Результат интеллектуальной деятельности: Способ восстановления кожного покрова

Изобретение относится к медицине, может применяться в хирургии, травматологии и ортопедии, в комбустиологии, пластической хирургии и может быть использовано при лечении ран. Изобретение может быть использовано при лечении длительно незаживающих ран различного генеза, в том числе: диабетических язв, нейротрофических язв, венозных язв, ран посттравматического и послеоперационного происхождения.

Известен способ, при котором производят фенестрацию раневой поверхности до здоровой кровоснабжаемой нижележащей ткани. После этого осуществляют тангенциальное иссечение трофической раны и выполняют аутодермопластику расщепленным сетчатым кожным лоскутом. Операцию проводят одномоментно («Способ хирургического лечения трофических и вялотекущих ран» // Хунафин С.Н., Гильманов А.Ж., Галимов Ш.Н., Зинатуллин Т.Р., Зинатуллина К.Р., Мусина Ф.С., Олейников С.И., Муниров P.P., Гиматдинов Р.И., Смольников В.В. Патент RU 2341208 С1 от 27.09.2007 г.). Способ призван стимулировать рост грануляционной ткани под трансплантатом. Недостатками способа являются те же сложности, которые возникают при использовании аутодермопластики. В том числе необходимость проведения обезболивания, высокая степень операционной травмы, кровопотеря.

Известен способ лечения ран, при котором после выполнения хирургической обработки раны на ее поверхность наносят готовый трансплантат культуры клеток фибробластов человека. После приживления клеток фибробластов - образования монослоя в ране, производят аутодермопластику, для чего используют расщепленный сетчатый аутолоскут с перфорацией 1:6 и более. При невозможности получить аутолоскут достаточных размеров используют культуру аутоэпидермоцитов. Для предупреждения механического повреждения рану закрывают парафинизированной марлевой повязкой («Способ лечения раны» // Фёдоров В.Д., Саркисов Д.С., Алексеев А.А., Туманов В.П., Глущенко Е.В., Морозов С.С. Патент RU 2023424 С1 от 30.11.1994 г.). Недостатками способа является многоэтапность и сложность метода, а также необходимость проведения технически сложной и длительной процедуры получения собственных кератиноцитов пациента. Способ более длителен по времени - образование монослоя фибробластов занимает от 5 до 14 дней, после чего необходимо повторное хирургическое вмешательство для выполнения аутодермопластики.

Известен способ восстановления кожного покрова, заключающийся в том, что аллофибробласты, полученные при культивировании, пересаживают на раневую поверхность длительно незаживающих ран донорских участков, сверху трансплантат покрывают парафинизированной марлей и накладывают сухую асептическую повязку. Фибробласты стимулируют регенерацию эпидермиса из сохранившихся частей кожных дериватов («Аллотрансплантация культивированных фибробластов на незаживающие раны после аутодермопластики»; Д.С. Саркисов, Е.В. Глушенко, Ш.Р. Гуруков, С.С. Морозов, В.П. Туманов, Н.В. Бережков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1991. - №5, - с. 542-544). Недостатком этого способа является вынужденное резкое изменение условий существования культивированных фибробластов при их переносе из условий in vitro на раневую поверхность, что отрицательно влияет на жизнедеятельность этих клеток и объясняет не более восьмидесяти процентов эффективности применения этого способа. Не исключается вероятность развития реакции отторжения трансплатата, имеющая место в ряде случаев. Покрытие трансплантата парафинизированной марлей с наложенной сверху асептической повязкой вызывает травмирование раневой поверхности при движениях тела и при смене повязки, а также затрудняет отток раневого отделяемого. Отсутсвие в методике клеток кожи не приводит к формированию эпителия.

