Результат интеллектуальной деятельности: (2Z)-2-[(4α, 5α, 8α, 9β, 13α, 14β, 16β)-16-(АЦЕТИЛОКСИ)-3(Z),11(E)-БИС(ГИДРОКСИИМИНО)-4,8,10,14-ТЕТРАМЕТИЛГОНАН-17-ИЛИДЕН]-6-МЕТИЛГЕПТ-5-ЕНОВАЯ КИСЛОТА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И АНТИМИКРОБНЫЕ СВОЙСТВА

Изобретение относится к области синтеза биологически активных аналогов природных соединений, а именно к получению (2Z)-2-[(4α, 5α, 8α, 9β, 13α, 14β, 16β)-16-(ацетилокси)-3(Z), 11(E)-бис(гидроксиимино)-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден]-6-метилгепт-5-еновой кислоты формулы (1), обладающей высокой активностью по отношению к Staphylococcus aureus (MRSA):

Известен способ получения метил-3-О-ацетил-11(E)-гидроксиимино-24,25-дигидрофузидата (3) и метил-3-гидроксиимино-24,25-дигидрофузидата (5) (соотношение Е- и Z-изомеров 10:1, соответственно), заключающийся во взаимодействии метилового эфира 3-O-ацетил-11-оксо-24,25-дигидрофузидовой кислоты (2) или метилового эфира 24,25-дигидрофузидовой кислоты (4) с 3 эквивалентами гидроксиламин гидрохлорида в метаноле при 20°С в присутствии ацетата калия (схема 1) [Murphy W.S., Sarsam В., Ferguson G., Gallagher J.F. Azasteroids derived from fusidic acid. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1998, 4121-4128].

Таким образом, синтез 3(Z),11(E)-бис(гидроксиимино)-производного фузидовой кислоты в литературе не описан.

Антимикробное и противогрибковое действие данных соединений на штаммах возбудителей бактериальных и грибковых инфекций человека и животных изучено не было.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения нового соединения - (2Z)-2-[(4α, 5α, 8α, 9β, 13α, 14β, 16β)-16-(ацетилокси)-3(Z),11(E)-бис(гидроксиимино)-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден]-6-метилгепт-5-еновой кислоты, исследование in vitro ее антимикробных и противогрибковых свойств.

Синтез заявленного соединения (1) осуществляли следующим образом: 3,11-диоксопроизводное фузидовой кислоты (6) вовлекали во взаимодействие с 6 эквивалентами гидроксиламин гидрохлорида в среде сухого пиридина при кипячении в течение 2 часов (схема 2). После выделения и хроматографической очистки, получали диоксииминопроизводное (1) с выходом 95%, которое представляло собой кристаллическое вещество светло-желтого цвета (т.пл. 179-181°С), (с 1.13, CHCl₃). Структура соединения (1) установлена с помощью 1D и 2D спектроскопии ЯМР ¹Н и ¹³С и масс-спектрометрии MALDI TOF/TOF.

Преимущества предлагаемого способа:

В известном способе для получения оксииминопроизводных (3) и (5) в качестве исходных соединений используются монооксо-производные метилового эфира 24,25-дигидрофузидовой кислоты (2) и (4), синтезируемые из нативной фузидовой кислоты в 4 или 3 стадии, соответственно; целевое соединение (5) получено в виде смеси стереоизомеров (схема 1).

В отличие от известного, в предлагаемом способе исходным соединением является 3,11-диоксопроизводное, синтезируемое из фузидовой кислоты в 1 стадию; предлагаемый метод позволяет получать 3(Z),11(E)-бис(гидроксиимино)-производное (1) в виде индивидуального стереоизомера с количественным выходом (схема 2).

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1. К раствору 1 г (1.6 ммоль) соединения (6) в 50 мл сухого пиридина добавляли 0.67 г (9.6 ммоль) гидроксиламина солянокислого. Смесь нагревали при температуре 115°С в течение 2 ч и выливали в ледяную воду, подкисленную 5% соляной кислотой. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой, сушили на воздухе. Выход соединения (1) 1.01 г (95%), кристаллы светло-желтого цвета. Т.пл. 179-181°С, (с 1.13, CHCl₃).

