Способ получения 1-(3-гидрокси, 28-ацетоксилуп-20(29)-ен-30-ил)-пиридиний бромида и его применение в качестве средства с антибактериальной и противогрибковой активностью

Предлагаемое изобретение относится к области синтеза соединений с биологической активностью, конкретно, к способу получения 1-(3-гидрокси,28-ацетоксилуп-20(29)-ен-30-ил)-пиридиний бромида (1).

Известен способ (R. Csuk, K. Schmuck, R. Tetrahedron Lett., 2006, 47, 8769) получения бетулиналя (2) окислительной трансформацией бетулина системой TEMPO (2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1-оксил)/NaClO₂/NaOCl, CH₂Cl₂/PBS, ТВАВ, рН 6.8 при 35°С.

Известным способом не может быть получен 1-(3-гидрокси,28-ацетоксилуп-20(29)-ен-30-ил)-пиридиний бромид (1).

Известен способ (A. Barthel, S. Stark, R. Csuk. Tetrahedron, 2008, 64, 9225) получения бетулиновой кислоты (3) окислительной трансформацией бетулина системой acetamido-TEMPO/NaClO₂/NaOCl, BuAc/PBS, ТВАВ, рН 7.6 при 50°С.

Известным способом не может быть получен 1-(3-гидрокси,28-ацетоксилуп-20(29)-ен-30-ил)-пиридиний бромид (1).

Известен (М. Sundararaman, R.R. Kumar, P. Venkatesan, A. Ilangovan. Journal of Medical Microbiology. 2013, 62, 241) гомологичный ряд 1-алкил-(N,N-диметиламино)пиридиний бромидов (4), проявляющих антибактериальную и противомикробную активность, которые подавляют рост и развитие таких бактерий, как Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus и Salmonella typhi, а также грибов рода Candida - С. albicans, С. glabrata, С. tropicalis и С. krusei.

Известно (Р.А. Krasutsky, D. Avilov, Т. Sergeeva, D.A. Krasutsky, O. Kolomitsyna. Patent US 7,410,958 B2, 2008) пиридиновое производное бетулина (5), которое может быть использовано для лечения или предупреждения грибковых и бактериальных инфекций сельскохозяйственных растений (схема 1).

Схема 1

Синтез соединения (5) осуществляется многостадийным способом и базируется на использовании труднодоступных и дорогостоящих реагентов. Антимикробное и противогрибковое действие данного соединения на штаммах возбудителей грибковых и бактериальных инфекций человека и животных изучено не было.

Предлагается новый способ получения 1-(3-гидрокси,28-ацетоксилуп-20(29)-ен-30-ил)-пиридиний бромида (1) в одну препаративную стадию из доступных исходных реагентов. Соединение формулы (1) может быть использовано в качестве антибактериального и противогрибкового средства.

Сущность способа заключается во взаимодействии 28-ацетата бетулина с ТЕМРО⁺Br₃^-, взятых в мольном соотношении 28-ацетат бетулина : ТЕМРО⁺Br₃^- = 1:(2.0-2.5) в среде пиридина в течение 2 ч при комнатной температуре (~20°С) и атмосферном давлении. Выход 1-(3-гидрокси,28-ацетоксилуп-20(29)-ен-30-ил)-пиридиний бромида (1) составляет 95%. Реакция протекает по схеме:

1-(3-гидрокси,28-ацетоксилуп-20(29)-ен-30-ил)-пиридиний бромид (1) образуется только лишь с участием 28-ацетата бетулина и ТЕМРО⁺Br₃^-, взятых в мольном соотношении (2.0-2.5) (стехиометрические количества). При другом соотношении исходных реагентов снижается выход целевого продукта (1).

Реакцию проводили при комнатной температуре ~20°С. При температуре выше 20°С (например, 60°С) увеличиваются энергозатраты, а при температуре ниже 20°С (например, при 0°С) снижается скорость реакции. Опыты проводили в среде пиридина, т.к. в нем хорошо растворяются исходные соединения и одновременно он является реагентом, принимающим участие в реакции.

Способ обеспечивает получение тритерпенового соединения (1), обладающего выраженной антибактериальной и противогрибковой активностью в отношении Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans и Cryptococcus neoformans.

