Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения биомассы метанокисляющих бактерий с добавлением формиата натрия

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, к способам получения биомассы метанокисляющих бактерий, и может быть использовано в кормовой, пищевой и химической промышленности.

Метанокисляющие бактерии осуществляют последовательное окисление метана до метанола, формальдегида, формиата и углекислого газа. В процессе утилизации метана происходит накопление биомассы метанокисляющих бактерий, которая может быть использована в виде белковой кормовой добавки.

Известен способ получения биомассы метанокисляющих бактерий (патент РФ №2699986, C12N 1/20, опубл. 11.09.2019), включающий в условиях аэрации выращивание указанных бактерий в ферментере на содержащей в качестве источника углерода метан питательной среде. При выращивании осуществляют рециркуляцию биомассы через контур рециркуляции из части ферментера с минимальным содержанием кислорода, представляющей собой зону деаэрации, в часть ферментера с максимальным содержанием растворенного кислорода, представляющей собой зону аэрации и подачи жидкой фазы, со скоростью прокачки 1/50-1/70 рабочего объема ферментера в минуту. Причем метан подают в контур рециркуляции жидкой фазы, а воздух в зону аэрации.

Недостатком известного изобретения является постоянный перевод метаболического аппарата бактерий Methylococcus capsulatus с аэробного на анаэробный путь, что увеличивает энергетические затраты бактерий (Roslev P., King G. M. Aerobic and anaerobic starvation metabolism in methanotrophic bacteria // Applied and environmental microbiology. 1995. V. 61. №.4. Стр. 1563-1570). Кроме того, в ферментер необходимо устанавливать два раздельных штуцера: один для подачи метана и один для воздуха, что увеличивает затраты на стерилизациию и материалы, а также требует дополнительных мер для поддержания асептики.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату (прототипом) является способ получения биомассы метанокисляющих бактерий (патент РФ №2699293, C12N 1/20, опубл. 04.09.2019), включающий выращивание бактерий в ферментере в условиях аэрации на питательной среде, выделение биомассы из культуральной жидкости, частичный возврат отработанной культуральной жидкости на стадию выращивания, обезвоживание и сушку биомассы. Причем выращивание биомассы проводят в режиме переменного аэрирования и с непрерывной подачей метана в максимально турбулентную аэрированную зону ферментера.

Недостатком данного изобретения является постоянный перевод метаболического аппарата клеток метанокисляющих бактерий с аэробного на анаэробный путь, что увеличивает энергетические затраты бактерий (Roslev P., King G. M. Aerobic and anaerobic starvation metabolism in methanotrophic bacteria // Applied and environmental microbiology. 1995. V. 61. №.4. Стр. 1563-1570). Кроме того, в ферментер необходимо устанавливать два раздельных штуцера: один для подачи метана и один для воздуха, что увеличивает затраты на стерилизациию и материалы, а также требует дополнительных мер для поддержания асептики.

Процесс окисления метана метанокисляющими микроорганизмами можно представить в виде цепочки реакций:

ММО - фермент метанмонооксигеназа, ФДГ - фермент формальдегид дегидрогеназа, НАД+ - окисленная форма никотинамидадениндинуклеотида, НАДН - восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида (восстановленный кофермент).

Ключевым ферментом метаболизма метана является ММО, катализирующая окисление метана до метанола. Как видно из приведенной цепочки реакций для окисления одного моля метана в метанол необходим 1 моль НАДН. В свою очередь НАДН образуется при окислении формальдегида в формиат под действием ФДГ и формиата до СО₂. Цепочка превращений от метана к углекислому газу представляет собой энергетический путь утилизации метана, который конкурирует с цепочкой фиксации метана. Таким образом, для окисления метана метанокисляющим бактериям необходима энергия в виде НАДН, но бактерии тратят часть метана (не менее 30%) на образование НАДН, что снижает выход биомассы.

Известно, что для поддержания высокой активности ММО у метанокисляющих бактерий можно использовать примерно 2 ммоль/л формиата натрия (Palumbo, A.V.; Strong-Gunderson, M.; Carroll, S. Retaining and recovering enzyme activity during degradation of TCE by methanotrophs. Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. Стр. 63-65, 789-796). Известно также, что формиат натрия можно использовать в качестве восстановителя для индукции активности растворимой ММО.

Установлено что фиксация углерода клетками происходит преимущественно на уровне формальдегида (Bengelsdorf, Frank R., and Peter "Biokatalytische Konversion." CO2 und CO-Nachhaltige Kohlenstoffquellen die Kreislaufwirtschaft. Springer Spektrum, Berlin, Heidelberg, 2020. Стр. 99-119). Из приведенной цепочки реакций следует, что если отсечь энергетический путь за счет репрессии фермента ФДГ, то почти весь метан будет фиксироваться клетками (do Valle Gomes M. Z., Palmqvist A. E. С Immobilization of formaldehyde dehydrogenase in tailored siliceous mesostructured cellular foams and evaluation of its activity for conversion of formate to formaldehyde // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2018. Стр. 41-46). Как известно, репрессия происходит под влиянием конечного продукта или добавленного в ростовую среду, или синтезируемого в клетке в достаточном количестве.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа, обеспечивающего наиболее полную ассимиляцию метана в биомассу метанокисляющих бактерий.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является увеличение выхода биомассы метанокисляющих бактерий за счет перераспределения метаболических потоков в клетках метанокисляющих бактерий.

