 представлена популяция врожденных иммунных клеток в селезенке животных, которым трансплантировали опухоли MB49 в заднюю конечность и которых не подвергали лечению (контроль), и животных, которым проводили WST11 VTP в комбинации с одним из двух режимов лечения Гемзаром. (14A) Иммуногистохимическое (IHC) окрашивание на CD11b+ в селезенке на 6 сутки после VTP (4x метка 200 мкм). (14B) Нейтрофилы/G-MDSC (CD11b+Ly6G+, средний график) и моноциты/M-MDSC (CD11b+Ly6C+, график справа) через 9 суток после WST11 VTP. Животным, отобранным для FACS-анализа, дозировали Гемзар на -3, 1, 4, 7 сутки либо в низкой дозе (60 мг/кг, красный), либо в высокой дозе (120 мг/кг, зеленый) (** p<0,01, * p<0,05).

На фиг.15 представлен адаптивный иммунный ответ мышей, имеющих опухоли MB49, на различные режимы лечения. Слева - дренирующие лимфатические узлы, в середине - селезенка, справа - кровь; (15A) верхняя панель - CD8+ клетки, нижняя панель - CD8+/Treg. Зеленый - лечение или контроль в комбинации с лечением Гемзаром в дозе 120 мг/кг; синий - лечение или контроль без лечения Гемзаром. Воздействие WST11 VTP в комбинации с введением Гемзара, как описано на фиг.7 (схема 2) в высокой дозе (120 мг/кг), на CD8+ и CD8+/Treg в опухоли, крови и селезенки через 6 суток после лечения (** p<0,01, * p<0,05). (15B) Верхняя панель - 6 сутки, синий - отсутствует лечение Гемзаром, зеленый - лечение Гемзаром в дозе 120 мг/кг; нижняя панель - 9 сутки; синий - отсутствие лечения Гемзаром, красный - лечение Гемзаром в дозе 75 мг/кг; зеленый - лечение Гемзаром в дозе 120 мг/кг; левый столбец - Treg, средний столбец - Teff/Treg, правый столбец - Tcm (активированные CD8 T-клетки).

На фиг.16 представлена схема лечения WST11 VTP, которую проводили на 7 сутки после пересадки опухоли с иммунным модулированием циклофосфамидом (CTX), проводимым за 3 суток до VTP, или без него, у мышей, имеющих опухоли 4T1 в задней конечности.

На фиг.17 проиллюстрирован локальный ответ индивидуальных мышей Balb/C, имеющих опухоли 4T1 в задней конечности, на различные терапевтические режимы фиксированной дозой 9,0 мг/кг WST11 при различной интенсивности света (мВт/см²) и дозировках CTX. Верхний ряд: мыши без лечения (слева, N=5), лечение 50 мг/кг CTX (середина, N=4), лечение 150 мг/кг CTX (справа, N=6). Средний ряд: лечение WST11 VTP при 100 мВт (слева, N=8) или 150 мВт (справа, N=7). Нижний ряд: лечение комбинацией 50 мг/кг CTX+VTP 100 мВт (слева, N=10), 150 мг/кг CTX+VTP 100 мВт (в середине, N=7), лечение 50 мг/кг CTX +VTP 150 мВт (справа, N=7).

На фиг.18 представлены кривые выживания Каплана-Мейера для мышей Balb/c, имеющих опухоли молочной железы 4T1-luc, трансплантированные п/к в заднюю конечность, и подвергнутых WST11 VTP отдельно с использованием низкой интенсивности света (100 мВт/см²) (18A, 18B) или высокой интенсивности света (150 мВт/см²) (18C, 18D) или в комбинации с введением однократной дозы CTX (CY) (150 или 50 мг/кг) за трое суток до VTP. Результаты лечения проиллюстрированы для всех подвергнутых лечению мышей (18A, 18C,18D) или для животных, у которых произошло необратимое полное устранение первичной опухоли и которые выжили без метастазов на 90 сутки (18D).

На фиг.19 представлено воздействие различных режимов лечения на процент животных с метастазами в легкое у мышей Balb/c, имеющих п/к опухоли молочной железы 4T1-luc в их задней конечности. (19A) Чашка Петри, демонстрирующая колонии 4T1-luc, развившиеся из клеток, выделенных из легких мыши Balb/c на 7 сутки после трансплантации клеток рака молочной железы 4T1-luc в заднюю конечность (день WST11 VTP). (19B) Процент свободных от метастазов животных после полного устранения первичной опухоли через 90 суток после лечения посредством: CTX (50 мг/кг)+VTP при низкой (N=10) или высокой (N=5) интенсивности света, или VTP отдельно при низкой (N=4) или высокой (N=5) интенсивности света.

На фиг.20 представлена инфильтрация Foxp3-положительных клеток (Treg-клетки) в опухоли 4T1-luc. Опухоли 4T1, трансплантированные в заднюю конечность мышей Balb/C, извлекали после достижения 30-60 мм³ в указанные моменты времени после введения CTX или солевого раствора, фиксировали в формалине и заливали парафином. Срезы получали и окрашивали на экспрессию Foxp3. Количество положительных клеток определяли с использованием программного обеспечения Fiji. На фиг.20A представлены репрезентативные изображения на 7 сутки после трансплантации опухоли и количественное определение для контроля без введения. На фиг.20B представлено репрезентативное изображение животных, которым вводили CTX. На фиг.2°C представлен процент Foxp3 (Treg-клеток) у животных без введения, животных, которым вводили CTX, через 24 часа после введения и животных, которым вводили CTX, через 72 часа после введения.

На фиг.21 представлен эффект введения CTX в низкой дозе за 3 суток до WST11 VTP на популяции T-клеток в дренирующих лимфатических узлах и селезенках мышей, имевших опухоли 4T1-luc. На фиг.21A представлено общее количество клеток в дренирующих лимфатических узлах (LN, слева) и селезенке (справа). LN и селезенки собирали в указанные моменты времени после WST11 VTP с (черный) и без (бесцветный) введения CTX согласно схеме лечения 4, как представлено на фиг.16. Клетки выделяли и окрашивали для проточной цитометрии антителами против CD4, CD8 и Foxp3. Общее количество клеток в селезенке подсчитывали после устранения эритроцитов. На фиг.21B представлен процент CD8+ (слева), CD4+ (в середине) и Foxp3 (Treg, справа) в дренирующем LN в различные моменты времени после WST11 VTP с (черный) или без CTX (бесцветный) за 3 суток до VTP (*p<0,001, **p<0,05). На фиг.21C представлен процент CD8+ (слева), CD4+ (в середине) и Foxp3 (Treg, справа) в селезенке через различные моменты времени после WST11 VTP с (черный) или без лечения CTX (бесцветный) за 3 суток до VTP (*p<0,001, **p<0,001, ***p<0,05).

На фиг.22 представлен эффект введения CTX в низкой дозе на популяции миелоидных клеток в опухолях и селезенках мышей, имеющих п/к опухоли 4T1-luc в задней конечности на 7 сутки после трансплантации (день VTP). Слева - опухоли; справа - селезенка.

На фиг.23A представлена схема лечения 5 для комбинированного лечения мышей, имеющих опухоли 4T1 в молочной железе с использованием WST11 VTP отдельно (на 7 сутки после трансплантации, когда опухоли достигают диаметра 5-7 мм); WST11 VTP в комбинации с периодическим введением CTX, начинающимся за 3 суток до VTP и проводимым еще три раза (черные стрелки) (CTX 2); WST11 VTP в комбинации с введением одной дозы CTX за 1 сутки до VTP WST11 (CTX 1) и еще три раза (красные стрелки); VTP в комбинации с периодическим введением Гемзара, начинающимся за двое суток (синий) или одни сутки (желтый) до VTP и продолжающимся с интервалами 5 суток еще 3 раза. Наблюдение за подвергнутыми лечению животными продолжали до 90 суток или до умерщвления животного вследствие опухолевой нагрузки. На фиг.23B представлены кривые Каплана-Мейера, которые иллюстрируют выживание животных, имеющих опухоли 4T1-luc в молочной железе после лечения с использованием различных протоколов комбинаций WST11 VTP c CTX или Гемзаром. На фиг.23C представлен процент мышей, имеющих опухоли 4T1 в их молочной железе, которые были полностью излечены (бесцветный), которые были излечены от первичной опухоли, но у которых развились метастазы (заштрихованный), и животных, у которых произошел как рецидив первичных опухолей, так и развитие метастазов (черный) через 90 суток после различных режимов лечения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В определенных вариантах осуществления изобретение относится к комбинированным способам терапии с использованием фотодинамической терапии (PDT) на основе бактериохлорофилла или нацеленной на сосуды PDT (VTP) и средств, модулирующих иммунные клетки, в частности, супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC), для устранения первичных опухолей и предупреждения распространения злокачественной опухоли.