Противомикробный скрининг проводили в СО-ADD (The Community for Antimicrobial Drug Discovery), финансируемым Wellcome Trust (Великобритания) и Университетом Квинсленда (Австралия), на пяти бактериальных штаммах: Escherichia coli (Е. coli) АТСС 25922, Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) АТСС 700603, Acinetobacter baumannii (A. baumannii) АТСС 19606, Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ATCC 27853 и Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC 43300. Противогрибковую активность определяли на двух грибковых штаммах: Candida albicans (С. albicans) АТСС 90028 и Cryptococcus neoformans (С. neoformans) АТСС 208821. Исследования проводили в концентрации 32 мкг/мл. Для испытаний использовали растворы (1) в ДМСО. Растворитель ДМСО не оказывал негативного воздействия на развитие исследуемых бактерий и грибов. Процент ингибирования роста был рассчитан для каждой лунки, используя отрицательный контроль (только среда) и положительный контроль (бактерии без ингибиторов). Все тесты были продублированы.

Общая методика оценки антибактериальной активности соединения (1).

Оценку антибактериальной активности проводили методом серийных разведений. Все бактерии культивировались в модифицированном агаре Мюллера Хинтона при 37°С в течение ночи. Образец каждой культуры затем разводили в 40 раз в свежем агаре и инкубировали при 37°С в течение 1.5-3 ч. Полученные культуры добавляли в каждую лунку 384-луночного планшета, содержащую исследуемый образец в ДМСО в тестовой концентрации 32 мкг/мл (плотность клеток 5×10⁵ КОЕ/мл и общий объем 50 мл). Все планшеты накрывали и инкубировали при 37°С в течение 18 ч без встряхивания. Ингибирование роста бактерий определяли измерением поглощения при 600 нм (OD₆₀₀) с использованием монохромного считывателя микропланшетов Tecan M1000 Pro. Процент ингибирования роста рассчитывали для каждой лунки с использованием отрицательного контроля (только для среды) и положительного контроля (бактерии без ингибиторов на той же пластине). Значения ингибирования определяли с помощью модифицированных Z-показателей, рассчитанных с использованием медианы и медианного абсолютного отклонения (MAD) образцов (без контроля) на той же пластине. Образцы с величиной ингибирования выше 80% и Z-оценкой выше 2.5 для обеих реплик классифицировались как активные соединения. Образцы с показателями ингибирования от 50 до 80% и Z-оценкой выше 2.5 для обеих реплик классифицировались как частично активные соединения.

Общая методика оценки противогрибковой активности соединения (1).

Грибковые штаммы культивировали в течение 3 дней на питательной среде YPD (дрожжевой экстракт-пептон-декстроза) при 30°С, дрожжевая суспензия 1×10⁶-5×10⁶ КОЕ/мл (что установлено OD530) была подготовлена из пяти колоний. Впоследствии суспензию разбавляли и добавляли в каждую лунку, содержащую соединение (1), доводя конечную плотность клеток суспензии грибов до 2.5×10³ КОЕ/мл и общий объем до 50 мл. Все планшеты покрывали и инкубировали при 35°С в течение 36 ч без встряхивания.

Образец 1-(3-гидрокси, 28-ацетоксилуп-20(29)-ен-30-ил)-пиридиний бромида (1) в концентрации 32 мкг/мл показал противомикробную активность, ингибируя рост и размножение ≥ 90% в отношении как грам-положительных бактерий Staphylococcus aureus, так и грам-отрицательных штаммов Pseudomonas aeruginosa; в отношении грибов вида Candida albicans наблюдается 100% ингибирование роста и развития, а вида Cryptococcus neoformans var. grubii 82% ингибирование (Таблица 1).

Таким образом, 1-(3-гидрокси, 28-ацетоксилуп-20(29)-ен-30-ил)-пиридиний бромид (1) проявляет противомикробную активность в отношении грам-положительных бактерий Staphylococcus aureus и грам-отрицательных штаммов Pseudomonas aeruginosa, а также обладает фунгицидными свойствами в отношении грибов вида Candida albicans и Cryptococcus neoformans var. grubii.