Указанный технический результат достигается за счет того, что в способе получения биомассы метанокисляющих бактерий, включающем выращивание метанокисляющих бактерий в ферментере в условиях аэрации на питательной среде, содержащей метан в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, минеральные соли и микроэлементы, отделение биомассы от культуральной жидкости, обезвоживание и сушку биомассы, в питательную среду добавляют формиат натрия в количестве от 2 до 5 ммоль/л. Формиат натрия используют в качестве дополнительного источника восстановленного кофермента НАДН (никотинамидадениндинуклеотида).

В ходе проведения экспериментов установили, что в результате увеличения скорости протока и подачи газовоздушной смеси в ферментер при непрерывном культивировании метанокисляющих бактерий не происходит накопления биомассы бактерий, а почти весь субстрат (метан) переходит в углекислый газ. Можно предположить, что при таком режиме культивирования вся энергия, образующаяся при окислении метана до CO₂, тратится на поддержание текущей оптической плотности в ферментере. Следовательно, для накопления биомассы при высоких скоростях протока необходимо введение дополнительного источника энергии. Добавление формиата натрия в питательную среду при культивировании метанокисляющих бактерий обеспечит образование НАДН за счет окисления формиата натрия до диоксида углерода, а большая часть метана пойдет на образование биомассы бактерий, что приведет к увеличению выхода биомассы метанокисляющих бактерий.

Введение формиата натрия в питательную среду целесообразно проводить в режиме непрерывного культивирования при высокой скорости протока и подачи газовоздушной смеси.

По предлагаемому способу процесс получения биомассы метанокисляющих бактерий осуществляют следующим образом:

Проводят выращивание метанокисляющих бактерий на питательной среде. В качестве источника углерода используют метан, а в качестве минерального питания - азот, фосфор, калий, магний, медь и другие, необходимые для питания метанокисляющих бактерий, элементы. При этом в питательную среду в качестве дополнительного источника питания вносят формиат натрия в количестве от 2 до 5 ммоль/л, который используют в качестве дополнительного источника восстановленного кофермента (НАДН) для активации ММО.

Процесс выращивания ведут при температуре 41-42°С, рН 5,6-5,8, удельной скорости роста метанокисляющих бактерий 0,27 ч^-1, при расходе природного газа и воздуха на 1 литр ферментационной среды 15 и 45 л/ч, соответственно. Со стадии выращивания суспензию метанокисляющих бактерий направляют на сгущение и сушку.

Осуществление предлагаемого изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1

Осуществляли культивирование штамма Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 в непрерывном режиме в ферментере с механическим перемешиванием объемом 50 литров (рабочий объем - 30 литров) с непрерывной подачей питательной среды, содержащей следующие минеральные компоненты (на 1 литр воды): (NH₄)₂SO₄ - 0,56 г; MgSO₄x7H₂O - 0,02 г; KCl- 0,025 г; (NH₄)₂HPO₄ - 0,04 г; (NH₄)H₂PO₄ - 0,04 г; ZnSO₄x7H₂O - 0,3 мг; MnSO₄x5H₂O - 0,54 мг; CuSO₄x5H₂O - 0,54 мг; H₃BO₃ - 0,6 мг; FeSO₄x7H₂O - 2,0 мг; Na₂MoO₄x2H₂O - 0,045 мг; CoSO₄x7H₂O - 0,048 мг; Трилон Б - 5,0 мг.

Процесс проводили в нестерильных условиях:

- при температуре 42°С;

- при рН среды от 5,6 до 5,8;

- при атмосферном давлении;

- при расходе природного газа и воздуха на 1 литр ферментационной среды 15 и 45 л/ч, соответственно;

- при скорости протока питательной среды 0,27 ч^-1.

При продолжительном поддержании такого режима культивирования, при непрерывном протоке 0,27 ч^-1 питательной среды указанного состава, концентрация биомассы в ферментационной среде оставалась постоянной и составила 10,2-11,3 г/л.

Пример 2

Состав питательной среды и условия культивирования аналогичны примеру 1, но в питательную среду добавляли формиат натрия в количестве 1 ммоль/л.

В результате концентрация биомассы в ферментационной среде оставалась постоянной и составила 11,6-12,3 г/л.

Пример 3

Состав питательной среды и условия культивирования аналогичны примеру 1, но в питательную среду добавляли формиат натрия в количестве 2 ммоль/л.

В результате концентрация биомассы в ферментационной среде оставалась постоянной и составила 13,5-13,8 г/л.

Пример 4

Состав питательной среды и условия культивирования аналогичны примеру 1, но в питательную среду добавляли формиат натрия в количестве 3 ммоль/л.

В результате концентрация биомассы в ферментационной среде оставалась постоянной и составила 13,7-13,8 г/л.

Пример 5

Состав питательной среды и условия культивирования аналогичны примеру 1, но в питательную среду добавляли формиат натрия в количестве 5 ммоль/л.

В результате концентрация биомассы в ферментационной среде оставалась постоянной и составила 13,6-13,8 г/л.

Пример 6

Состав питательной среды и условия культивирования аналогичны примеру 1, но в питательную среду добавляли формиат натрия в количестве 7 ммоль/л формиата натрия.

В результате концентрация биомассы в ферментационной среде оставалась постоянной и составила 12,2-13,2 г/л.

Таким образом, добавление формиата натрия в питательную среду в эффективной концентрации от 2 до 5 ммоль/л увеличивает выход биомассы метанокисляющих бактерий на 26-28%. Добавление формиата натрия в большей концентрации не приводит к значительному увеличению биомассы.