Результат интеллектуальной деятельности: Способ выявления ДНК бактерии Mycobacterium tuberculosis для диагностики туберкулеза

Изобретение относится к области молекулярной биологии и диагностической медицины и может быть использовано для индикации М. tuberculosis в образце ДНК.

Уже в течение нескольких столетий туберкулез (ТВ) входит в число самых сложных для лечения и летальных инфекционных заболеваний. Всемирная Организация Здоровья сообщает о почти 53-х миллионах умерших с 2000 по 2016 годы. Своевременная диагностика туберкулеза абсолютно необходима как для эффективного лечения, так и для карантинных мероприятий, разрывающих пути передачи этого контагиозного заболевания.

Классическими лабораторными методами диагностики комплекса Mycobacterium tuberculosis (МТВ) являются микроскопический анализ мазков мокроты, окрашенных по Цилю-Нильсену или с помощью флуоресцентно-меченных антител, специфичных к М. tubeculosis, а также изоляция микобактерий с помощью культуральных микробиологических методов [1-5]. Культуральные методы диагностики ТВ сегодня являются золотым стандартом, однако требуют много времени (до 12 недель) и организационных мероприятий для поддержания адекватного лабораторного пространства.

Актуальной задачей является разработка более быстрых молекулярно-генетических тестов с целью выявления присутствия микобактерий туберкулеза в клинических образцах. Сегодня к ним также добавляются тесты для определения лекарственной резистентности.

Известен способ выявления микобактерий туберкулеза путем ПЦР-амплификации фрагмента размером 383 п.о. гена, кодирующего антиген с молекулярным весом около 65 кД (groEL шаперон), общий для микобактерий, с последующим определением вида путем гибридизации с внутренним специфичным радиоактивно меченным олигонуклеотидом [6].

Известны разработки подобных тест-систем диагностики туберкулеза в России [6]. В последующие несколько лет разными авторами другие гены были предложены в качестве мишени для диагностического выявления микобактериальной ДНК [7]. Однако наиболее значимым и интересным для клинической практики является открытие мобильного генетического элемента IS6110 и дальнейшее его использование в качестве мультикопийной мишени для ПЦР с повышенной чувствительностью в отношении выявления микобактерий туберкулеза [8, 9]. Мобильный элемент (фрагмент) IS6110 (GenBank no. Х52471) является специфичной для туберкулезного комплекса микобактерий инсерционной последовательностью. Практически сразу после его открытия в 1990 году были разработаны олигонуклеотидные праймеры для выявления последовательности IS6110 с помощью ПЦР, которые были описаны в патенте [10]. Фрагмент IS6110 был в дальнейшем также использован в качестве гибридизационной пробы для молекулярно-эпидемиологического анализа изолятов микобактерий туберкулеза, получив широкое распространение [11-14]. Несмотря на расширение списка генетических мишеней для диагностики ТВ с помощью различных методов амплификации ДНК: Mtb64 [15, 16], rRNA [17], МТВ65 [18] и другие [19-21], фрагмент IS6110 остается наиболее часто используемой мишенью для диагностических целей ввиду его специфичности и мультикопийности в большинстве описанных к настоящему моменту изолятов М. tuberculosis.

Несмотря на важное практическое значение выявления нуклеотидной последовательности фрагмента IS6110, лишь небольшое число работ было посвящено исследованию консервативности его структуры [11, 22, 23]. Более того, в литературе также описаны изоляты микобактерий без фрагмента IS6110 [24, 25].

Сегодня огромный пласт информации о структуре генома тысяч изолятов микобактерий туберкулеза, публично доступный в международных базах данных, дает уникальную возможность анализа особенностей копийности и консервативности отдельных регионов генома МТВ in silico для оценки их потенциала в качестве мишеней для дизайна молекулярно-диагностических систем (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/). Таким образом, используя новые данные о структурах геномов М. tuberculosis становится возможным повышение чувствительности существующих ПЦР-тест-систем по выявлению данного патогена с помощью амплификации участка фрагмента IS6110 посредством конструирования праймеров и зондов на участки, которые наиболее часто присутствуют в геномах М. tuberculosis, а также имеют наименьшее нуклеотидное разнообразие.