В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что с использованием различных производных бактериохлорофилла, для которых обнаружено, что они являются эффективными в отношении устранения первичной опухоли, в комбинации со средствами, для которых обнаружено, что они обладают активностью против MDSC, достигается устранение первичной опухоли путем предупреждения прогрессирования метастатических опухолей, наиболее вероятно, путем устранения удаленных микрометастазов.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нетермическому устранению локализованных солидных опухолей и к устранению их отдаленных микрометастазов.

В одном аспекте настоящее изобретение относится средству против супрессорных клеток миелоидного происхождения (далее "средство против MDSC") и к производному бактериохлорофилла (далее "Bchl-D") для применения в комбинированной терапии злокачественной опухоли, где средство против MDSC и Bchl-D вводят последовательно и после введения Bchl-D следует фотодинамическая терапия (PDT).

Комбинированная терапия по изобретению обладает усиленным терапевтическим эффектом по сравнению с эффектом каждого из средства против MDSC или Bchl-D с последующей PDT отдельно. В определенных вариантах осуществления этот усиленный терапевтический эффект представляет собой синергичный терапевтический эффект, а именно, более сильный, чем суммарные терапевтические эффекты отдельных способов лечения.

Средство против MDSC для применения по изобретению может представлять собой, но не ограничиваться ими, гемцитабин, 5-фторурацил (5-FU), цисплатин, паклитаксел, циклофосфамид (CTX, CY), сунитиниб, ингибитор циклооксигеназы 2 (COX-2), такой как SC-58236 и SC-58125, бисфосфонат, такой как золедроновая кислота или аминобисфосфонат, такой как алендронат, полностью транс-ретиноевая кислота (ATRA), витамин D3, витамин A, KIT-специфическое антитело, производное нитроаспирина, синтетическое производное тритерпеноида, такое как бардоксолон метил (известный как CDDO-Me) и ингибитор фосфодиэстеразы-5 (PDE-5), такой как силденафил и таладафил.

В определенных вариантах осуществления средство против MDSC представляет собой гемцитабин или циклофосфамид.

В соответствии с изобретением можно использовать любой Bchl-D, для которого показано, что он устраняет опухоли.

В определенных вариантах осуществления Bchl-D для применения в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляет собой растворимое в воде анионное производное бактериохлорофилла, необязательно конъюгированное с RGD-содержащим пептидом или остатком RGD-пептидомиметика.

В определенных вариантах осуществления Bchl-D представляет собой анионный Bchl-D формулы I:

где

M представляет собой 2H или Pd;

R₁ представляет собой O-R₄ или -NHR₅, где R₄ представляет собой H, H⁺, группу аммония или одновалентный катион металла, такой как Na⁺ или K⁺_, и R₅ представляет собой RGD-содержащий пептид или остаток RGD-пептидомиметика;

R₂ представляет собой -O-C₁-C₆ алкил, предпочтительно метил;

R₃ представляет собой -NH-(CH₂)_n-SO₃^- R₆⁺, где n равен 2 или 3 и R₆⁺ представляет собой одновалентный катион металла, такой как Na⁺ или K⁺; и

его фармацевтически приемлемые соли и оптические изомеры.

В определенных вариантах осуществления анионный Bchl-D для применения в рамках изобретения имеет формулу I, где R₁ в положении 17³ представляет собой OR₄, а именно, он не конъюгирован с RGD-содержащим пептидом или остатком RGD-пептидомиметика (далее "неконъюгированный Bchl-D"), такой как, но не ограничиваясь ими, Bchl-D, обозначаемый в настоящем описании как WST11 и STL-7012.

WST11, производное родобактериохлорина палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амид, соль дикалия, был синтезирован в лаборатории проф. Avigdor Scherz, соавтора настоящего изобретения, в Weizmann Institute of Sciences (Rehovot, Israel), и он описан в WO 2004/045492. После успешных клинических испытаний WST11 недавно был одобрен для применения при лечении рака предстательной железы на ранней стадии.

STL-7012 представляет собой неметилированный Bchl-D 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоoэтил)амид, соль дикалия, (описанный в WO 2008/023378, формула в приложении ниже).

Другие анионные Bchl-D, которые можно использовать в соответствии с изобретением, включают следующие соединения, описанные в WO 2004/045492: палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(3-сульфопропил)амид, соль дикалия; 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амид, соль дикалия; 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(3-сульфопропил)амид, соль дикалия; и палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амид, соль калия.

Когда в рамках изобретения используют неконъюгированный Bchl-D, PDT представляет собой нацеленную на сосуды PDT (VTP) и локальную область, подлежащую обработке, облучают светом вскоре после завершения введения неконъюгированного Bchl-D. Этот период обычно составляет 0-30 мин, например, 0, 10, 15, 20, 25 или 30 мин.

В определенных вариантах осуществления Bchl-D для применения в рамках изобретения представляет собой Bchl-D формулы I, конъюгированный с RGD-содержащим пептидом или остатком RGD-пептидомиметика, где R₁ в положении 17³ представляет собой NH-R₅, а именно, он конъюгирован с C (далее "конъюгированный Bchl-D"). RGD-содержащий пептид или остаток RGD-пептидомиметика может представлять собой нециклический или циклический пептид.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления конъюгированный Bchl-D для применения в рамках изобретения конъюгирован с циклическим RGD-содержащим пептидом или остатком RGD-пептидомиметика. Примеры Bchl-D, конъюгированного с циклическим RGD-содержащим пептидом или остатком RGD-пептидомиметика для применения в рамках настоящего изобретения включают, но не ограничиваются ими, соединения, описанные в публикациях WO 2008/023378 и WO 2010/046900, такие как соединения Bchl-D, обозначаемые в настоящем описании как STL-6014, STL-6033, STL-6038, и STL-6068 (структуры представлены в Приложении ниже).

В определенных предпочтительных вариантах осуществления конъюгированный Bch-D представляет собой STL-6014, 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амид-17³-(циклоRGDfK)амид, соль калия, описанный в WO 2008/023378, где f указывает на D-Phe.

Другие конъюгированные Bchl-D, описанные в WO 2008/023378, которые можно использовать в соответствии с изобретением, включают, но не ограничиваются ими:

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амид-17³-(циклоRGDfK)амид, соль калия

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амид-17³-(циклоRADfK)амид, соль калия

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амид-17³-(циклоRGDf-N(Me)K)амид, соль калия.

Когда в соответствии с изобретением используют конъюгированный Bchl-D PDT является нацеленной на ткань и локальную область, подлежащую обработке, облучают светом через некоторый период времени, чтобы позволить накопление и оптимальную концентрацию конъюгированного Bchl-D в ткани-мишени. Этот период может составлять по меньшей мере 4 ч, предпочтительно 6 ч, после завершения введения конъюгированного Bchl-D.

Средство против MDSC и Bchl-D для применения в соответствии с изобретением вводят последовательно в соответствии с несколькими различными режимами. Как правило, в сеансе лечения для устранения первичной опухоли или метастаза обработка PDT или VTP включает однократное введение Bchl-D, за которым следует облучение светом локальной области, подлежащей обработке, и лечение против MDSC включает несколько введений средства против MDSC с различными заданными временными интервалами. Если необходимо, сеанс можно повторять один или несколько раз, если и когда позднее будут обнаружены новые метастазы.

В соответствии с одной схемой режима, средство против MDSC вводят один раз до обработки PDT или VTP и несколько раз после нее с определенными временными интервалами.

В соответствии с другой схемой режима, средство против MDSC вводят несколько раз с заданными временными интервалами после обработки PDT или VTP.

В определенных вариантах осуществления терапия против MDSC может включать от 4 до 12 введений или более средства против MDSC с заданными временными интервалами, составляющими 5-12 суток или более. Например, терапия против MDSC может включать 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 или более введений средства против MDSC с определенными временными интервалами, составляющими 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 суток или более.

Следует отметить, что эти числа основаны на экспериментах на животных, описанных в настоящем описании, и они не ограничивают лечение у человека. В зависимости от типа злокачественной опухоли, подвергаемой лечению, состояния иммунной системы пациента и реакции пациента на лечение, протокол лечения может быть модифицирован врачом путем изменения количества введений средства против MDSC и/или изменения количества суток в заданном временном интервале между введениями MDSC. Например, врач может решить сделать паузу в лечении и назначить в ходе лечения более длительный интервал, чем заданный интервал, а затем вернуть исходный протокол после этого перерыва. Например, если протокол лечения определяет интервал 5 суток между введениями средства против MDSC, врач может решить сделать перерыв из 10-20 суток или более после 2-го или 3-го введения, а затем вернуться к заданному интервалу 5 суток для последующих введений. Интервал перерыва всегда дольше, чем заданный интервал в протоколе.

В определенных вариантах осуществления средство против MDSC представляет собой гемцитабин и PDT проводят с Bchl-D STL-6014. 18. В других вариантах осуществления средство против MDSC представляет собой гемцитабин и VTP проводят с Bchl-D WST11.

В некоторых других вариантах осуществления средство против MDSC представляет собой циклофосфамид и VTP проводят с Bchl-D WST11.