Спектральные характеристики (2Z)-2-[(4α, 5α, 8α, 9β, 13α, 14β, 16β)-16-(ацетилокси)-3(Z),11(E)-бис(гидроксиимино)-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден]-6-метилгепт-5-еновой кислоты (1)¹.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃), δ, м.д.: 1.01 с (3Н, Н¹⁹), 1.07 с (3Н, H¹⁸), 1.11 д (3Н, Н²⁸, ³J 6.6 Гц), 1.16 с (3Н, Н³⁰), 1.20-1.26 м (1Н, Н⁶), 1.20-1.31 м (1Н, Н⁷), 1.30-1.46 м (1Н, H¹⁵), 1.53-1.71 м (1Н, Н⁶), 1.63 с (3Н, Н²⁷), 1.68 с (3Н, Н²⁶), 1.83 т (1Н, H⁵, ³J 10.6 Гц), 1.97-2.10 м (1Н, Н¹²), 1.99-2.08 м (1H, Н⁷), 2.00 с (3Н, Н³²), 2.05-2.20 м (2Н, H²³), 2.09-2.21 м (1Н, Н²), 2.09-2.23 м (1Н, Н¹⁵), 2.09-2.24 м (1Н, Н¹), 2.24-2.37 м (1Н, Н²), 2.39-2.53 м (1Н, H¹), 2.40-2.49 м (1Н, Н²²), 2.54 с (1Н, Н⁹), 2.54-2.65 м (1Н, Н²²), 2.55-2.64 м (1Н, Н¹³), 2.70-2.75 м (1Н, Н⁴), 4.07 дд (1Н, Н¹², ³J 4.8 Гц, ²J 15.2 Гц), 5.19 т (1Н, Н²⁴, ³J 7.4 Гц), 5.85 д (1Н, Н¹⁶, ³J 8.4 Гц).

Спектр ЯМР, ¹³С (CDCl₃), δ, м.д.: 14.65 (С²⁸), 17.25 (С¹⁸), 17.96 (С²⁷), 20.83 (С³²), 21.44 (С⁶), 23.89 (С³⁰), 24.43 (С¹⁹), 25.65 (С¹²), 25.74 (С¹), 26.14 (С²⁶), 29.05 (C²³), 30.07 (С²²), 33.95 (С⁴), 34.85 (С²), 35.03 (С⁷), 37.95 (С¹⁰), 39.36 (С¹⁵), 40.83 (С⁸), 45.86 (С⁵), 46.48 (C¹³), 50.07 (С¹⁴), 51.61 (С⁹), 75.69 (С¹⁶), 124.31 (С²⁴), 133.06 (С²⁰), 133.75 (С²⁵), 147.53 (С¹⁷), 157.23 (С¹¹), 168.66 (C³), 172.56 (С³¹), 173.76 (С²¹). Масс-спектр (MALDI TOF/TOF), m/z (I_отн., %): 543 (100) [М+Н]⁺, 581 (49.1) [М+K]⁺.

¹Контроль реакции осуществляли методом ТСХ на пластинах Sorbfil (Сорбполимер, Краснодар, Россия), проявляли 10% раствором серной кислоты. Для колоночной хроматографии использовали силикагель L (50-160 мкм) марки КСКГ. Температура плавления определена на приборе РНМК 80/2617. Спектры ЯМР 1D (¹Н, ¹³С) и 2D (COSY, NOESY, HSQC, НМВС) сняты на спектрометре Bruker Avance 500 (125.78 МГц для ¹³С и 500.17 МГц для ¹Н) с использованием стандартных импульсных последовательностей фирмы Bruker, внутренний стандарт Me₄Si, растворитель - CD₃OD. Оптические углы измерены на поляриметре Perkin-Elmer 341. Масс-спектры MALDI TOF/TOF получены на спектрометре Bruker Autoflex ТМ III Smartbeam с использованием матрицы 3-(4-гидрокси-3,5-диметоксифенил)проп-2-еновой кислоты (синапиновая кислота).

Для установления стереохимии оксимино-групп, соединение (1) вовлекали в реакцию метилирования с MeJ в присутствии NaH в среде сухого тетрагидрофурана, в результате которой было выделено производное (7) (схема 3). На основании спектров NOESY соединения (7) было установлено, что полученный диоксим имеет 3(Z),11(E)-конфигурацию.