Существенные отличия предлагаемого способа:

В известном способе для получения пиридинового производного бетулина (5) в качестве исходного соединения используется С30-бром диацетат бетулина, получаемый из нативного бетулина в 3 стадии, а также нагревание до 80°С в среде аргона (Схема 1).

В предлагаемом способе исходными реагентами являются С28-ацетат бетулина и ТЕМРО⁺Br₃^- в пиридине. В отличие от известного, предлагаемый способ позволяет получать 1-(3-гидрокси,28-ацетоксилуп-20(29)-ен-30-ил)-пиридиний бромид (1), обладающий антибактериальной и противогрибковой активностью, в одну препаративную стадию.

Способ поясняется примерами:

Пример 1. К раствору исходного тритерпеноида (0.1 ммоль) в 2 мл пиридина при перемешивании прибавили Tempo⁺Br₃^- (0.20-0.25 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 2 часа (контроль ТСХ), по окончании реакции смесь упаривали, многократно разбавляя EtOAc, сушили в вакууме. Полученный остаток хроматографировали на колонке с SiO₂ (элюент - гексан: EtOAc, 30:1→1:1; CHCl₃; МеОН) получили соединение 1 с выходом 95%.

Другие примеры, подтверждающие способ, приведены в таблице 2.

Все опыты проводили в среде пиридина при комнатной температуре (~20°С).

Спектральные характеристики 1-(3-гидрокси,28-ацетоксилуп-20(29)-ен-30-ил)-пиридиний бромида¹ (¹ Контроль реакции осуществляли методом ТСХ на пластинах Sorbfil (Сорбполимер, Краснодар, Россия), проявляли анисовым альдегидом в этаноле. Для колоночной хроматографии использовали силикагель L (50-160 мкм) марки КСКГ. Температура плавления определена на приборе РНМК 80/2617. Спектры ЯМР 1D (¹Н, ¹³С) и 2D (COSY, NOESY, HSQC, НМВС) сняты на спектрометре Bruker Avance 400 (125.78 МГц для ¹³С и 500.17 МГц для ¹Н) по стандартным методикам фирмы Bruker, внутренний стандарт Me₄Si, растворитель - CD₃OD. Масс-спектры химической ионизации при атмосферном давлении (ХИАД) образцов были получены на квадрупольном жидкостном хромато-масс-спектрометре LCMS-2010 EV (Shimadzu) (шприцевой ввод образца, раствор в метаноле, элюент - метанол/вода в соотношении 95/5, скорость потока 0.1 мл/мин) в режиме регистрации положительных ионов при потенциале капилляра 4.5 кВ. Температура капилляра интерфейса 250°С, температура нагревателя 200°С, температура испарителя 230°С. Скорость потока небулизирующего (распыляющего) газа (азот) 2.5 л/мин.):

Т.пл.=296-298°С (МеОН). ЯМР ¹Н (CD₃OD, δ, м.д., J/Гц,) 0.70-2.45 (m, 39Н, СН, СН₂ бетулина), 0.78, 0.88, 0.98, 1.06, 1.09 (все с, по 3Н, Н23-27), 2.07 (s, 3Н, Ас), 3.15 (дд, ³J=5, ³J=11.5, 1H, Н3), 3.83, 4.38 (оба д, ³J=11.2, 2Н, Н28), 4.72, 5.28 (оба уш.с, 2Н, Н29), 5.32, 5.35 (оба д, ²J=15.1, 2Н, Н30), 8.20 (т, ³J=7.2, 2Н, Ру), 8.69 (т, ³J=7.8, 1Н, Ру), 9.05 (д, ³J=5.8, 2Н, Ру). ЯМР ¹³С (CD₃OD, δ, м.д.): 13.8314.76, 15.16, 15.30, 27.24 (5СН₃, С23-27); 18.03-55.35 (тритерпеновый каркас); 61.87 (С28); 65.59 (С30); 78.19 (С3); 112.58 (С29); 128.29, 145.33, 146.23 (Ру); 149.61 (С20); 171.80 (Ac). APCI MS (m/z): 562 [М-Br]⁺. C₃₇H₅₆BrNO₃. М642.749.