Наиболее близким к заявленному способу - прототипом, является способ выявления ДНК бактерии Mycobacterium tuberculosis, включающий выделение ДНК из образца, проведение ПЦР с детекцией сигнала в режиме реального времени, с использованием набора олигонуклеотидных праймеров и зонда длиной 5-40 нуклеотидов, комплементарных одному из участков с 1300-го по 2100-й нуклеотид в последовательности IS6110 (GenBank Accession № AJ 242908) [26].

Недостатком данного способа является низкая клиническая чувствительность способа ввиду того, что праймеры и зонд комплементарны неконсервативным участкам или участкам, редко представленным в геномах данного патогена.

Задачей изобретения является создание нового способа выявления ДНК бактерии Mycobacterium tuberculosis с помощью ПЦР-амплификации консервативного района фрагмента IS6110.

Технический результат: повышение клинической и аналитической чувствительности способа.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Из полученного биологического образца выделяют ДНК любым из известных способов (например, сорбцией на магнитных частицах), затем с последней проводят ПЦР, используя один из двух разработанных наборов праймеров и флуоресцентного зонда, представленных в таблице 1. Зонд может содержать любую из подходящих пар флуорофор-тушитель (например, HEX и BHQ). ПЦР проводят в амплификаторе с детекцией сигнала в режиме реального времени (например, Bio-Rad CFX96) по программе, позволяющей проводить такую амплификацию. Например, для полимеразы с горячим стартом возможно использование следующей программы: 96°С - 15 минуты, (96°С - 10 секунд, 60°С - 30 секунд с детекцией сигнала) - 40 циклов. Параллельно с исследуемым образцом анализируют отрицательный контроль. В случае, если кривая накопления сигнала для исследуемого образца выходит на экспоненциальный рост до кривой для отрицательного контроля, образец считают содержащим ДНК М. tuberculosis.

Для конструирования праймеров и зондов были использованы последовательности геномов из базы данных GenBank, также были определены наиболее часто встречающиеся и консервативные участки мобильного элемента IS6110 (фиг. 1), на которые были сконструированы два набора праймеров и зондов (таблица 1). Используя все доступные геномы, было проведено сравнение с известными тест-системами сконструированных наборов праймеров in silico. На фиг. 2 представлено сравнение праймеров и зондов, предлагаемых в данном изобретении, и тест-систем из литературы по числу последовательностей IS6110 (А) и числу геномов (Б), для которых предсказано in silico, что система их будет детектировать. Для обоих сконструированных наборов процент геномов, с которыми праймеры взаимодействовали, превосходил существующие олигонуклеотидные праймеры, следовательно, они будут иметь большую клиническую чувствительность (фиг. 2). Предсказанная чувствительность для двух наборов праймеров и зондов из Таблицы 1 составила 99,1 и 98,4%, соответственно. В то же время, для праймеров из литературы теоретическая чувствительность была в пределах от 95,3 до 97,7%. Кроме того, предлагаемые праймеры и зонды способны связываться и с большим числом различных последовательностей IS6110, что приводит к повышению аналитической чувствительности такого теста.

Определяющим отличием заявляемого способа, по сравнению с прототипом, является использование новых сконструированных праймеров и зондов, комплементарных консервативным участкам мобильного элемента геномов Mycobacterium - IS6110, которые присутствуют у большинства известных геномов М. tuberculosis, что позволяет повысить чувствительность предлагаемого способа.

Разработанный способ может быть использован клиническими лабораториями для исследования образцов ДНК, выделенных из биологического материала различного происхождения (например, мокроты).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Исследование образцов ДНК, выделенных из мокроты человека.