Пример 2. К раствору 2 г (3.7 ммоль) соединения (1) в 50 мл сухого тетрагидрофурана добавляли 0.27 г (11.2 ммоль) гидрида натрия. Перемешивали 30 мин при комнатной температуре и добавляли 0.2 мл (3.7 ммоль, 0.5 г) йодметана. Смесь нагревали при температуре 66°С в течении 2 ч и выливали в ледяную воду. Выпавший осадок фильтровывали, промывали водой до нейтральной рН, сушили на воздухе. Выход соединения (7) 1.89 г (90%), кристаллы белого цвета. Т.пл. 142-144°С, (с 0.94, CHCl₃).

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃), δ, м.д.: 1.07 д (3Н, Н²⁸, ³J 6.5 Гц), 1.16 с (3Н, H³⁰), 1.16-1.35 м (1Н, Н⁷), 1.17-1.26 м (1Н, H⁶), 1.19 с (3Н, Н¹⁹), 1.23 с (3Н, H¹⁸), 1.26-1.47 м (1Н, H¹⁵), 1.50-1.71 м (1Н, Н⁶), 1.64 с (3Н, Н²⁷), 1.69 с (3Н, Н²⁶), 1.91-2.06 м (1Н, Н⁷), 1.98-2.10 м (1Н, Н¹²), 1.99 с (3Н, Н³²), 2.06-2.30 м (2Н, Н²³), 2.06-2.40 м (2Н, Н²), 2.07-2.26 м (1Н, H¹⁵), 2.11-2.27 м (1Н, Н¹), 2.32-2.57 м (2Н, Н²²), 2.39-2.52 м (1Н, Н¹), 2.54 с (1Н, Н⁹), 2.55-2.66 м (1Н, Н⁵), 2.59-2.73 м (1Н, Н⁴), 2.96 дд (1Н, Н¹³, ³J 3.5 Гц, ³J 13.0 Гц), 3.79 с (3Н, Н³⁴), 3.86 с (3Н, Н³³), 3.94 дд (1Н, Н¹², ³J 4.5 Гц, ²J 11.0 Гц), 5.16 т (1Н, Н²⁴, ³J 6.3 Гц), 5.84 д (1Н, Н¹⁶, ³J 8.4 Гц).

Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃), δ, м.д.: 13.58 (С²⁸), 15.80 (С¹⁸), 16.51 (С²⁷), 19.35 (С³²), 19.89 (С⁶), 21.98 (С³⁰), 23.17 (С¹⁹), 24.89 (С¹²), 24.28 (С¹), 24.71 (С²⁶), 27.57 (С²³), 28.65 (С²²), 32.92 (С⁴), 33.46 (С²), 33.32 (С⁷), 36.43 (С¹⁰), 37.82 (C¹⁵), 40.58 (С⁸), 44.88 (C⁵), 46.37 (С¹³), 48.50 (С¹⁴), 50.23 (С⁹), 60.08 (С³⁴), 60.55 (С³³), 74.08 (С¹⁶), 122.87 (С²⁴), 132.20 (С²⁰), 132.31 (С²⁵), 145.91 (С¹⁷), 156.10 (С¹¹), 167.00 (С³), 170.95 (C³¹), 172.01 (С²¹). Масс-спектр (MALDI TOF/TOF), m/z (I_отн., %): 571 (100) [М+H]⁺ 609 (35.5) [М+K]⁺.

Противомикробный скрининг соединения (1) проводили в CO-ADD (The Community for Antimicrobial Drug Discovery), финансируемым Wellcome Trust (Великобритания) и Университетом Квинсленда (Австралия), на пяти бактериальных штаммах: Escherichia coli (Е. coli) АТСС 25922, Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) АТСС 700603, Acinetobacter baumannii (A. baumannii) ATCC 19606, Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ATCC 27853 и Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC 43300. Противогрибковую активность определяли на двух грибковых штаммах: Candida albicans (С. albicans) АТСС 90028 и Cryptococcus neoformans (С. neoformans) АТСС 208821.

Первичный скрининг противомикробной активности проводился путем тестов на ингибирование размножения клеток, используя образцы в одной (32 мкг/мл) концентрации. Аликвоту каждого образца в ДМСО помещали в 384-луночный планшет и обрабатывали соответствующей бактериальной культурой. Ингибирование роста бактерий определяли измерением поглощения при 600 нм (OD600) с использованием монохромного считывателя микропланшетов Tecan M1000 Pro. Процент ингибирования роста рассчитывали для каждой лунки с использованием отрицательного контроля (только для среды) и положительного контроля (бактерии без ингибиторов) на той же пластинке. В случае если один или оба раза наблюдалось ингибирование роста ≥80%, соединение считалось активным (Таблица 1).

