Результат интеллектуальной деятельности: Комплексный биологический инсектицидный препарат против непарного шелкопряда Lymantria dispar

Изобретение относится к комплексному биологическому инсектицидному препарату против личинок непарного шелкопряда (НШ) Lymantria dispar, являющихся опасным вредителем лесных и сельскохозяйственных культур и может быть использовано в микробиологической промышленности, биотехнологии, сельском и лесном хозяйстве.

Ежегодно насекомые уничтожают 18% годового производства сельскохозяйственных культур. Непарный шелкопряд (Lymantria dispar) широко распространен в Евразии, Северной Америке, Северной Африке, где периодически образует крупномасштабные вспышки массового размножения, поэтому его относят к группе наиболее опасных лесных филлофагов. Известно более 300 видов растений, которые может повреждать непарный шелкопряд (Бенкевич В.И., 1984). Помимо многочисленных сельскохозяйственных культур, непарный шелкопряд поражает также основные виды лесных растений, образующих основу лесных биоценозов. Эти насекомые периодически дают крупномасштабные вспышки массового размножения в различных частях своего ареала, иногда на площадях, исчисляемых в миллионах гектаров (Marshall, 1981; Harris, 1985). На территории России наибольшие по площади очаги среди дендрофильных насекомых образует непарный шелкопряд. Так, за последние 20 лет площадь его очагов в среднем ежегодно составляла 726 тыс. га (Матусевич, Гниненко, 2000).

В настоящее время для защиты растений от непарного шелкопряда используется ряд химических пестицидов (главным образом пиретроидов), а также биопрепарат Лепидоцид, биологической основой которого являются бактерии Bacillus thuringiensis, var. kurstaki (ТУ 64-15-03-87; авт. свидетельство СССР №769787).

Известен также жидкий инсектицидный препарат содержит споро-кристаллический комплекс Вас. thuringiensis var. kurstaki 1,5-2,5⋅10¹⁰ спор, натрий хлористый 0,4-0,5%, глицерин 5,0-10,0%, парафин нефтяной жидкий 16,5-24%, твин 1,5-2,5%, отдушку хвойную 0,1-0,2%, мыло хозяйственное 0,3-0,5%, неонол 1,7-2,3%, воду до 100% (патент РФ №2149551, МПК A01N 63/00, опубл. 27.05.2000 г.). Эффективность препарата против гусениц сибирского шелкопряда 5-6 возраста составляет 80-100%. Препарат может быть использован для борьбы с непарным шелкопрядом, с капустной и репной белянкой, капустной молью. Норма расхода препарата 0,5 л/га. Период защитного действия препарата при однократной обработке более 20 дней.

Однако данный бактериальный препарат очень широкого спектра действия и в рабочих концентрациях (расход препарата 0,5 л/га) при обработке растений наряду с вредителями леса, сада и огорода поражает таких полезных насекомых как пчел, жужелиц, божьих коровок.

Контроль численности непарного шелкопряда можно осуществлять также посредством обработок очагов вирусным препаратом, основой которого является вирус ядерного полиэдроза непарного шелкопряда (ВЯП НШ), относящийся к группе бакуловирусов.

Препарат содержит сухой вирусный порошок из лиофилизированных гусениц непарного шелкопряда с титром не менее (2-5)⋅10⁹ полиэдров/г и наполнитель в качестве которого используют цеолит или кремниевую кислоту (патент РФ №2117701, МПК A01N 63/00, опубл. 20.08.1998 г.). К преимуществам бакуловирусов, в сравнении с другими инсектицидами можно отнести их высокую вирулентность, специфичность и пролонгированную активность за счет развития эпизоотий в популяции непарного шелкопряда. Вирус может длительное время персистировать в геномах гусениц в латентном состоянии, а полиэдры могут годами сохранять жизнеспособные вирионы во внешней среде. Поскольку бакуловирусы способны к горизонтальной и вертикальной передаче, постольку даже однократная обработка бакуловирусами инициируют эпизоотию полиэдроза в популяции насекомых. Так, благодаря высокой избирательности бакуловируса ВЯП НШ, стал возможным контроль численности непарного шелкопряда с сохранением высокого видового разнообразия членистоногих в лесных биоценозах.

Тем не менее, производство вирусных препаратов, в частности, на основе ВЯП НШ, остается трудоемким процессом с высокой себестоимостью, из-за чего стоимость обработок вирусными препаратами выше, чем химическими. К недостаткам вирусного препарата можно отнести также замедленный эффект действия бакуловирусов, так как в первые 7-10 суток после обработки инфицированные гусеницы продолжают питаться и наносить ущерб растениям.