В соответствии с определенными вариантами осуществления изобретения средство против MDSC вводят в низкой дозе, такой как доза, в 3 или 4 раза более низкая, чем общепринятая доза средства в общепринятой монохимиотерапии. Это соответствует концепции периодической химиотерапии, которая вовлекает химиотерапевтические средства в низкой дозе, вводимые по схеме частых регулярных введений без длительных перерывов и минимизирует тяжелую токсичность.

В соответствии с изобретением можно лечить несколько типов злокачественной опухоли, как первичные злокачественные солидные опухоли, так и метастазы, включая, но не ограничиваясь ими, меланому, почечноклеточный рак, рак толстого кишечника, молочной железы, легкого, предстательной железы, мочевого пузыря, головного мозга, аденокарциному поджелудочной железы или опухоли головы и шеи.

Кроме того, изобретение относится к средству против MDSC для применения в комбинированной терапией с Bchl-D для лечения злокачественной опухоли, где средство против MDSC и Bchl-D вводят последовательно и после введения Bchl-D следует фотодинамическая терапия (PDT).

Кроме того, изобретение относится к Bchl-D для применения в комбинированной терапии со средством против MDSC для лечения злокачественной опухоли, где средство против MDSC и Bchl-D вводят последовательно и после введения Bchl-D следует фотодинамическая терапия (PDT).

В обоих случаях комбинированная терапия имеет усиленный терапевтический эффект по сравнению с эффектом отдельно средства против MDSC или Bchl-D с последующей PDT. Этот усиленный терапевтический эффект может представлять собой синергический терапевтический эффект.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли посредством комбинированной терапии, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом: (i) терапевтически эффективного количества средства против супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC) (далее "средство против MDSC"); и (ii) терапевтически эффективного количества производного бактериохлорофилла (Bchl-D) с последующей фотодинамической терапией (PDT) (далее "Bchl-D PDT").

В определенных вариантах осуществления комбинированная терапия способа по изобретению обеспечивает усиленный терапевтический эффект по сравнению с эффектом средства против MDSC или Bchl-D PDT отдельно. Этот усиленный эффект может представлять собой синергический терапевтический эффект.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает синхронизацию введения химиотерапевтических средств, которые выполняют функцию средств против MDSC, с нацеленной на клетки/ткани фотодинамической терапией (PDT) или нацеленной на сосуды фотодинамической терапией (VTP) с использованием различных химических производных бактериохлорофилла (Bchl-D). Введение химиотерапевтического средства в низкой дозе подвергаемому лечению индивидууму несколько раз с заданными временными интервалами обеспечивает снижение нагрузки MDSC. В определенных вариантах осуществления после выбранного временного интервала после первого введения химиотерапевтического средства проводят PDT или VTP с использованием Bchl-D для устранения первичных опухолей или наблюдаемых метастазов. В случае некоторых средств периодическое применение (еженедельное применение низких доз) продолжают в течение нескольких недель после этого. Мониторинг эффективности лечения осуществляют посредством, но не ограничиваясь ими, наблюдения устранения первичной опухоли с использованием различных способов визуализации (например, МРТ, ультразвуковое исследование), гистологии (например, биопсия), уменьшения количеств MDSC в кровотоке, замедления или устранения роста метастазов и длительной выживаемости индивидуумов. Лечение можно повторять позднее в случаях, когда у пациента выявляют новые метастазы.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли, причем указанный способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом: (i) терапевтически эффективного количества средства против супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC) (далее "средство против MDSC"); и (ii) терапевтически эффективного количества производного бактериохлорофилла (Bchl-D) с последующей фотодинамической терапией (PDT) (далее "Bchl-D PDT") или нацеленной на сосуды PDT (далее "Bchl-D VTP") для обеспечения комбинированной терапии, имеющей усиленный терапевтический эффект по сравнению с эффектом средства против MDSC или Bchl-D PDT отдельно.

Термины "лечащий" и "лечение" или "лечить", как используют в рамках изобретения, относится к любому типу лечения, которое обеспечивает пользу для пациента, страдающего злокачественной опухоли, включая улучшение состояния пациента (например, одного или нескольких симптомов), замедление прогрессирования состояния, продление выживания и т.д.

Термин "терапевтически эффективное количество", как используют в рамках изобретения для средства против MDSC, относится к количеству, которое является терапевтически эффективным для лечения злокачественной опухоли, как определено в настоящем описании выше, когда его используют в комбинированной терапии и вводят повторяющимися дозами по изобретению. Термин "терапевтически эффективное количество", как используют в рамках изобретения для Bchl-D, относится к его способности вызывать устранение опухоли или метастазов после проведения PDT или VTP.

В случае рецидива опухоли, например, в форме новых метастазов, иммуномодулирующую Bchl-D PDT или VTP можно повторять, поскольку новые метастазы могут указывать на возникновение новых микрометастазов отличающегося клона по сравнению с первичной опухолью.

Исследования, описанные в настоящем описании и на чертежах, показывают, что предложенная комбинация двух способов лечения имеет синергическое воздействие, что приводит к устранение первичной опухоли, сопровождающемуся регрессией и устранением микрометастазов и последующего образования метастазов у 40-50% животных, имеющих агрессивные и метастазирующие злокачественные опухоли. Эти исследования и разработанные протоколы можно прямо переводить в клинику.

Далее изобретение иллюстрируется следующими неограничивающими примерами.

ПРИМЕРЫ

Материалы и способы

Материалы

(i) Производные бактериохлорофилла - Производные Bchl и их конъюгаты с RGD были предоставлены Steba Biotech (Rehovot, Israel). STL-6014 был предоставлен в качестве соли аммония в порошковой форме, конвертирующейся в соль K+ путем растворения порошка в DDW (1 мг/мл), pH доводили до 8 добавлением 1 Н KOH, полученный раствор замораживали в жидком азоте и лиофилизировали с получением STL-6014, соли K⁺. Рабочий раствор получали растворением STL-6014, соли K^+, в 5% растворе маннита (1 мг/мл), pH раствора доводили до 8 добавлением трис-буфера (0,15%) в 5% манните, раствор распределяли аликвотами в несколько пробирок, исходя из требований эксперимента, замораживали и лиофилизировали с получением составленного STL-6014, соли K⁺. Концентрацию подтверждали спектрофотометрическим измерением. STL-7012 был предоставлен в качестве соли дикалия. Рабочий раствор получали растворением STL-7012, соли K⁺, в 5% растворе маннита (1 мг/мл). Доведение pH, приготовление аликвот и подтверждение концентрации проводили, как и для STL-6014. WST11 был предоставлен в качестве порошка, и его держали в темноте при -20°C. Исходный раствор получали растворением WST11 в DDW, содержавшем 5% глюкозу и 0,67% маннит, распределяли аликвотами и лиофилизировали. Рабочий раствор восстанавливали посредством DDW и концентрацию раствора подтверждали спектрофотометрически. Альтернативно клинический WST11 (партия: P00611 и 10-130611) был предоставлен в качестве лиофилизированного состава. Материал растворяли в 5% декстрозе, распределяли аликвотами и хранили при -20°C. В день обработки аликвоту размораживали, фильтровали и концентрацию раствора подтверждали спектрофотометрически.

(ii) Приготовление и хранение химиотерапевтических средств - Гемцитабин (GEM, Gemzar^®, Lilly) приобретали в местной аптеке в качестве порошка, растворяли в солевом растворе до концентрации 38 мг/мл, распределяли аликвотами и хранили при -20°C. Аликвоты размораживали, разбавляли солевым раствором до требуемой концентрации и использовали в тот же день в дозе 75 мг/кг. Циклофосфамид (CTX, Endoxan^®, Baxter Oncology Gmbh, Germany) приобретали в местной аптеке. Исходный раствор 20 мг/мл получали растворением в 0,9% NaCl, распределяли аликвотами и хранили при -20°C. Аликвоты размораживали, при необходимости разбавляли солевым раствором до желаемой концентрации и использовали в тот же день в указанных дозах.

(iii) Клеточные линии мышей - Меченная люциферазой (luc) клеточная линия молочной железы 4T1 (4T1-Luc) была любезным подарком Dr. Zvi Granot (Faculty of Medicine, The Hebrew University of Jerusalem, Israel); клеточная линия меланомы B16-F10 была приобретена в American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA); клеточная линия мочевого пузыря MB49 была любезным подарком James Allison (MSKCC, New York, USA) и luc-меченная клеточная линия MB49 была получена с использованием конструкции вирус стволовых клеток мышей (MSCV)-пуромицин-luc-GFP (любезно предоставленной Dr. Emily Cheng, Human Oncology and Pathogenesis Program, MSKCC). Клетки 4T1 и MB49 поддерживали в среде DMEM и клетки B16-F10 поддерживали в среде RPMI, дополненной 1 ммоль/л пирувата натрия, 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FCS), 250 мкг/мл гигромицина, 0,06 мг/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина. Клетки выращивали в качестве монослоя при 37°C в увлажненной атмосфере (5% CO₂, 95% воздуха).