При первичном скрининге было выявлено наличие противомикробной активности у (2Z)-2-[(4α, 5α, 8α, 9β, 13α, 14β3, 16β)-16-(ацетилокси)-3(Z),11(E)-бис(гидроксиимино)-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден]-6-метилгепт-5-еновой кислоты (1) в отношении культуры бактерий Staphylococcus aureus. Для соединения (1) была определена минимальная ингибирующая концентрация в отношении вышеуказанной культуры, а также изучена цитотоксическая и гемолитическая активности.

Минимальную ингибирующую концентрацию (MIC; мкг/мл) устанавливали в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards Institute), определяя самую низкую концентрацию, при которой было обнаружено полное ингибирование бактерий или грибов. Тесты проводились в двойном повторе. Максимальный процент ингибирования роста обозначался как DMax. Хиты были классифицированы при MIC ≤ 16 мкг/мл или MIC ≤ 10 мкМ в любой реплике (n=2 на разных пластинах).

Цитотоксическое действие определяли на клеточной линии эмбриональных почек человека HEK293 путем определения концентрации, вызывающей гибель 50% клеток (Hk СС₅₀). Ингибирование роста клеток HEK293 определяли, измеряя флуоресценцию после добавления 5 мкл 25 мкг/ мл резазурина (конечная концентрация 2.3 мкг/мл) и после инкубации в течение еще 3 ч при 37°С в 5% СО₂. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием монохромного считывателя Tecan M1000 Pro с использованием автоматического вычисления коэффициента усиления. Максимальный процент цитотоксичности обозначали как DMax. Соединение считалось токсичным при СС₅₀ ≤ 32 мкг / мл или СС₅₀ ≤ 10 мкМ. Кроме того, образцы были отмечены как частичные цитотоксические, если DMax ≥ 50%, даже при СС₅₀ выше максимальной тестируемой концентрации.

Гемолитическую активность (Hm НС₁₀ и НС₅₀ - концентрация при 10% и 50% гемолизе, соответственно) определяли путем измерения поглощения при 405 мм супернатанта - надосадочной жидкости, образованной после инкубации в течение 1 ч при 37°С планшетов, содержащих образцы соединений с добавленными к ним промытыми клетками крови человека, и последующего центрифугирования при 1000 об/мин в течение 10 мин. Абсорбцию измеряли с использованием монохромного считывателя Tecan M1000 Pro.

Максимальный процент гемолиза представлен как DMax. Низкое значение DMax при НС₁₀ > 32 мкг/мл (максимально испытанная концентрация) указывает на образцы без гемолитической активности. Образцы, обладающие гемолитической активностью, были охарактеризованы при НС₁₀ ≤ 32 мкг/мл. Кроме того, образцы были помечены как частично гемолитические, если DMax ≥ 50%, даже при НС₁₀ > максимальной тестируемой концентрации.

«Колистин» и «Ванкомицин» были использованы в качестве положительных стандартов бактериального ингибирования для грамотрицательных и грамположительных бактерий, соответственно. «Флуконазол» использовали в качестве стандартного ингибитора гриба для С. albicans и С. neoformans. «Тамоксифен» использовали в качестве положительного стандарта цитотоксичности. «Мелиттин» использовали в качестве положительного гемолитического стандарта.

Образец (2Z)-2-[(4α, 5α, 8α, 9β, 13α, 14β, 16β)-16-(ацетилокси)-3(Z),11(E)-бис(гидроксиимино)-4,8,10,14-тетраметил гонан-17-илиден]-6-метилгепт-5-еновой кислоты (1) в концентрации 4.0 мкг/мл показал противомикробную активность, ингибируя рост и размножение >100% грамположительных бактерий Staphylococcus aureus. Гемолитическая активность соединения (1) не превышает 6.3% даже при максимально тестируемой концентрации >32 мкг/мл, что ниже таковой у фузидовой кислоты в 1.5 раза. Цитотоксичность соединения (1) сравнима с фузидовой кислотой (Таблица 2).

Таким образом, соединение (1) проявляет противомикробную активность в отношении патогенных микроорганизмов Staphylococcus aureus при низкой токсичности и обладает минимальным гемолитическим действием при максимально тестируемой концентрации.