Известен способ восстановления кожного покрова, включающий получение так называемого «дермального экивалента», представляющего собой коллагеновый гель с включенными с его состав живыми фибробластами, на поверхности которого выращивают кератиноциты и затем такой «живой эквивалент кожи» пересаживают на раневую поверхность (см. Bell., Sher S., Hull В. et al. - The reconstruction of living skin // J. Invest. Dermatol. - 1983. - Vol. 81, N1. - supp. - P. 2-10). Данный способ отличается значительной трудоемкостью, и в настоящее время значительно модифицирован. В частности, результатами модификации метода за рубежом являются многочисленные биоинженерные клеточные продукты.

Известен способ восстановления кожного покрова, при котором в область повреждения кожи вводят суспензию, содержащую биорезорбируемый носитель с композицией клеток фибробластов и кератиноцитов на поверхности. При этом носитель представляет собой частицы диаметром 100-500 мкм, обладающие отрицательным зарядом при физиологических значениях рН. Указанные частицы получены измельчением трехмерных матриксов на основе фиброина шелка Bombyx mori. Изобретение обеспечивает замедление контракции поврежденной области на ранних этапах восстановления, ускорение реэпителизации раны и, как следствие, ускорение заживления поврежденного кожного покрова субъекта («Способ восстановления кожного покрова» // Мойсенович М.М., Агапов И.И., Архипова А.Ю., Рамонова А.А., Кирпичников М.П. Патент RU 2644633 С1 от 28.12.2016 г. Мойсенович М.М. и др., «Фундаментальные основы использования биорезорбируемых микроносителей на основе фиброина шелка в терапевтической практике на примере регенерации кожи» // Терапевтический архив, 2015; 87(12): 66-72). Недостатками указанного способа являются: трудоемкость метода, отсутствие у матрицы физиологического сродства к тканям пациента, и, как следствие этого, неспособность матрицы стимулировать процесс заживления, в отличие от матриц из коллагена и гиалуроновой кислоты, которые являются естественными компонентами дермы. Матрицы из фиброинов шелка не являются зарегистрированными изделиями для медицинского применения на территории РФ. Также методика предполагает использование инъекционной техники введения клеточного материала, что является более трудоемким методом, чем аппликация, а также болезненным для пациента.

Известна методика получения и использования дермального матрикса из трупной кожи (ДМ), комбинированного с аутологичным лоскутом (Wang Jing, SUN Shu-guang, Wang Liang-xi, WU Jing, MAO Xue-fei «Repair of scar deformities by composite grafting of acellular dermal matrix with razor thin autoskin» Journal of Southeast China National Defence Medical Science 2006-04). Способ используют для устранения послеожоговой рубцовой деформации. Производят иссечение рубца до подкожно-жировой клетчатки. На донорском участке заготавливают аутологичный расщепленный кожный лоскут соразмерно дефекту. На рану последовательно укладывают ДМ с аутологичным кожным лоскутом пациента. Основным недостатком метода является увеличение раневой поверхности в два раза при заготовке лоскута аутологичной кожи соразмерно иссеченному рубцу. При этом метод применяется только при лечении операционной раны, формируемой при устранении послеожоговой рубцовой деформации. Кроме того, для устранения рубца требуется дополнительная операция с адекватным анестезиологическим пособием.

Известен способ восстановления кожного покрова, при котором выполняют раннюю хирургическую некрэктомию и одномоментную аутодермопластику. При этом вводят аллогенные адипогенные мезенхимальные стволовые клетки (МСК) по периметру ожоговой раны и субфасциально под пересаженный трансплантат. В частном случае дополнительно проводят внутримышечное введение аллогенных адипогенных мезенхимальных стволовых клеток. Аллогенные адипогенные МСК вводят вначале на 2-3 сутки после травмы, затем при первой перевязке. Для осуществления данного способа проводится некрэктомия раны субфасциально, внутримышечно и по периметру ожога в зону глубокого ожога кожи вводится суспензия мезенхимальных стволовых клеток и проводится аутодермопластика раны. Инъекции осуществляют по периметру раны и субфасциально под пересаженный трансплантат («Способ биотехнологического восстановления кожного покрова аллогенными стволовыми клетками человека» // Зиновьев Е.В., Асадулаев М.С., Чепур С.В., Юдин А.Б., Степанов Н.Н., Миляев А.В., Бояринцев В.В., Сафаров P.P. оглы, Лошманов М.М. Патент RU 2687007 С2 от 12.09.2017 г.). Недостатками способа являются те же сложности, которые возникают при использовании аутодермопластики, техническая сложность, многоэтапность метода, использование инъекционной методики введения клеточного материала.