Образец мокроты центрифугируют 5 мин при 6,000 g. ДНК выделяют из полученного осадка с использованием набора реагентов QIAGEN QIAamp DNA mini kit (QIAGEN, Valencia, CA). Далее с выделенным образцом ДНК проводят количественную ПЦР в амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad Laboratories, США) в объеме 20 мкл, содержащем 1 × буфер для ПЦР (65 мМ Tris-HCl рН 8,9, 24 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,05% Tween 20, 2,5 мМ MgCl₂), по 0,3 мкМ каждого праймера из набора №1 и 0,1 мкМ зонда из набора №1 (таблица 1), 1 е.а. Taq-полимеразы (Биосан; Россия) и образец ДНК. Амплификацию проводят согласно следующей программе: денатурация при температуре 95°С в течение 3 мин; 45 циклов со следующими стадиями: денатурация при температуре 95°С в течение 10 с; отжиг и элонгация при температуре 60°С в течение 40 с, съем сигнала флуоресценции по каналу HEX на длине волны 556 нм. Параллельно с исследуемым образцом проводят амплификацию отрицательного и положительного образцов. Кривая накопления сигнала, построенная программным обеспечением CFX Manager (Bio-Rad), для исследуемого образца выходит на экспоненциальный рост до кривой накопления сигнала для отрицательного образца, следовательно в исследуемом образце присутствует ДНК бактерии М. tuberculosis.

Пример 2. Исследование образцов ДНК, выделенных из мокроты человека, с помощью набора праймеров и зонда №2.

Все процедуры проводили аналогично примеру 1, за исключением того, что в ПЦР используют набор праймеров и зонда №2 из таблицы 1. Кривая накопления сигнала, построенная программным обеспечением GFX Manager (Bio-Rad), для исследуемого образца выходит на экспоненциальный рост до кривой накопления сигнала для отрицательного образца, следовательно в исследуемом образце присутствует ДНК бактерии М. tuberculosis.

Пример 3. Исследование образцов ДНК, выделенных из мокроты человека, с помощью набора праймеров и зонда №1 на приборе LightCycler96.

Все процедуры проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что ПЦР-амплификацию проводят на приборе LightCycler96 (Roche). Кривая накопления сигнала, построенная программным обеспечением CFX Manager (Bio-Rad), для исследуемого образца выходит на экспоненциальный рост до кривой накопления сигнала для отрицательного образца, следовательно в исследуемом образце присутствует ДНК бактерии М. tuberculosis.

Таким образом, разработанный новый способ выявления ДНК бактерии М. tuberculosis обладает большей чувствительностью по сравнению с существующими способами, (из чего это видно, привести доказательство)

Источники информации

1. Лискова Е.А., Слинина К.Н., Берус М.В., Гришина Н.В. Способ первичной идентификации микобактерий комплекса М. tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий //2015.

2. Лазовская А.Л., Рачкова О.Ф., Фокина Е.И., Ильина Е.А. Способ идентификации микобактерий М. bovis и М. tuberculosis // 1992.

3. Нуратинов Р.А., Агамагомедовна, Вердиева Э. Способ идентификации возбудителей туберкулеза бычьего (М. bovis) и человеческого (М. tuberculosis) видов // 2012.

4. Жемков В.Ф., Ермаков И.И., Мельтрегер Б.И. Способ диагностики туберкулеза// 1995.

5. Мордовской Г.Г., Мальцева А.С. Способ выявления микобактерий туберкулеза из резецированной ткани легкого // 2009.

6. Мальков И.Г. Способ индикации возбудителей туберкулеза М. tuberculosis и М. bovis // 1996.

7. Tiwari R.P., Hattikudur N.S., Bharmal R.N., Kartikeyan S., Deshmukh N.M., Bisen P.S. Modern approaches to a rapid diagnosis of tuberculosis: Promises and challenges ahead // Tuberculosis. - 2007. - V. 87. - No. 3. - P. 193-201.

8. Eisenach K.D., Cave M.D., Bates J.H., Crawford J.T. Polymerase chain reaction amplification of a repetitive DNA sequence specific for Mycobacterium tuberculosis // J. Infect. Dis. - 1990. - V. 161. - No. 5. - P. 977-981.

9. Thierry D., Brisson-Noel A., Vincent-Levy-Frebault V., Nguyen S., Guesdon J.L., Gicquel B. Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS6110, and its application in diagnosis // J. Clin. Microbiol. - 1990. - V. 28. - No. 12. - P. 2668-2673.