(iv) Модели опухолей на мышах - Самкам мышей Balb/c (в возрасте 6-8 недель) пересаживали либо подкожно (п/к) в правую заднюю конечность, либо ортотопно 1×10⁶ клеток 4T1, суспендированных в 50 или 100 мкл PBS. Для исследования с повторной нагрузкой ортотопно трансплантировали 2×10⁵ клеток 4T1. Для модели рака мочевого пузыря 5×10⁴ клеток клеточной линии MB49 или MB49-люцифераза инъецировали п/к в правый бок самцов мышей C57B/6 (в возрасте 7-8 недель, Taconic, Hudson, NY) за 15 суток до обработки VTP. Для исследования эффективности VTP у мышей с иммунодефицитом то же количество клеток MB49 инъецировали в бок самцов мышей Rag^-/- C57B/6 или C57B/6 (возраст 7-8 недель, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Для билатеральной модели с клетками MB49 животным вводили 5×10⁴ клеток MB49 в правый бок и 5×10⁴ клеток в левый бок на сутки -15 и +1, соответственно. Все методики эксперимента были одобрены комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных в Weizmann Institute of Science (Rehovot, Israel) и The Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC, New York, USA).

Способы

(v) Флуоресцентная визуализация всего организма (PDT studies): После внутривенной (в/в) инъекции 7,5 мг/кг STL-6014 или STL-7012 получали изображения флуоресценции в ближней инфракрасной области всего организма с опухолевыми тканями и нормальными органами с использованием системы In Vivo Optical Imaging System (IVIS®Spectrum, Caliper LifeScience., Alameda, CA) с фильтрами 847/875 нм для возбуждения и испускания, соответственно, с временем интеграции 1 секунда. Визуализацию всего организма с трансфицированными люциферазой опухолями и метастазами проводили через пять минут после внутрибрюшинной (в/б) инъекции 75 мг Кг^-1 D-люциферина соответствующими наборами фильтров.

(vi) Протокол лечения PDT: Клетки 4T1-Luc трансплантировали в молочную железу мышей Balb/c. Когда первичные опухоли достигали ~50 мм³, мышам в/в инъецировали 7,5 мг/кг STL-6014, и их оставляли в условиях тусклого света на 6 ч, после чего площадь 1 см², включающую опухоль, облучали светом с использованием лазера 753 нм, подаваемым через фронтальные оптические волокна (Medlight SA, Switzerland) при 200 мВт/см². В ходе первых двух дней после обработки мышам проводили обезболивание (2,5 мг/кг флунексина один раз в сутки). Устранение первичных опухолей оценивали каждые 7 суток путем визуализации опосредуемого люциферазой опухоли биолюминесцентного сигнала с использованием IVIS. Мышей умерщвляли (в соответствии с руководством Weizmann Institute of Science), когда опухоли достигали диаметра 15 мм или когда у мыши развивались метастазы, определяемые по флуоресценции всего организма IVIS.

(vii) Протокол лечения VTP: Для обработки п/к опухоли: имеющих опухоль мышей подвергали анестезии посредством в/б инъекции смеси раствора кетамин/ксилазин, 100 мг/10 мг на кг массы тела, соответственно. Затем вводили WST11 в дозе 9 мг/кг посредством в/в инфузии с постоянной скоростью в течение 5 мин в хвостовую вену. Облучение светом на уровне 100 или 150 мВт/см² в течение 10 мин начинали сразу после завершения инфузии с использованием диодного лазера мощностью 4 Вт, 755 нм (Ceramoptec, Germany), оборудованного фронтальным оптическим диффузором. Мышь клали на левый бок для экспонирования опухоли и накрывали непрозрачным материалом для защиты нормальных тканей. Для обработки опухоли молочной железы: мышам проводили анестезию, как описано выше. Доза WST11 составляла 9 мг/кг, вводимые посредством инфузии в течение 5 мин. Мышь помещали на бок, опухоль приподнимали с использование зажима для отделения ее от организма и животное защищали черным материалом для предотвращения повреждения жизненно-важных органов. Облучение светом на уровне 200 мВт/см² в течение 15 мин начинали сразу после завершения инфузии с использованием диодного лазера мощностью 4 Вт, 755 нм (Modulight, Finland), оборудованного фронтальным оптическим диффузором.

(viii) Комбинированная терапия, включающая PDT совместно с Gemzar™ (GEM) в низкой дозе: через шесть суток после трансплантации клеток 4T1-luc (когда первичные опухоли достигали ~50 мм³) мышам в/в инъецировали 7,5 мг/кг STL-6014. Через шесть часов после введения лекарственного средства опухоль облучали светом при 753 нм (200 мВт/см²) в течение 15 мин. Применяли два протокола совместного лечения с GEM: (1) 75 мг/кг GEM (растворенного в 100 мкл солевого раствора), введенные в/б за 2 суток до PDT, через одни сутки после и каждые 5 суток после этого до 33 суток, или (2) доза 75 мг/кг GEM, введенная через одни сутки после PDT и каждые 5 суток после этого до 33 суток. Наблюдение за прогрессированием/регрессией метастазов проводили вплоть до 120 суток посредством визуализации всего организма по биолюминесценции люциферазы.

(ix) Комбинированная терапия, содержащая VTP и GEM в низкой дозе: GEM вводили в/б в дозе 75 мг/кг. Использованные режимы лечения были следующими: (i) начиная на сутки (-1) с тремя последующими дозами на 1, 6 и 11 сутки после VTP; (ii) начиная на сутки (-2) с тремя дозами на 3, 8 и 13 сутки. Альтернативно 50 мг/кг по клинической схеме 3-недельного курса с отдыхом на 3-ей неделе или 120 мг/кг по схеме BIW (два раза в неделю), как указано для каждого эксперимента, начиная с первой дозы за 3 суток до обработки VTP.

(x) Комбинированная терапия, включающая VTP и циклофосфамид (CTX): Для лечения п/к опухоли CTX вводили в/б в однократной дозе 150 мг/кг или 50 мг/кг (для последней из них исходный раствор разбавляли 1:3 свежим 0,9% NaCl для сохранения объема) за трое суток до VTP. В контрольных группах вводили 0,9% NaCl. Для лечения опухолей молочной железы вводили 50 мг/кг в соответствии со следующими режимами: (i) начиная на сутки (-1) с тремя последующими дозами на 1, 6 и 11 сутки после VTP; (ii) начиная на сутки (-3) с тремя дозами на 3, 10 и 17 сутки.

(xi) Наблюдение in vivo исхода VTP в отношении первичной опухоли и метастазов в легкое: локальный ответ опухоли оценивали посредством биолюминесцентной визуализации (BLI) и измерений с использованием толщиномера. Объем опухоли вычисляли, как опубликовано ранее (Preise et al, 2003). Для оценки BLI имеющих опухоль мышей подвергали анестезии и проводили им в/б инъекцию люциферина (1,2 мкг/мышь, Regis, USA). Затем мышей помещали в систему Xenogen IVIS Spectrum Imaging System (Caliper LifeSciences, MA, USA) и получали изображения в течение 60 с после накопления в течение ~10 мин. Для п/к опухолей мышей помещали на бок для визуализации первичных опухолей, а затем на спину для оценки метастазов. Положение на спине использовали, чтобы обеспечить визуализацию как первичной опухоли, так и метастазов в легкое в модели с молочной железой. Ранее умерщвление проводили, когда нагрузка первичной опухолью достигала более 15 мм в наибольшем диаметре или когда обнаруживали метастазы для предотвращения страдания и смерти животного.

(xii) Гистология: мышей умерщвляли в соответствии с руководством комитета по содержанию и использованию лабораторных животных Weizmann Institute of Science (IACUC, Rehovot, Israel). Ткани извлекали и фиксировали в 4%/10% забуференном формалине в течение 48 ч. Затем образцы заключали в парафин, нарезали срезами и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) в отделении гистологического исследования по стандартной методике. Иммунное окрашивание антителами против Foxp3, CD4, CD8, CD11b и Ki67 проводили в Memorial Sloan Kettering посредством автоматизированной процедуры.

(xiii) Окрашивание Ly6G (исследования PDT): Мышей, имевших ортотопные опухоли 4T1-Luc в двух областях (жировая подушка правой и левой молочной железы), подвергали PDT только с одной стороны в комбинации со вторым протоколом лечения GEM. Опухоли извлекали через 24 ч, 3 суток и 3 недели после PDT, и фиксировали и окрашивали на Ly6G. Изображения получали для автономного анализа с использованием сканнера предметных стекол.