Известен способ восстановления кожного покрова у пациентов с обширными травматическими ранами с дефектом мягких тканей. Для этого выполняют иссечение утильной кожи по краям раны. Далее выполняется трансплантация в дно раны аллогенных мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток (ММСК) в виде суспензии при помощи инъекций на глубину 0,1-0,3 мм с частотой 10 инъекций на 1 см². Объем каждой инъекции составляет 0,05-0,1 мл. Дно раны укрывают стерильным дермальным матриксом (ДМ), моделированным по форме раны, с перфорациями для создания оттока раневого отделяемого, предпочтительно с частотой 1 перфорация длиной 5 мм на 1 см², затем рану укрывают стерильной марлевой повязкой. Первую перевязку производят через 48 часов, оценивают наличие признаков воспаления, характер и количество раневого отделяемого, степень фиксации дермального матрикса. В дальнейшем перевязки производят каждые 48 часов. Недостатками указанного способа являются: необходимость получения лоскутов аллогенной кожи высокого качества, выполнения адекватных условий ее хранения и транспортировки в случае, если трансплантацию невозможно сделать в день забора, при невозможности обеспечения условий хранения - проведение операции по трансплантации пациенту в день забора аллогенной кожи у донора, использование технически сложной процедуры получения ММСК в виде суспензии, использование инъекционной техники введения клеточного материала («Способ восстановления кожного покрова у пациентов с обширными ранами с дефектом мягких тканей (варианты)» // Хубутия М.Ш., Боровкова Н.В., Хватов В.Б., Филиппов О.П., Клюквин И.Ю., Похитонов Д.Ю., Пономарев И.Н., Андреев Ю.В., Миронов А.С., Конюшко О.И. Патент RU 2526814 С1 от 17.06.2013 г.).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ лечения ран, включающий хирургическую обработку, закрытие всей поверхности раны лоскутом аутокожи с коэффициентом перфорации 1:6-1:10, поверх которого укладывается лоскут аллогенной кожи с коэффициентом перфорации 1:2-1:3 (способ кожной пластики по J.W. Alexander, 1981 г. или Сэндвич-пластика / Sandwich grafting).

Недостатком известного способа является необходимость получения лоскутов аллогенной кожи высокого качества, выполнения адекватных условий ее хранения и транспортировки в случае, если трансплантацию невозможно сделать в день забора, при невозможности обеспечения условий хранения - проведение операции по трансплантации пациенту в день забора аллогенной кожи у донора; затратная стоимость получения и хранения такого трансплантата, связанная с необходимостью поиска подходящего донора, проведения вмешательства по забору донорского материала, создания адекватных условий для хранения аллогенной кожи, очень высока. При экстренном использовании аллогенных тканей не всегда возможно обеспечение инфекционной безопасности (обследования донора и тканей на носительство ВИЧ, гепатита и т.д.).

Кератиноциты - основные клетки кожи человека, отвечающие за защитную функцию кожи. Восстановление целостности слоя кератиноцитов кожи определяет восстановление барьерной функции эпидермиса кожи. Еще один компонент кожи - стромальные клетки: фибробласты дермального слоя кожи и МСК из жировой ткани. Стромальные клетки обеспечивают поддержание и функционирование кератиноцитов, таким образом восстановление целостности кожи заключается в восстановлении всех слоев: стромы и эпидермиса. Подкожная жировая ткань содержит большое количество целевых клеток (стромально-васкулярная фракция жировой ткани содержит от 5 до 10% МСК в числе ядерных клеток) (Zuk PA, Zhu М, Mizuno Н, Huang JI, Futrell WJ, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001). Так многими исследователями показано, что стромальные клетки - фибробласты и МСК могут пролиферировать на протяжении более чем 25-50 пассажей, не теряя своей генетической стабильности, при этом многократно наращивая клеточную массу. Данные свойства позволяют рассматривать донорские клетки кожи, как ресурс для закрытия обширных ран у пациентов с дифицитом собственного пластического материала или при его низком качестве. Таким образом, для лечения пациентов с обширными травматическими дефектами мягких тканей требуется разработка нового способа, применимого при ранах разной этиологии, на разных этапах лечения, позволяющего комбинировать лоскут собственной кожи пациента с донорскими (аллогенными) культивированными клетками кожи, в том числе в составе комбинированных биологических клеточных продутов (БМКП).