Известно использование для контроля численности калифорнийской люцерновой совки (Autographa californica) 3-х компонентного препарата, включающего бактерии (Bacillus thuringiensis), вирус ядерного полиэдроза Autographa californica и химический препарат хлорфенапир, относящийся к группе пиретроидов (патент Китая CN 108513989, МПК A01N 63/00, опубл. 11.09.2018 г.).

Однако данный комплексный препарат, помимо личинок Autographa californica, поражает ряд видов полезных насекомых, нарушая целостность видовой структуры агроценозов.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является двухкомпонентный (бинарный) биологический препарат против бабочки (Ectropis obliqua) из семейства гаечных (Geometridae), включающий бактерии Bacillus thuringiensis с содержанием от 3,0 до 25,0% и вирус ядерного полиэдроза с содержанием 1.0×10⁶-1.0×10¹⁰ PIB/mL, поражающий Ectropis oblique (патент Китая CN 101366395, МПК A01N 63/00, опубл. 18.02.2009 г.). Препарат дополнительно содержит такие добавки как поликарбоксилат, лигносульфонат натрия, диоктилсульфоянтарную кислоту, алкилсульфонат, белую углеродную сажу, натрий-магнийалюмоксантан, хлорид магния и алюминия, силикат-натрий карбоксиметилцеллюлозу, поливиниловый спирт, гликоль, пропандиол, кремнийорганический пеногаситель и воду, которые смешиваются в определенном соотношении. Средство не является вредным для окружающей среды и человека, не загрязняет окружающую среду.

Однако бинарный препарат-прототип имеет низкую эффективность против непарного шелкопряда, т.к. один из двух его компонентов, а именно вирус ядерного полиэдроза, поражающий Ectropis oblique не оказывает инсектицидное действие на личинки непарного шелкопряда Lymantria dispar, а второй его компонент на основе бактерий Bacillus thuringiensis имеет более низкий титр по сравнению с монопрепаратом, что снижает эффективность его действия по отношению к личинкам непарного шелкопряда Lymantria dispar.

Техническим результатом изобретения является создание комплексного препарата на основе вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда (ВЯП НШ) и бактерии Bacillus thuringiensis, позволяющего эффективно контролировать численность непарного шелкопряда при существенно меньшем расходе биоагентов, в сравнении с монопрепаратами.

Указанный технический результат достигается тем, что комплексный биологический инсектицидный препарат, включающий бактерии Bacillus thuringiensis, вирус ядерного полиэдроза, целевые добавки и воду, согласно изобретения, в качестве бактерий Bacillus thuringiensis он содержит Bacillus thuringiensis, var. kurstaki с титром не менее 1,0×10¹⁰ спор/мл, в качестве вируса ядерного полиэдроза - штамм НШ-07 вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Lymantria dispar L. с титром не менее 2×10⁹ полиэдров/мл, а в качестве целевых добавок он содержит глицерин, антиоксидант и стабилизатор спор бактерий, при следующем количественном содержании компонентов, мас.%:

В качестве антиоксиданта препарат содержит аскорбиновую кислоту, в качестве стабилизатора спор бактерий - хлористый натрий.

Штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Lymantria dispar L. НШ-07 используется для получения заявляемого комплексного инсектицидного препарата, депонированного в государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-799 (патент РФ №2662960). Штамм ВЯП НШ-07 выделен в августе 2015 г. из личинки непарного шелкопряда (гомогената гусеницы) лабораторной популяции, погибшей от активации латентной инфекции (Новосибирская область, Новосибирский район, р.п. Кольцово) с использованием метода слепого пятикратного пассирования образца на личинках (Lymantria dispar L.) путем заражения per os, и приготовления гомогената из погибших личинок после каждого пассажа.

Проведенные экспериментальные исследования показали, что в заявленном интервале концентраций бактериальный и вирусный компоненты действуют синергически, взаимно усиливая действие друг друга. Кроме того, взаимно компенсируются недостатки отдельных компонентов. Так, действие токсинов В. thuringiensis ускоряет гибель гусениц, в сравнении со сроками при применении вирусного монопрепарата, что сокращает ущерб от вредителя. В то же время, вирусный компонент обеспечивает избирательность и пролонгированность действия комбинированного препарата. Таким образом, комбинированный бактериально-вирусный инсектицид обладает высокой биологической эффективностью и скоростью действия, а также специфичностью и пролонгированностью действия, при существенно меньшем расходе.

Пример. 1

Пример. 2

Пример. 3

Описание технологии получения препарата.