(xiv) Проточная цитометрия (FACS-анализ): Селезенку извлекали из гуманным образом умерщвленных животных и просеивали через сито с размером ячеек 70 мкм. Эритроциты лизировали лизирующим раствором хлорида аммония (ACK) и клетки подсчитывали и разбавляли для окрашивания. Лимфатические узлы измельчали в PBS, промывали и клетки разбавляли для окрашивания. Опухоли разрезали на небольшие фрагменты и инкубировали в течение 30 мин при 37°C при встряхивании в смеси 2,5 мг коллагеназы II, 2,5 мг коллагеназы IV и 0,5 мг ДНК-азы на 1 мл PBS, содержавшего 1% BSA. Суспензию клеток (опухоли или селезенки) пропускали под давлением через 70-мкм фильтры, промывали два раза буфером для FACS и инкубировали (если указано) в течение 30 мин на льду с фиксирующим красителем жизнеспособности eFluor 450, (eBioscience, San Diego, CA), разбавленным PBS (1:1000). 1-5×10⁶ клеток суспендировали в 100 мкл PBS и инкубировали в течение 15 мин при 4°C с антителом крысы против CD16/CD32 мыши (0,5 мкг, eBioscience, San Diego, CA) для предупреждения неспецифического связывания антител. В соответствии с различными экспериментами клетки затем инкубировали в течение 30 мин при RT с флуоресцентными антителами, включающими percp-cy5.5/APC-Cy7-CD11b, PE/PerCP-Cy5-Ly6G, PE-cy7-Ly6C, APC-F4/80, Alexa488/PE-CD11c, eVolve655/v450-MHCII, percp-cy5,5-CD3, APC/v450-CD4, Alexa488-CD8, PE-cy7-Foxp3, CD4-APC, Alexa488/PerCP-Cy5/PE-Texas Red-CD8 и PE/APC-Foxp3, Alexa 700/FITC-CD45, FITC-Ki67, APC-Cy7-CD25, PE Texas Red-Granzyme B, PE-CD62L, PE-Cy7-CD44 и APC-CD86 (антитела приобретали от eBioScience (San Diego, CA и from BioLegend, San Diego, CA). Получение данных проводили с использованием специализированного проточного цитометра LSRII (BD Bioscience, San Jose, CA) и анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).

(xv) Выделение метастатических клеток и анализ образования колоний: Мышам имплантировали клетки 4T1-luc. Через семь суток легкие извлекали из подвергнутых анестезии мышей после перфузии стерильным ледяным PBS. После извлечения мышей умерщвляли. Легкие измельчали в PBS, промывали и просеивали через сито калибра 100 мкм. Затем ткань расщепляли посредством 5 мг/мл коллагеназы A в течение 45 мин в 37°C, промывали и ресуспендировали в теплой полной среде. Суспензию пропускали через 70-мкм сито и высевали в инкубатор для культивирования тканей. Через семь дней определяли увеличение биолюминесценции культуры с использованием системы визуализации IVIS после добавления люциферина.

(xvi) Статистический анализ: Данные анализировали с использованием двухстороннего непарного t-критерия Стьюдента в Microsoft Excel или двухстороннего теста ANOVA (GraphPad, San Diego, CA, USA). Значения p менее 0,05 считали статистически значимыми. Кривые выживания сравнивали с использованием логарифмического рангового критерия (GraphPad Prism 6, San Diego, CA, USA).

Пример 1. Фармакокинетика и захват STL-6014 первичной опухолью и метастазами у мышей, имеющих опухоль 4T1

В предварительном эксперименте самкам мышей Balb/c, имевшим ортотопные опухоли молочной железы 4T1-Luc, внутривенно инъецировали STL-6014 (7,5 мг/кг) или STL-7012 (9,5 мг/кг). Изображения флуоресценции в ближней инфракрасной области (NIR) продемонстрировали селективное накопление STL-6014 в опухоли (фиг.1A, верхний ряд). Опухоль становилась заметной через ~2 ч после введения, но, тем не менее, довольно сильные сигналы наблюдали в органах выведения (например, мочевой пузырь). На следующий день после введения происходило значительное накопление STL-6014 в опухоли (фиг.1B, верхний ряд), относительно окружающих тканей со значительно более низкими уровнями в брюшных органах выведения. STL-7012 не накапливался в опухоли (фиг.1A, нижняя панель) и выводился через печень в пределах нескольких часов после инъекции (фиг.1A, нижняя панель). Указанное было справедливым для WST11 (данные не представлены). Накопление в опухоли и метастазах в легкое, сопровождающееся накоплением в органах выведения, продемонстрировано на фиг.1B. Верхняя панель - биолюминесценция различных тканей у имеющих опухоль мышей; нижняя панель - флуоресценция STL-6014 в этих органах.

Пример 2. Лечение имеющих 4T1 животных STL-6014 и гемзаром по схеме 1

Мышам Balb/c инокулировали 1×10⁶ клеток 4T1-Luc в жировую подушку молочной железы. Через 7 суток после трансплантации, когда опухоли достигали диаметра 5-7 мм, мышей, имевших 4T1-Luc, можно было подвергать одной из нескольких возможностей лечения, как описано в схеме лечения 1 (фиг.2A) следующим образом:

(i) При использовании фотодинамической терапии (PDT) в качестве единственного лекарственного средства животным проводили в/в болюсную инъекцию (3 мин) 7,5 мг/кг STL-6014. Через 6 ч после инъекции опухоль облучали светом 753 нм при 200 мВт/см² (Modulight Inc., Finland) в течение 10 мин.

(ii) При использовании гемцитабина (Гемзар) в качестве единственного подхода терапии имеющим опухоль животным в/б вводили 75 мг/кг Гемзара, начиная либо на 5 сутки (синий), либо на 8 сутки (оранжевый) после трансплантации опухоли а затем еще 6 раз с интервалами 5 суток, как описано в схеме лечения 1.

(iii) При комбинированном подходе к лечению, животным либо (a) вводили в/б 75 мг/кг Гемзара на 5 сутки с последующей STL-6014 PDT на 7 сутки с введением Гемзара еще 6 раз; либо (b) STL-6014 PDT на 7 сутки, затем Гемзар на 8 сутки с введением Гемзара еще 6 раз. Мониторинг прогрессирования и распространения опухоли проводили один раз в неделю до 120 суток или до умерщвления животного вследствие опухолевой нагрузки с использованием биолюминесцентного сигнала люциферина, регистрируемого посредством IVIS (Oxygen).

Пример 3. Ответ первичных опухолей у животных, имеющих 4T1, на лечение STL-6014 PDT и Гемзаром

Balb/c, имеющих опухоль 4T1, подразделяли на 5 групп: (1) без лечения (контроль); (2) лечение STL-6014 PDT; (3) лечение периодическим введением Гемзара: (4) лечение STL-6014 PDT и периодическим введением Гемзара, начиная через 1 сутки после PDT; и (5) лечение посредством STL-6014 PDT и периодического введения Гемзара, начиная за 2 суток до PDT. На фиг.3 представлены ответы первичных опухолей на 7 сутки (белый) и 30 сутки (черный) после STL-6014 PDT отдельно или в комбинации с Гемзаром, предоставленным согласно одному из двух режимов лечения, описанных в схеме лечения 1. Отсутствие первичной опухоли наблюдали у 70-80% мышей, которым проводили STL-6014 PDT отдельно или в комбинации с Гемзаром на 7 сутки после лечения. Однако на 30 сутки после лечения 82% животных, которых лечили только STL-6014 PDT, имели повторный рост первичной опухоли по сравнению с только 30-40% в группе комбинированного лечения STL-6014 PDT+Гемзар. Ни у одного из контрольных животных (без лечения или лечение только Гемзаром) не было выявлено излечения первичной опухоли (0%).

Пример 4. Выживание мышей, имеющих опухоль 4T1, при лечении STL-6014 PDT и Гемзаром

На фиг.4 представлены кривые выживания Каплана-Мейера на протяжении наблюдения в течение 120 суток мышей, имеющих 4T1-Luc, подвергнутых различным режимам лечения, и контролей. Лечение STL-6014 PDT (N=29) не продемонстрировало никаких значительных отличий в выживании по сравнению с контрольными мышами (N=18). Наблюдали более длительное выживание у мышей, которых лечили Гемзаром, но без излечения первичной опухоли (N=11). Тридцать два процента животных, которым трансплантировали 4T1, выжили после комбинированного лечения STL-6014 PDT и Гемзаром, вводимым через одни сутки после PDT (N=19), в то время как у 50% мышей произошло излечение (выжили в течение 120 суток) после введения Гемзара за 2 суток до STL-6014 PDT (N=20).

Пример 5. Ответ микрометастазов в легком на лечение STL-6014 PDT и Гемзаром

На фиг.5A-B представлены две круговые диаграммы, на которых показан процент животных, имеющих метастазы 4T1 в легком после различных режимов лечения STL-6014 PDT в комбинации с Гемзаром, в день умерщвления животных. Семьдесят девять процентов мышей (N=20), которым проводили STL-6014 PDT в комбинации с Гемзаром, вводимым за 2 суток до PDT, были свободными от метастазов (5B), в то время как 61% (N=19) животных, которых лечили посредством STL-6014 PDT с Гемзаром, вводимым через 1 сутки после PDT, были свободными от метастазов (5A). Это различие является статистически значимым (p<0,01), демонстрируя возможное преимущество введение Гемзара до PDT.