Выбор материала матрицы - носителя является серьезным этапом создания БМКП, поскольку он определяет биосовместимость, биодеградацию, адгезионные и антибактериальные свойства готового продукта, определяющие, в свою очередь скорость и качество восстановления кожного покрова. Матрицы-носители не только доставляют донорские клетки (МСК и/или фибробласты, кератиноциты) непосредственно в область повреждения, они повышают жизнеспособность клеток, обеспечивают их длительное высвобождение и, имея структуру, напоминающую внеклеточный матрикс, влияют на экспрессию генов и секрецию белков, модулируют клеточный фенотип. Таким образом, лечение кожных покровов с помощью БМКП на основе биосовместимой матрицы- носителя способствует как большей выживаемости вводимых клеток, так и повышает скорость и полноту регенерации кожи, что повышает качество результатов лечения.

Перспективными являются биотехнологические методики восстановления кожного покрова, предусматривающие использование клеточных культур (кератоцитов, фибробластов, МСК), а также биотехнологических продуктов на их основе (Рахматуллин P.P. Биопластический материал на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса для восстановительной и реконструктивной хирургии. Автореф. Дисс. д.б.н. - М., 2014. - 39 с.), одним из наиболее эффективных направлений признается использование биопластических материалов, разработка 2D и 3D матриксов искусственных органов в качестве структурной основы для тканеинженерных конструкций, в т.ч. на основе клеточных продуктов, в т.ч. на основе стволовых клеток (Рахматуллин P.P. Биопластический материал на основе гидроколоида гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса для восстановительной и реконструктивной хирургии. Дисс. на соискание ученой степени д.б.н. - М., 2014. - 324 с.). Таким клеточным продуктом, объединяющим физиологические свойства биотехнологической матрицы из коллагена и гиалуроновой кислоты и свойства стимуляторов репаративной регенерации аллогенных клеток стромы: МСК и/или фибробластов и кератиноцитов кожи, является биоинженерный клеточный продукт - Биологический эквивалент кожи (БЭК), разработанный ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук.

Технический результат заключается в том, что при использовании заявляемого технического решения достигается закрытие обширных раневых поверхностей, в том числе длительно незаживающих ран, трофических язв, пролежней и пр. в ранние сроки с формированием полноценной полнослойной кожи, с меньшим риском рубцевания. При этом вследствие своевременного восстановления целостности кожных покровов уменьшается риск проникновения инфекции, снижается потеря белков плазмы, происходит экономия донорских ресурсов кожи пациента, за счет использования собственной кожи пациента возможно восстановление функционально активных участков тела пациента (раны в области суставов). Заявленный способ лечения ран позволяет более эффективно использовать аутодермопластику в лечении пациентов с различными повреждениями кожного покрова, поскольку стромальные клетки в составе продукта (МСК и/или фибробласты) посредством синтеза компонентов экстрацеллюлярного матрикса стимулируют как адгезию кератиноцитов, так и пролиферацию с последующей дифференцировкой, аллогенные кератиноциты ускоряют эпителизацию кожного покрова. При качественной подготовке раневого ложа и оптимальных условиях выполнения аутодермопластики, при использовании заявленного способа лечения полная эпителизация ран возможна на 6-14 сутки после выполнения вмешательства, что значительно сокращает сроки лечения в стационаре по сравнению с традиционными методами восстановления кожного покрова.