Технология производства вирусного компонента комплексного препарата осуществляется по следующей схеме: выращивание насекомых, культивирование в них вирусов, сбор погибших гусениц, выделение вирусной биомассы и получение готового продукта.

Партию гусениц непарного шелкопряда по достижению ими четвертой возрастной стадии инфицируют вирусом ядерного полиэдроза (штамм НШ-07). Для этого искусственную питательную среду (корм) опрыскивают вирусной суспензией штамма НШ-07 (per. №V-799) с титром 1-2×10⁷ полиэдров/мл и скармливают зараженный корм гусеницам НШ. Гусениц НШ содержат при 28±1°С и влажности 65%. Время инкубирования инфицированных гусениц 11-12 дней. При этом гибель насекомых составляет не менее 75%. Затем личинки собирают и замораживают при минус 20°С в течение 18 часов, лиофилизируют и переносят в аппарат для удаления волосков, являющихся сильным аллергеном. Аппарат представляет собой специальный барабан для стряхивания волосков, которые затем удаляют посредством вакуумной системы. Лишенные волосков лиофилизированные гусеницы размалывают для получения сухого вирусного порошка.

Бактериальный компонент комплексного препарата приобретается в готовом виде под торговой маркой "Лепидоцид".

Компоненты препарата (примеры 1-3) в заявленных концентрациях подают в смеситель и получают жидкую форму комплексного препарата.

Ниже приведены данные лабораторных и полевых исследований, подтверждающие заявляемый технический результат.

Пример 4. Объектом исследования служили однодневные гусеницы 3-го возраста непарного шелкопряда. Инфекционные агенты, вирус и/или бактерии подмешивали в искусственный полужидкий корм и индивидуально скармливали гусеницам определенные дозы, соответственно, спор Bacillus thuringiensis, var. kurstaki и/или полиэдров (ПЭ), содержащих вирионы ВЯП НШ. На каждый вариант эксперимента брали 50 гусениц. Ежедневно учитывали количество живых и погибших гусениц. В данном эксперименте были испытаны следующие варианты: №1 - контроль, корм без добавок; №2 - бактерии - 3×10³ спор/гус.; №3 - вирус - 5×10³ ПЭ/гус.; №4 - комбинация бактерий и вируса - 3×10³ спор и 5×10³ ПЭ/гус; №5 - бактерии - 10⁴ спор/гус.; №6 - комбинация бактерий и вируса - 10⁴ спор и 5×10³ ПЭ/гус.

Доза вируса, равная 5×10³ ПЭ/гусеницу, приблизительно соответствует ЛД₅₀ для гусениц 3-го возраста для вирусного монопрепарата. В варианте №2 мы использовали дозу бактериальных спор в 2,5 раза меньшую (вариант №2, табл. 1), чем ЛД₅₀ для бактериального монопрепарата (равная 7,5×10³ спор/гусеницу). Эффективность бинарного препарата (вариант №4, табл. 1), приблизительно соответствует сумме эффектов монопрепаратов (№2 и №3). Мы видим, что компоненты бинарного препарата, с указанными выше концентрациями биоагентов, действуют аддитивно.

Увеличение дозы бактерий до 10⁴ спор/гус.(вариант №5, табл. 1) повышает эффективность бактериального монопрепарата до 95%. На этом фоне эффективность бинарного препарата (вариант №6, табл. 1) отличается несущественно, т.е. добавка вируса при данном расходе бактериального агента (10⁴ спор/гус.) становится экономически нецелесообразной. В обоих примерах (№4 и №6), бактериальный и вирусный агенты, вероятно, действуют независимо. Таким образом, показано, что доза бактериального агента в составе бинарного препарата не должна превышать значения 3×10³ спор/гус.

Пример 5. Процедура тестирования различных вариантов биопрепаратов проводилась согласно методике, описанной в примере 4. В данном эксперименте были испытаны следующие варианты вирусных монопрепаратов: №7 - 10³ ПЭ/гус.; №8 - 10² ПЭ/гус.; №9 - 33 ПЭ/гус. Бактериальный монопрепарат: №10 - 10³ спор/гус. А также бинарные препараты, где доза бактериального компонента уменьшена до 10³ спор/гус., а доза вируса была уменьшена в 5-150 раз: №11 - 10³ спор/гус. + 10³ ПЭ/гус.; №12 - 10³ спор/гус. + 10² ПЭ/гус.; №13 - 30 ПЭ/гус.