Пример 6. Выживание мышей, имеющих 4T1, которых лечили STL-6014 PDT и Гемзаром

На фиг.6B представлено выживание отдельных животных, которых повторно подвергали нагрузке посредством второй трансплантации 2×10⁵ клеток 4T1 через 120 суток после полного излечения от первой трансплантированной опухоли, на которое указывало отсутствие биолюминесценции клеток 4T1 через 120 суток после первой трансплантации. Для сравнения на фиг.6A представлено выживание наивных мышей, которым трансплантировали 2×10⁵ клеток 4T1 впервые. У шестидесяти семи процентов произошло отторжение опухоли 4T1 (желто-зеленая кривая, N=10) и у 5 из 15 рост опухоли был замедленным, в то время как у 10 из 10 наивных мышей, которым проводили нагрузку в то же время, развились опухоли. Эти данные демонстрируют, что комбинированное лечение PD/Гемзаром обеспечивает длительный адаптивный иммунитет у подвергнутых лечению животных.

Пример 7. Схема 2 для лечения рака мочевого пузыря MB49 в модели на мышах посредством WST11 VTP и Гемзара

На фиг.7 представлена вторая схема лечения, использованная для мышей Balb/C, имеющих MB49 (мышиный рак мочевого пузыря), когда опухоль достигала диаметра приблизительно 4-7 мм через 15 сутки после трансплантации 2×10⁵ клеток MB49 в правую заднюю конечность. Схема лечения включает применение WST11 VTP отдельно, или в/б введение 50 мг/кг Гемзара на 12 сутки после трансплантации, за которым следовали курсы из 3 недель введения Гемзара на 1 и 7 сутки каждой недели, за которыми следовало отсутствие введения на 4 неделе каждого месяца. Всего животным проводили 12 введений Гемзара. При лечении посредством VTP 9,0 мг/кг WST11 вводили посредством в/в инфузии в течение 5 минут, за которой следовало облучение светом в течение 10 минут при 753 нм с использованием лазера Modulight при 120 мВт/см².

Пример 8. Ответ мышей, которым были трансплантированы опухоли MB49, на различные режимы лечения WST11 VTP и Гемзаром

На фиг.8A-D представлен ответ у мышей Balb/C, которым были трансплантированы опухоли MB49, на различные режимы лечения, описанные на фиг.7. На фиг.8A-8B представлен средний и индивидуальный рост опухоли MB49, соответственно, в задней конечности мыши после лечения описанной выше комбинацией WST11 VTP/Гемзар (планки погрешностей, SEM контроль против комбинированная терапия, p<0,0001, Гемзар против комбинированная терапия, p<0,0001, VTP против комбинированная терапия, p<0,0005 (двухсторонний тест Anova)). Всех контрольных животных необходимо было умертвить вследствие опухолевой нагрузки через 20-25 суток после трансплантации. Режимы лечения Гемзаром или WST11 VTP отдельно немного замедляли прогрессирование опухоли и приводили к излечению 0% (Гемзар против комбинированной терапии, p<0,0001) и 16% (VTP против комбинированной терапии, p<0,001), соответственно. Однако комбинированное лечение продемонстрировало 65% свободных от заболевания животных через 100 дней после трансплантации опухоли. На фиг.8C представлено предупреждение отдаленных метастазов в легкое (визуализация, A103+A112) на 25 сутки в ответ на отсутствие лечения (контроль) и лечение с использованием различных режимов лечения (Гемзар, VTP или VTP+Гемзар), мониторинг которого проводили раз в неделю посредством визуализации биолюминесценции IVIS. Репрезентативные изображения люминесценции для животных из четырех групп лечения представлены на нижней панели, и количественное определение средней интенсивности люминесценции из областей метастатических опухолей через 25 суток после VTP представлено на верхней панели. Повышение общей выживаемости в группе комбинации, показанное на фиг.8D, был статистически значимым (VTP против комбинированной терапии, p<0,001; Гемзар против комбинированной терапии, p<0,0001). Общую выживаемость (OS) наносили на кривую Каплана-Мейера, и логарифмический ранговый критерий использовали для статистического анализа. Мышей умерщвляли, когда опухоли конечностей достигали 2500 мм³, и учитывали как умерших. Все данные были объединены из двух отдельных экспериментов.

Пример 9. Развитие адаптивного противоопухолевого иммунитета, отражаемое развитием метастазов и успехом при повторной нагрузке у животных, которых лечили WST11 VTP и Гемзаром

Модель на животных и схему лечения, предназначенные для исследования эволюции системного противоопухолевого ответа у животных, имеющих клетки Mb49, после различных режимов проведения WST11 VTP с введением Гемзара и без него тестировали, как проиллюстрировано на фиг.9. На фиг.9A представлена схема лечения 3. VTP проводили, когда на 15 сутки после трансплантации опухоли достигали размера 4-7 мм в диаметре (0 сутки). Мышам проводили нагрузку на следующий день после VTP второй инъекцией MB49 в левую заднюю конечность. Гемзар вводили каждую неделю (курс из 3 недель, на 3-ей неделе отдых) в дозе 50 мг/кг в группы Гемзара и комбинации в течение вплоть до 90 суток, начиная за 3 суток до VTP. Фиг.9B относится к росту второй опухоли у индивидуальных животных в билатеральной модели. На четырех панелях показан рост опухоли у мышей без лечения (контроль) или мышей, которых лечили Гемзаром, WST11 VTP или их комбинацией, демонстрирующий, что 71% мышей в группе комбинированного лечения оставались свободными от опухоли. На фиг.9C представлены кривые выживания Каплана-Мейера для мышей, которым на 125 сутки после обработки VTP (последнюю дозу Гемзара вводили на 90 сутки) проводили повторную нагрузку посредством инъекции через хвостовую вену клеток клеточной линии MB49. Все из не подвергнутых наивных мышей умерли к 35 суткам после инъекции клеток MB49, в то время как у 70% мышей, выживших после WST11 VTP или WST11 VTP/Гемзар, произошло отторжение опухолевых клеток.

Пример 10. Влияние дефицита T- и B-клеток на ответ имеющих опухоль мышей на лечение WST11 VTP и Гемзаром

На фиг.10 показано, что нехватка популяций T-клеток и B-клеток снижает терапевтический эффект WST11 VTP, Гемзара и их комбинации у мышей Balb/C, имеющих опухоль MB49. Эффект иммунной системы хозяина на эффективность лечения оценивали с использованием иммунодефицитных мышей (Nude) Rag1 KO (KO, пунктирная линия), соответствующих генетическому фону мышей WT C57B/6 (WT, сплошная линия). Кривые Каплана-Мейера на фиг.10A демонстрируют статистически значимое снижение общей выживаемости иммунодефицитных мышей по сравнению с мышами WT, которых лечили посредством WST11 VTP (WT n=19, Rag1KO n=22, p<0,0001). Сходные отличия были обнаружены (фиг.10B) в общей выживаемости мышей, которых лечили только гемцитабином (Гемзар) (WT n=10, Rag1KO n=10, p<0,05). Между тем, в этом эксперименте произошло излечение 30% иммунокомпетентных мышей посредством комбинированного лечения (фиг.10C). Не произошло излечения иммунодефицитных мышей, которых лечили комбинацией WST11 VTP и Гемзара в дозе 120 мг/кг или 60 мг/кг (p<0,24) (WT n=10, Rag1KO n=7, p<0,005). Эффект всех трех режимов лечения был уменьшен у мышей Rag1 KO, что указывает на то, что популяция T-клеток опосредует терапевтический эффект VTP, Гемзара или их комбинации.

В примерах 11-18 описан врожденный и иммунный ответ имеющих опухоль животных на различные протоколы лечения, описанные в настоящей заявке.

Пример 11: Популяция иммунных клеток в селезенке мышей Balb/C без лечения

FACS-анализ популяций иммунных клеток в селезенке контрольных (без лечения) имеющих 4T1 мышей проводили, как описано в разделе "Материалы и способы" выше. Результаты представлены на фиг.11: (A) Гранулоцитарные/моноцитарные супрессорные клетки миелоидного происхождения (G/M-MDSC) и нейтрофилы; (B) дендритные клетки (DC); (C) ассоциированные с опухолью макрофаги (TAM); (D) CD4 и CD8 T-клетки; (E) T-регуляторные клетки (Treg).

Пример 12: Влияние лечения STL-6014-PDT в комбинации с введением Гемзара на профиль иммунных клеток в селезенке мышей, имеющих 4T1.