Технический результат предлагаемого способа достигается тем, что в способ восстановления кожного покрова у пациентов с полнослойными, в том числе с хроническими ранами с помощью пластики расщепленным кожным лоскутом в сочетании с биологическим эквивалентом кожи, включающий хирургическую обработку раны, нанесение на ее поверхность лоскута перфорированной собственной кожи пациента с коэффициентом перфорации 1:6-1:10, толщина собственной кожи пациента оставляет 0,3-0,6 мм, причем поверх нее укладывают целые лоскуты биологического эквивалента кожи клеточным слоем вниз.

Предложенный метод лечения позволяет значительно экономить ресурсы собственной кожи пациента и при этом ускоренно достигать клинического заживления раны.

Способ осуществляют следующим образом.

Выполняют хирургическую обработку раны с иссечением измененных краев, дна и стенок раны. После этого выполняют аутодермопластику, для чего используют перфорированный аутолоскут, толщина которого должна составлять 0,3-0,6 мм, с коэффициентом перфорации 1:6-1:10, в зависимости от закрываемой поверхности. После укладки лоскута аутокожи на раневое ложе и его фиксации поверх лоскута укладывают целые лоскуты биологического эквивалента кожи клеточным слоем вниз, перекрывая полностью все раневое ложе. Для предупреждения механического повреждения рану закрывают парафинизированной сетчатой защитной раневой повязкой. Использование цитотоксических антисептиков (на основе йода, перекиси водорода, марганцевокислого калия, бриллиантового зеленого) запрещается. Поверх защитной раневой повязки накладывается слой марлевой повязки, повязка фиксируется гипоаллергенным пластырем, бинтами.

Пример осуществления способа.

Пример 1. Больной Б. 29 лет. Диагноз: Термический ожог II-IV степени правого бедра и голени 10% (глубокого ожога 4%) поверхности тела.

Механизм травмы - воспламенение одежды при работе с горюче-смазочными материалами. На 3 сутки выполнена механическая некрэктомия с помощью дерматома. После некрэктомии - имеется раневые дефекты на наружных поверхностях бедра и голени на глубину до собственной фасции на бедре общим размером 12×8 см, на голени 8×5 см, далее - кровоточивость адекватная, жизнеспособность не вызывает сомнений. На 9 сутки после термической травмы, после достижения явных признаков начала второй фазы раневого процесса: нормализация температуры, купирование признаков системной воспалительной реакции, отторжения струпа и появление ранних грануляций запланирована оперативное закрытие раневой поверхности. Выполнена этапная некрэктомия по показаниям - удалены ткани с наличием признаков некроза. Забран участок собственной кожи с наружной поверхности левого бедра с помощью дерматома. Свободные лоскуты общим размером 5×2 см имел толщину 0,35 мм. Лоскут перфорирован с помощью перфоратора с коэффициентом перфорации 1:6. Раневые дефекты закрыты перфорированным расщепленным свободным трансплантатом.

Вся поверхность раны закрыты лоскутами БЭК. Лоскуты ориентированы клеточным слоем вниз.

Динамический контроль через 10 дней - приживление пересаженных лоскутов кожи и формирование отдельных очагов роста кожи. БЭК частично отторгся, частично сохранятся в промежутках между лоскутов в виде «корочек». Контроль через 17 суток от трансплантации - полная эпителизация ран. Рубец мягкий, подвижный, без трофических изменений.

Пример 2. Больной Р., 77 лет. Диагноз: обширная скальпированная рана правой голени. Ушиб грудной клетки. Механизм травмы - падение с высоты 6 метров. При падении - контакт кожи правой голени со стеной. При осмотре через 3 дня от момента травмы - на наружной поверхности левой голени имеется скальпированная рана V-образной формы с некрозом отслоенной кожи размером 9×11 см. На 17 сутки после травмы выполнена некрэктомия - образовалась рана, соответствующая размером кожного некроза, глубиной до жизнеспособной фасции и на участке 6×8 см.