Эффективность вирусных монопрепаратов в низких концентрациях, 33-1000 полиэдров на гусеницу невелика, за 14 суток наблюдения гибнет 8-16% гусениц (табл. 2, варианты 7-9). Аналогичный эффект оказывает бактериальный монопрепарат в дозе 10³ спор/гусеницу (табл. 2, вариант №10). Тогда как под действием бинарных препаратов (табл. 2, варианты 11 и 12) динамика гибели гусениц существенно отличается. Видно, что уже в первые 6 суток гибнет от 62 до 74% гусениц. Тогда как суммарное действие чистых монопрепаратов в тех же концентрациях вызвало бы гибель лишь 16% гусениц. Таким образом, в вариантах №10 и №11 очевидным образом проявляется синергический эффект: гусеницы начинают гибнуть раньше, чем в вариантах 7 и 8 с чистым вирусом, а количество погибших гусениц на 6 сутки наблюдения приблизительно в 3,5 раза (62-74%) превышает суммарный эффект монопрепаратов в тех же концентрациях (20%). На 14 сутки наблюдения эффективность бинарных препаратов приблизительно в 2 раза превышает суммарную эффективность монопрепаратов. Таким образом, комбинация компонентов в указанных концентрациях действует значительно эффективнее, чем сумма независимых компонентов, что говорит в пользу версии о синергизме бактериального и вирусного компонентов.

Однако в варианте бинарного препарата №13 с дозой вируса 33 ПЭ/гус. эффективность заметно ниже. Синергический эффект заметен в первые 6 суток наблюдения, но итоговая эффективность, на 14 сутки наблюдения, не удовлетворительна (52%). Таким образом, цикл экспериментов, результаты которых отражены в таблице 2, показал, что минимальная концентрация вируса в бинарном препарате не должна быть менее 100 ПЭ/гус. Учитывая результаты экспериментов, описанных в примерах 4 и 5, мы приходим к выводу, что доза вирусного агента, в составе бинарного препарата должна находиться в интервале от 100 до 1000 ПЭ/гус. Дальнейшее уменьшение дозы приводит к недопустимому снижению эффективности, а увеличение свыше 1000 ПЭ/гус. экономически нецелесообразно, так как не приводит к заметному увеличению эффективности бинарного препарата.

Пример 6. Процедура тестирования различных вариантов биопрепаратов проводилась согласно методике, описанной в примере 4. В примерах 4 и 5 установлен приемлемый интервал доз для вирусного агента и верхний предел для дозы бактериального агента. В серии экспериментов, описанных в примере 3, мы исследовали интервал возможных дозировок бактериального агента в составе бинарного препарата из расчета, что расход препарата (состав по примеру 2) составляет 0,5 литра на 1 га. Были протестированы варианты дозировок бактериального монопрепарата: №14 -доза 3×10² спор/гус.; №15 - 5×10² спор/гус.; №16 - 2×10³ спор/гус. Данные дозы бактериального агента были использованы в составе заявляемых бинарных препаратов, при минимальной дозе вируса: №17 - 3×10² спор/гус. +10² ПЭ/гус.; №18 - 5×10² спор/гус. + 10² ПЭ/гус.; №19 - 2×10³ спор/гус. + 10² ПЭ/гус.

При тестировании бинарных препаратов (табл. 3, варианты 18-19) также наблюдается ярко выраженный синергический эффект: уже через 6 суток после инфицирования погибло 58-74% гусениц. Тогда как суммарное действие чистых монопрепаратов в тех же концентрациях вызвал бы лишь 10-12% смертность. На 14 сутки наблюдения эффективность бинарных препаратов №18 и №19 достигает приемлемого значения 84-94%. Однако в варианте №17 синергический эффект выражен слабее и конечная эффективность (48%) не удовлетворительна для практического применения. Отсюда следует, что минимальная доза бактериального агента в составе бинарного препарата не может быть меньше 500 спор на гусеницу.

Таким образом, в серии экспериментов установлено, что дозы бактериального и вирусного компонентов в составе бинарного препарата должны находиться в следующих пределах: от 100 до 1000 ПЭ/гус. для вирусного компонента и от 500 до 2000 спор/гус. для бактериального компонента. Бинарные препараты, содержащие вирусный и бактериальный агенты в указанных интервалах, обеспечивают достаточную, для практического применения эффективность (84-94%).