На фиг. 12 представлено влияние лечения STL-6014-PDT в комбинации с введением Гемзара на профиль иммунных клеток в селезенке мышей, имеющих 4T1. Профиль популяций клеток селезенки оценивали после 3 режимов лечения: STL-6014 PDT, STL-6014 PDT с Гемзаром (начиная за 2 суток до PDT) и Гемзар отдельно. Подвергнутые лечению группы сравнивали с имеющими опухоль контролями. Для анализа были взяты животные с хорошими ответами на лечение (на основании устранения первичной опухоли через 1, 2 и 3 недели после лечения). Спленоциты окрашивали в отношении маркеров врожденного и адаптивного иммунитета и исследовали с использованием проточного цитометра LSRII (BD Bioscience, San Jose, CA) и анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). В первую неделю после лечения, как PDT, так и Гемзар отдельно значительно снижали процент G-MDSC/нейтрофилов и M-MDSC по сравнению с контролем. Однако эффект комбинированного режима лечения оказался значительно лучшим. На второй неделе после лечения воздействие Гемзара отдельно относительно контроля снижалось, в то время как эффект PDT был значительным и эффект комбинированной терапии был очень сильным. На третьей неделе MDSC были ослабленными только у животных в группе комбинированного лечения по сравнению с контролем. Длительность эффекта комбинированной терапии на профиль MDSC хорошо коррелирует с временем, требуемым для развития адаптивного иммунитета (Fisher et al., 2017; Nowak et al., 2003; Pitt et al., 2016). В дополнение, комбинированное лечение значительно повышало популяцию дендритных клеток по сравнению с контролем, в частности, в первые две недели, и популяцию CD8-клеток в течение трех недель после лечения. Наблюдали значительно меньшие эффекты в отношении популяций Treg для всех трех режимов лечения по сравнению с контролями.

Пример 13: Влияние WST11 VTP и Гемзара на селезенку подвергнутых лечению животных

На фиг.13 приведено изменение массы селезенки у животных, которым ортотопно трансплантировали злокачественные клетки 4T1 и без лечения (контроль) с имеющими опухоль животными, которым проводили лечение Гемзаром, лечение WST11 VTP или их комбинацией. Шестикратное увеличение массы селезенки, обнаруженное у животных без лечения, полностью предотвращалось VTP и VTP+Гемзар и практически полностью предотвращалось Гемзаром отдельно. В совокупности с данными, представленными на фиг.11 и 12, масса селезенки увеличивается в основном вследствие увеличения популяции гранулоцитов и моноцитов, которая значительно снижается лечением VTP+Гемзар.

Пример 14: Влияние WST11 VTP в комбинации с введением Гемзара на эволюцию противоопухолевого врожденного иммунитета у мышей, имеющих опухоль 49MB

Врожденный иммунный ответ на различные терапевтические режимы у мышей, имеющих опухоли MB49, представлен на фиг.14. (A) Иммуногистохимическое (IHC) окрашивание на CD11b+ в селезенке демонстрирует, что как VTP, так и гемцитабин, отдельно истощают CD11b+ клетки в селезенке, однако комбинированное лечение имеет значительно больший эффект. (B) FACS-анализ спленоцитов у подвергнутых лечению животных демонстрирует, что через 9 суток после лечения нейтрофилы/G-MDSC и моноциты/M-MDSC были истощены системно посредством лечения WST11 VTP отдельно или гемцитабином отдельно. В данном случае комбинация не снижала популяцию миелоидных клеток, что указывает на то, что VTP и Гемзар могут быть нацелены на одну клеточную популяцию. Схема дозирования Гемзара для проточно-цитометрического анализа представляла собой сутки -3, 1, 4, 7 либо в низкой дозе (60 мг/кг), либо в высокой дозе (120 мг/кг). Важно, что в моделях на мышах 4T1 комбинированное лечение имело более выраженный эффект, чем эффект каждого из отдельных способов лечения.

Пример 15: Влияние WST11 VTP в комбинации с введением Гемзара на эволюцию противоопухолевого адаптивного иммунитета

Лечение животных, имеющих опухоли MB49, посредством VTP и VTP+Гемзар приводило к значительному повышению популяции CD8-клеток в селезенке, крови и дренирующих лимфатических узлах через 6 суток после лечения. Интересно, что в то же время не наблюдали значительного эффекта в популяциях Treg. Однако практически полное истощение популяции Treg в опухоли наблюдалось через 6 суток после комбинированной терапии (фиг.15B). Комбинация WST11-VTP/Гемзар повышала популяцию цитотоксических T-клеток (CD8) и Teff в лимфатических узлах (LN), селезенке и крови через 6 суток после VTP, (** p<0,01, * p<0,05), демонстрируя отсутствие увеличение посредством VTP отдельно соотношения CD8 T-клетки/Treg, однако продемонстрировало выраженный эффект комбинации VTP/Гемзар. Комбинация VTP/Gem снижала популяцию Treg и значительно увеличивала популяцию Teff в опухоли. Увеличение величины Teff/Treg сохранялось через 9 суток после лечения. Уровень центральных T-клеток памяти (T_CM) был увеличен в случае комбинации в опухолях на 6 и 9 сутки после VTP. Сообщалось, что эта популяция обеспечивает лучшую защиту против злокачественной опухоли в нескольких различных модельных системах по сравнению с T_EM-клетками.

Пример 16: Схема лечения для WST11 VTP в комбинации с применением циклофосфамида (CTX) в низкой дозе.

На фиг.16 проиллюстрирована схема лечения для WST11 VTP в комбинации с применением циклофосфамида (CTX) в низкой дозе в качестве иммунного модулятора для лечения мышей, имеющих опухоль 4T1. Циклофосфамид (например, 50/150 мг/кг) вводят в/б через 4 суток после трансплантации 1×10⁶ злокачественных клеток в заднюю конечность животного. Через трое суток, когда опухоль достигает диаметра 4-7 мм животным проводят инфузию в течение 10 мин WST11 (9,5 мг/кг) и сразу после этого проводят облучение светом при 753 нм (120-200 мВт/см²) в течение 10-15 мин.

Пример 17. Эффект введения циклофосфамида (CTX) в высокой и низкой дозе на опосредуемое WST11 VTP устранение подкожных (п/к) опухолей молочной железы 4T1-luc, трансплантированных в заднюю конечность мыши

На фиг.17 и 18 представлен эффект введения циклофосфамида (CTX) в низкой и высокой дозе на опосредуемое WST11 VTP устранение подкожных (п/к) опухолей молочной железы 4T1-luc, трансплантированных в заднюю конечность мыши. Мышей, имеющих опухоли молочной железы 4T1-luc в задней конечности, не подвергали лечению или подвергали только однократному введению CTX (верхняя панель); подвергали WST11 (VTP с низкой или высокой интенсивностью света (средняя панель); или лечили посредством WST11 (9,0 мг WST11/кг) VTP в комбинации с однократной дозой CTX (50 или 150 мг/кг), вводимой за трое суток до VTP (нижняя панель). Эффект различных протоколов лечения на прогрессирование заболевания у индивидуальных животных представлен на фиг.17.

Проведение монотерапии посредством введения CTX в обеих дозах, а также WST11 VTP с низкой интенсивностью света оказалось неспособным подавлять рост первичной опухоли. WST11 VTP в высокой дозе удваивала время до повторного роста опухоли. Комбинация WST11 VTP c CTX значительно подавляла рост опухоли, вызывая в ~60% случаев полное устранение первичных опухолей. Совокупное выживание мышей после различных протоколов лечения представлено на фиг.18. В данном случае мышей Balb/c, имевших опухоли молочной железы 4T1-luc, трансплантированные п/к в заднюю конечность, подвергали WST11 VTP с использованием низкой (верхняя панель) или высокой (нижняя панель) интенсивности света отдельно или в комбинации с введением однократной дозы CTX (50 или 50 мг/кг) за трое суток до VTP. Результаты лечения проиллюстрированы на кривых Каплана-Мейера для всех подвергнутых лечению мышей (фиг.18A,C) или для животных, у которых произошло необратимое полное устранение первичной опухоли (фиг.18B,D). WST11 VTP в комбинации с CTX в низкой дозе (50 мг/кг) значительно улучшала выживаемость, достигшую 30% мышей, полностью излечившихся после наблюдения в течение 90 суток. Другие режимы лечения, т.е. VTP с более высокой дозой света или более высокой дозой CTX не обеспечили более длительного выживания, вызывав локальные рецидивы и последующее прогрессирование в метастазы в легкие. В группе мышей, имевших полное устранение первичных опухолей, только комбинированное лечение индуцировало защиту против метастазов в легкие в значительной части подвергнутых лечению мышей (60-80% в зависимости от протокола VTP).

Пример 18: Влияние различных режимов лечения на процент животных с метастазами в легкие у мышей Balb/c, имеющих п/к опухоли молочной железы 4T1-luc.