В краях и дне раны имеются участки мозаичного некроза, что не гарантировало приживление трансплантата. Пластика местными тканями также была не возможна из-за обширности раны. Под общей анестезии с наружной поверхности левого бедра забран свободный кожный расщепленный лоскут размером 3×4 2×2 см, толщиной около 0,4 мм. Лоскут перфорирован с коэффициентом перфорации 1:6 Вся рана укрыта сплошными слоями БЭК, в том числе и на пересаженные лоскуты кожи. БЭК укладывалась с ориентацией клеточных слоев.

Динамический контроль через 9 дней - рана сократилась за счет краевой контракции, глубина раны на уровне кожи из-за нормотрофической грануляционной ткани, отмечается приживление аутодермотрансплантатов. Ярко выражена краевая эпителизация от краев раны и сформированных очагов роста кожи. Контроль через 21 суток от трансплантации - полная эпителизация раны. Рубец мягкий, подвижный, без трофических изменений.

Пример 3. Больная К., 67 лет. Диагноз: Сахарный диабет 2 типа. Нейро-ишемическая форма. Трофическая язва культи левой стопы, последствия выполненной ампутации 1-3 пальцев левой стопы на уровне плюсневых костей в связи с диабетической гангреной пальцев. Отмечено отсутствие нормотрофических грануляций и краевой эпителизации в течении 3 месяцев. После медикаментозной коррекции ишемии стопы и антибактериальной терапии на поверхность трофической язвы размерами 6×4 см трансплантирован перфорированный, расщепленный свободный трансплантат кожи с растяжением более чем в 1:8 раз. Лоскуты забраны с левого бедра дерматомом. Далее, все участки раны укрыты лоскутами БЭК.

Через 8 дней от трансплантации отмечено начало краевой эпителизации язвы. Пересаженные лоскуты выглядят большей частью жизнеспособными - имеют физиологическую окраску, фиксированы к ране. Из раны практически полностью отсутствует раневое отделяемое. Полная эпителизация язвы через 17 суток от начала лечения. Рубец плотный, позволяет использовать обувь, опороспособность стопы восстановлена.

Проведенные исследования позволяют выделить следующие преимущества заявляемого способа лечения ран:

- БЭК с клетками кожи человека используются в качестве постоянного биологического покрытия, которое обеспечивает подготовку раны к последующему полноценному лечению;

- трансплантация БЭК обеспечивает быстрый переход раневого процесса в продуктивную фазу;

- использование БЭК в комбинации с аутодермопластикой кожей, перфорированной от 1:6 до 1:10, позволяет добиться полного приживления аутологичного лоскута и эпителизации раны при ожогах IIIб-IV ст. и обширных поражениях в течение 10,2+3,6 в 90-100% случаев, тогда как при известном способе срок эпителизации составляет более 15 дней;

- успешное использование БЭК и аутокожи, перфорированной 1:6-1:10, позволяет сократить площадь донорского участка в 1,5 раза, что является жизненно важным для лечения больных с обширными и глубокими поражениями ожогами, у которых имеется дефицит неповрежденной кожи для трансплантации;

- применение заявляемого способа позволяет сократить число аутодермопластик за счет использования аутотрансплантата, перфорированного 1:6 и более, причем эффективность хирургического лечения при данном способе соответствует результатам аутокожи с перфорацией 1:4;

- использование МСК и/или культивированных фибробластов человека в сочетании с культурой кератиноцитов в составе БЭК позволяет осуществлять успешное пластическое закрытие ран даже в тех случаях, когда из-за обширности поражения использование сетчатых лоскутов аутокожи с широкой перфорацией (от 1:6 и до 1:10) самих по себе недостаточно для восстановления целостности кожных покровов;

Результаты лечения ран с помощью комбинирования аутодермопластики и трансплантации БЭК показали высокую эффективность предлагаемого способа, о чем говорят результаты наблюдения за 6 больными.