В описанных выше примерах было показано, что при высоких концентрациях бактериального и вирусного компонентов (близких к ЛД₅₀ для монопрепаратов) эффективность бинарного препарата приблизительно соответствует суммарной эффективности монопрепаратов. Вероятно, в этом случае бактериальный и вирусный биоагенты действуют независимо друг от друга. Однако при применении бинарного препарата, дозы биоагентов в котором уменьшены в 5-50 раз (в сравнении с дозами для монопрепаратов), компоненты бинарного препарата действуют синергически. Необходимо подчеркнуть, что синергический эффект проявляется только в определенном диапазоне концентраций бактериального и вирусного компонентов. Вероятно, в основе открытого нами явления синергизма, лежит механизм подавления антибактериальной защиты, запускаемый бакуловирусами. Так, в 2015 году в работе Crava СМ. с соавторами было показано, что прием внутрь бакуловируса привел к ингибированию антибактериального иммунитета гусениц Spodoptera exigua: транскрипция генов, кодирующих антимикробные пептиды и лизоцимы, была подавлена в течение 96 часов после инфицирования. Антимикробные пептиды и лизоцимы являются основными эффекторами иммунной системы насекомых, они участвуют как в локальных, так и системных реакциях. Среди местных реакций иммунная реакция средней кишки играет важную роль в борьбе с болезнетворными микроорганизмами, которые поступают перорально. Если предположить, что данный механизм работает и в кишечнике гусениц непарного шелкопряда, то становится понятным, почему в наших экспериментах гусеницы массово гибнут в первые 6 суток после применения бинарного препарата: причина в том, что в течение 4-х суток после введения вируса антибактериальный иммунитет не работает, делая гусениц уязвимыми даже для небольших доз бактериальных токсинов.

Пример 7. Применение бинарного препарата в полевых условиях. Испытания проводились в лесном массиве, находящемся в Шебалинском районе республики Алтай, в 2017 году. Гусеницы к моменту обработок находились в стадии 3 возраста. Обработки проводили с помощью аэрозольной установкой ГАРД на базе автомобиля Урал-4320. На двух участках, площадью 20 га (каждый) протестировали три варианта препаратов.

1. В - вирусный монопрепарат на основе ВЯП НШ, применяемый из расчета 4×10⁹ ПЭ/га.

2. Б1 - бинарный препарат, содержащий споры Bacillus thuringiensis, var. kurstaki и ВЯП НШ, применяемый из расчета, соответственно, 2×10¹² спор/га и 10¹⁰ ПЭ/га. В этом варианте, расход биоагентов был уменьшен, в сравнении с нормой (рекомендованной производителями монопрепаратов): расход бактериального компонента был уменьшен в 15 раз (норма - 3×10¹³ спор/га), расход вирусного компонента был уменьшен в 20 раз (норма - 2×10¹¹ ПЭ/га).

3. Б2 - бинарный препарат, содержащий споры Bacillus thuringiensis, var. kurstaki и ВЯП НШ, применяемый из расчета, соответственно, 6×10¹¹ спор/га и 4×10⁹ ПЭ/га. В этом варианте, расход биоагентов (вирусного и бактериального) был уменьшен, в сравнении с нормой в 50 раз.

Контролем (К) служили необработанные участки лесного массива.

Для оценки эффективности проведенных защитных мер использовали метод глазомерной оценки степени дефолиации крон с использованием контрольного участка, описанный в работе [Гниненко Ю.И. и др., Оценка эффективности применения исектицидов для защиты лесов. - 2015].

Сохранность листвы в кронах деревьев оценивалась на заранее выбранных учетных пунктах и контрольных участках через 1 месяц после проведения обработки. На каждом учетном пункте анализировали степень объедания листвы не менее чем на 50 деревьях и находили среднюю степень объедания крон. Такой же учет осуществляли на контрольных участках, на котором меры защиты не были проведены. Защитный эффект определяли по формуле:

Z_эф = Д_к-Д_о,

где:

Z_эф - защитный эффект, %;

Д_к - дефолиация крон на контрольном участке, %;

Д_о - то же на опытном участке, %.

На участках, на которых проводились обработки бинарными препаратами, содержащим споры Bacillus thuringiensis, var. kurstaki и ВЯП НШ: на участке Б1 степень объедания листвы составляла от 0% до 10%, на участке Б2 степень объедания листвы составляла от 5% до 15%. В случае использования вирусного монопрепарата (В) на основе ВЯП НШ в низкой концентрации степень объедания листвы составляла от 30% до 60%. На контрольных участках объедание листвы достигало 50 - 70% (таблица 4).

Согласно приведенной выше формуле, защитный эффект от проведенных лесозащитных мер составил в варианте Б1 от 40% до 65%, в варианте Б2 от 45% до 60%, а в варианте В от 10 до 25%.

Обследование, проведенное весной следующего после обработки года показало, что в радиусе 10 км от места обработки непарный шелкопряд встречается крайне редко, в тоже время, на расстоянии 50 км от места обработки, численность непарного шелкопряда была очень высокой.