Balb/C, которым были трансплантированы злокачественные клетки 4T1 в их заднюю конечность, имели злокачественные клетки в легких, как показано посредством анализа колоний, представленного на фиг.19A. Лечение имеющих опухоль животных посредством WST11 VTP в комбинации с введением CTX (схема лечения 4, как описано на фиг.16) привело к полному устранению метастазов в легком через 90 суток после трансплантации в случае, когда применяли высокую дозу света и низкую дозу CTX (фиг.19B). Напротив, у большинства мышей, подвернутых VTP отдельно, развились метастазы в легкое, даже когда первичная опухоль была полностью устранена.

Пример 19: Эффект CTX на популяцию регуляторных T-клеток (Treg) в трансплантированных опухолях

Ранее было показано, что CTX снижает популяцию Treg, когда его предоставляют пациентам в низких дозах в периодическом режиме. Таким образом, его синергический эффект на исход WST11 VTP может быть следствием усиления активности цитотоксических T-клеток путем снижения относительно процента проопухолевых Treg. Действительно инфильтрация Foxp3-положительных клеток в опухоли 4T1-luc, трансплантированные в заднюю конечность мышей Balb/C, представлена на фиг.20. В данном случае опухоли 4T1 вырезали, когда они достигали 30-60 мм³, в указанные моменты времени после введения CTX или солевого раствора, фиксировали в формалине и заливали парафином. Получали срезы и окрашивали их на экспрессию Foxp3. Количество положительных клеток определяли с использованием программного обеспечения Fiji. Представлены репрезентативные изображения в день VTP и количественного определения (фиг.19A,B). Введение CTX значительно снижает инфильтрацию опухоли регуляторными Foxp3⁺ T-клетками через трое суток (фиг.19C). Это ослабляет иммуносупрессивную микросреду опухоли, позволяя развиться после VTP противоопухолевым ответам.

Пример 20: Эффект введения CTX в низкой дозе за 3 суток до WST11 VTP на популяции T-клеток в дренирующих лимфатических узлах и селезенках мышей, имеющих опухоли 4T1-luc.

На фиг.20 показано, что CTX в низкой дозе, вводимый за трое суток до WST11 VTP, уменьшал количество клеток в дренирующих лимфатических узлах и селезенке имеющих опухоль мышей в день VTP. Значительное увеличение общего количества клеток наблюдали у животных, которым вводили CTX, по сравнению с животными, которым проводили только VTP, которая демонстрирует снижение количества клеток. Эти данные указывали на то, что после опосредуемого CTX истощения иммунных клеток следовало вторичное заселение наивных иммунных клеток. Более конкретно, введение CTX снижало количество регуляторных Foxp3+ T-клеток как в лимфатических узлах, так и в селезенках, после VTP по сравнению с животными, подвергнутыми VTP отдельно. В селезенках также происходило небольшое, но значительное увеличение количества CD8+ цитотоксических T-клеток, демонстрирующее общий сдвиг в направлении активного иммунного статуса, полезного для развития противоопухолевого иммунитета.

Пример 21: Эффект введения CTX в низкой дозе на популяции миелоидных клеток в опухолях и селезенках мышей, имеющих п/к опухоли 4T1-luc в задней конечности.

Опухоли и селезенки извлекали через трое суток после введения CTX (день VTP), клетки выделяли и окрашивали для проточной цитометрии с антителами против CD11b, Ly6G и Ly6C.

На фиг.21 показано, что CTX в низкой дозе снижал уровень G-MDCS/нейтрофилов, о которых известно, что они подавляют противоопухолевый иммунный ответ в микроокружении опухоли, позволяя развиться более эффективному иммунному ответу после VTP.

На основании примеров 20 и 21, авторы изобретения сделали заключение, что терапевтическое преимущество введения CTX перед WST11 VTP отражает ослабление как Treg, так и MDSC, что обеспечивает усиленный эффект у животных как врожденной, так и адаптивной иммунной системы.

Пример 22: Выживание мышей Balb/C, имеющих п/к опухоли 4T1-luc в молочной железе, после различных режимов лечения

Выживание животных после WST11 VTP в комбинации с введением CTX (фиг.23 A, черный, 50 мг/кг) сравнивали с выживанием животных, которым проводили WST11 VTP в комбинации с введением Гемзара (фиг. 23A, синий, 75 мг/кг).

VTP отдельно с 9 мг/кг WST11 VTP при облучении светом 200 мВт/см² в течение 15 мин приводила к очень ограниченному выживанию, причем у большинства мышей развивался локальный рецидив и метастазы в легкое (фиг. 23B-зеленый). Комбинирование VTP с введением CTX, начиная за одни сутки до VTP и продолжая на 1, 6 и 11 сутки после VTP не улучшало в значительной степени исход лечения (фиг.23B-красный), в то время как введение Гемзара в соответствии с тем же протоколом, что и VTP приводило к излечению ~20% мышей (фиг.23B-желтый). VTP в комбинации с Гемзар согласно протоколу № 2 (начиная на сутки -2, с последующими тремя дополнительными дозами каждые 5 суток) повышала показатель выживаемости до более чем 30% (фиг.23B-синий). Наиболее успешные результаты были получены для CTX, вводимого на сутки -3, 3, 8 и 13, обеспечив практически 60% излеченных животных (фиг.23B-серий). Обобщение этих результатов представлено на схеме на фиг.23C, и оно может указывать на то, что CTX может иметь некоторые преимущество над лечением Гемзаром при комбинировании с WST11 VTP. В то же время, продление периодического режима Гемзара в комбинации с WST11 VTP, как продемонстрировано выше для MB49, может достигать сходного показателя излечения с CTX1 с WST11 VTP.

ПРИЛОЖЕНИЕ

STL-6038

STL-6033

STL-6068

STL-6014

STL-7012

ССЫЛКИ:

Barbon, C.M., et al., 2010, Consecutive low doses of cyclophosphamide preferentially target Tregs and potentiate T cell responses induced by DNA PLG microparticle immunization. Cell. Immunol. 262(2): 150-161.

Castano, A.P., et al., 2008, Photodynamic therapy plus low-dose cyclophosphamide generates antitumor immunity in a mouse model. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 105(14):5495-5500.

Gabrilovich D.I., 2017, Myeloid-Derived Suppressor Cells, Cancer Immunol. Res. 5(1):3-8.

Ge, Y., et al., 2012, Metronomic cyclophosphamide treatment in metastasized breast cancer patients: immunological effects and clinical outcome. Cancer Immunol. Immunother. 61(3):353-362.

Ghiringhelli F., et al., 2007, Metronomic cyclophosphamide regimen selectively depletes CD4+CD25+ regulatory T cells and restores T and NK effector functions in end stage cancer patients. Cancer Immunol. Immunother. 56(5):641-648.

Goldshaid L., Rubinstein E., Brandis A., Segal D., Leshem N., Brenner O., Kalchenko V., Eren D., Yecheskel T., Salitra Y., Salomon Y. and Scherz A., 2010, Novel design principles enable specific targeting of imaging and therapeutic agents to necrotic domains in breast tumors. Breast Cancer Research 12:R29.

Le H.K., Graham L., Cha E., Morales J. K., Manjili M. H., and Bear H.D., 2009, Gemcitabine directly inhibits myeloid derived suppressor cells in BALB/c mice bearing 4T1 mammary carcinoma and augments expansion of T cells from tumor-bearing mice. International Immunopharmacology 9:900-909.

Levy M.Y., et al., 2009, Cyclophosphamide unmasks an antimetastatic effect of local tumor cryoablation. J. Pharmacol. Exp. Ther. 330(2):596-601.

Madondo M.T., et al., 2016, Low dose cyclophosphamide: Mechanisms of T cell modulation. Cancer Treat. Rev. 42: 3-9.

Marvel D., and Gabrilovich D.I., 2015, Myeloid-derived suppressor cells in the tumor microenvironment: expect the unexpected. J. Clin. Invest. 125(9):3356-64.

Mroz P., et al., 2010, Photodynamic therapy of tumors can lead to development of systemic antigen-specific immune response. PLoS One 5(12): e15194.

Najjar Y.G., and Finke J.H., 2013, Clinical perspectives on targeting of myeloid derived suppressor cells in the treatment of cancer. Front Oncol. 15(3):49.

Ramachandran I., Youn J.I., Gabrilovich D.I., and Condamine T., 2015, Regulation of tumor metastasis by myeloid-derived suppressor cells, Annu. Rev. Med. 66:97-110.

Reginato, E., et al., 2013, Photodynamic therapy plus regulatory T-cell depletion produces immunity against a mouse tumour that expresses a self-antigen. Br. J. Cancer 109(8):2167-2174.

Suzuki E., Kapoor V., Jassar A.S., Kaiser L.R., and Albelda S.M., 2005, Gemcitabine selectively eliminates splenic Gr-1+/CD11b+ myeloid suppressor cells in tumor-bearing animals and enhances antitumor immune activity. Clin. Cancer Res. 11(18): 6713-21.

Xia, Y., et al., 2014, CpG oligodeoxynucleotide as immune adjuvant enhances photodynamic therapy response in murine metastatic breast cancer. J. Biophotonics 7(11-12): 897-905.