10. Guesdon J.-L., Thierry D., Ullmann A., Gicquel В., Brisson-Noel A. Fragments of nucleic acids derived from an appropriate mycobacteria genome, their applications in the diagnosis of mycobateria infections and plasmides containing said fragments // 1990.

11. Cave M.D., Eisenach K.D., McDermott P.F., Bates J.H., Crawford J.T. IS6110: Conservation of sequence in the Mycobacterium tuberculosis complex and its utilization in DNA fingerprinting // Mol. Cell. Probes. - 1991. - V. 5. - No. l. - P. 73-80.

12. Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Вязовая А.А., Вишневский Б.И., Нарвская O.B. Способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа Beijing // 2008.

13. Мокроусов И.В., Вязовая А.А., Оттен Т.Ф., Вишневский Б.И., Растоп: Н., Нарвская О.В. Способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа Beijing в режиме реального времени // 2011.

14. Мокроусов И.В., Вязовая А.А., Журавлев В.Ю., et al. Способ выявления микобактерий туберкулеза генетического кластера Beijing B0/W148 // 2014.

15. Shankar P., Manjunath N., Lakshmi R., Aditi В., Seth P., Shriniwas. Identification of Mycobacterium tuberculosis by polymerase chain reaction // Lancet. - 1990. - V. 335. - No. 8686. - P. 423.

16. Manjunath N., Shankar P., Rajan L., Bhargava A., Saluja S., Shriniwas. Evaluation of a polymerase chain reaction for the diagnosis of tuberculosis // Tubercle. - 1991. - V. 72. - No. l. - P. 21-27.

17. Boddinghaus В., Rogall Т., Flohr Т., Blocker H., Bottger E.C. Detection and identification of mycobacteria by amplification of rRNA // J. Clin. Microbiol. -1990.-V. 28.-No. 8.-P. 1751-1759.

18. Kikuchi Y., Oka S., Kimura S., Mitamura K., Shimada K. Clinical Application of the Polymerase Chain Reaction for a Rapid Diagnosis of Mycobacterium tuberculosis Infection // Intern. Med. - 1992. - V. 31. - No. 8. -P. 1016-1022.

19. Zhao J., Wang Y., Li D., et al. An efficient alternative marker for specific identification of Mycobacterium tuberculosis // World J. Microbiol. Biotechnol. - 2014. - V. 30. - No. 8. - P. 2189-2197.

20. Алланд Д., Чакраворти С. Праймеры и зонды для полимеразной цепной реакции для обнаружения Mycobacterium tuberculosis //2015.

21. Литвинов В.И., Мороз A.M., Скотникова О.И., Демкин В.В., Соболев А.Ю., Николаева Н.П. Способ диагностики туберкулеза // 1999.

22. Qin L., Gao S., Wang J., Zheng R., Lu J., Hu Z. The Conservation and Application of Three Hypothetical Protein Coding Gene for Direct Detection of Mycobacterium tuberculosis in Sputum Specimens // PLoS One. - 2013. - V. 8. -No. 9.-P. e73955.

23. Dale J.W., Tang Т.Н., Wall S., Zainuddin Z.F., Plikaytis B. Conservation of IS6110 sequence in strains of Mycobacterium tuberculosis with single and multiple copies // Tuber. Lung Dis. - 1997. - V. 78. - No. 5-6. - P. 225-227.

24. Lok K.H., Benjamin W.H., Kimerling M.E., et al. Molecular differentiation of Mycobacterium tuberculosis strains without IS6110 insertions // Emerg. Infect. Dis. -2002. - V. 8.-No. 11.-P. 1310-1313.

25. Hellyer T.J., Desjardin L.E., Assaf M.K., Bates J.H., Cave M.D., Eisenach K.D. Specificity of IS6110-based amplification assays for Mycobacterium tuberculosis complex // J. Clin. Microbiol. - 1996. - V. 34. - No. 11. - P. 2843-2846.

26. Sohyeon В., Seongyeol G., Haejun В., Hano В., Sangjin B. Primer and probe for diagnosing tuberculosis, a kit comprising the same and a tuberculosis-diagnosing method using the kit // 2010.