×
01.07.2020
220.018.2d9c

СПОСОБ СОКУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ IN VITRO МОДЕЛИ ГЕМАТО-ЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области медицины. Предложен способ сокультивирования iPS-EC клеток, перицитов и астроцитов для формирования клеточной модели гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Перициты засевают на нижнюю поверхность мембраны, покрытой внеклеточным матриксом, в плотности 2,5⋅10 клеток/см. Незрелые iPS-EC клетки засевают на слой из перицитов в отношении 1 лунка 6-луночного планшета с незрелыми iPS-EC клетками на 24 мембранные вставки 96-луночного планшета в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты. Засевают астроциты на верхнюю (внутреннюю) сторону мембранной вставки в плотности 2,5⋅10 клеток/см в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты. Через 24 часа меняют среду на ЕС питательную среду без добавок, инкубируют еще 24 часа. Изобретение обеспечивает создание моделей ГЭБ in vitro. 2 ил.
Реферат Свернуть Развернуть

Настоящее изобретение относится к клеточной биотехнологии, а именно касается способа со культивирования клеток для создания моделей гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) для изучения транспорта и токсичности лекарственных средств in vitro.

В частности, заявляемое изобретение может быть реализовано в высокопроизводительных скринингах способности проникновения ксенобиотиков и лекарственных средств через ГЭБ.

Заявляемое решение может быть использовано в более широкой области для изучения миграции клеток или для исследования влияния различных химических веществ на клетки в условиях in vitro.

Из уровня техники известен патент WO 9105038, в котором описана модель ГЭБ, состоящая из конфлюентного монослоя микроваскулярных эндотелиальных клеток из любого позвоночного, культивируемых на пористой мембране в среде обогащенной факторами, выделяемыми астроцитами, или сокультивируемых с астроцитами, находящимися в нижнем компартменте.

Из уровня техники известен патент WO 2007072953, в котором описывается модель, состоящая из эндотелиальных клеток, культивируемых в присутствии перицитов и астроцитов. В данной модели первичные микроваскулярные эндотелиальные клетки мозга крысы высаживаются на верхнюю поверхность мембраны, а перициты культивируются на обратной стороне мембраны; первичные астроциты высаживают на дно нижнего компартмента.

Из уровня техники известен патент US 2008044847, описывающий модель, в которой первичные микроваскулярные эндотелиальные клетки мозга или эндотелиальные клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток, культивируются совместно с нейрональными прогениторными клетками.

Недостатками вышеописанных способов является использование в них первичных культур видов отличных от человека, что может вызывать видоспецифические различия в проницаемости и других свойствах этих моделей. К тому же использование первичных культур является трудоемким процессом и требует высокой экспертизы, что делает эти способы малопригодными для высокопроизводительного скрининга.

Другими недостатками способов является культивирование в статических условиях, что не отражает физиологических условий, в которых эндотелий сосудов подвергаются воздействию касательного напряжения.

Наиболее близким решением является способ, описывающий трехмерную трубчатую структуру с постоянным потоком питательной среды, имитирующим физиологическое касательное напряжение в кровеносных сосудах (WO 03025206) (прототип). В этой динамической модели используются различные монокультуры и совместное культивирование клеток различного типа, а именно эндотелиальных клеток мозга крысы, астроцитов крысы и эндотелиальных клеток мозга человека. Недостатком модели является использование одновременно только двух типов клеток, эндотелиальных клеток и астроцитов.

Техническая задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в преодолении перечисленных выше недостатков посредством разработки способа сокультивирования клеток до момента образования каждым типом клеток сплошного монослоя с последующим изучением сформированной клеточной модели in vitro, в т.ч. в динамическом режиме ростовой среды.

Поставленная задача реализуется следующим образом:

Готовят необходимое количество мембранных вставок Transwell для 96-луночного планшета:

- покрывают нижнюю сторону мембраны раствором ВКМ (35 мкл/вставку) следующего состава: коллаген IV (20 мкг/мл) + агрин (4 мкг/мл) + энтактин (4 мкг/мл) + ламинин 511 (5 мкг/мл) + ламинин 411 (5 мкг/мл) в DPBS (Са2+/Mg2+) (фиг. 1);

- покрывают верхнюю сторону мембраны раствором ВКМ (35 мкл/вставку) следующего состава: ламинин 211(10 мкг/мл) в DPBS (Ca2+/Mg2+).

Планшеты с покрытыми ВКМ мембранными вставками хранят в асептических условиях при +2°С - +8°С до 4 недель. К мембранам добавляют 1xDPBS (Ca++/Mg++), чтобы предотвратить пересыхание мембран с ВКМ.

Для покрытия нижней стороны мембраны ВКМ или для посева клеток на нижнюю сторону мембраны, мембранную вставку Transwell переворачивают в лунке планшета вверх дном, наносят каплю (~35 мкл) раствора ВКМ или суспензии клеток, закрывают крышкой или пленкой Parafilm для предотвращения испарения среды, ставят в CO2-инкубатор на достаточное время для формирования ВКМ или для прикрепления клеток.

Дифференцировка iPS клеток

Дифференцировку клеток проводят в соответствии с детально описанным протоколом [Lippmann ES, 2012] (фиг. 1). Засевают iPS клетки линии IMR90 - 4 в 6-луночные планшеты в плотности 10000-15600 клеток/см2 в питательной среде Е8, содержащей 10 мкМ Y-27632 (День -1). Примерно через 24 часа после посева клеток меняют среду на Е6 питательную среду (День 0) для индукции дифференцировки. Меняют среду каждые 24 часа. Дифференцирут клетки в Е6 среде в течение 4 дней. Далее, меняют среду на ЕС питательную среду с добавлением 20 нг/мл bFGF и 10 мкМ ретиноевой кислоты (RA), инкубируют48 часов. После этого отбирают ЕС питательную среду, промывают клетки один раз DPBS и инкубируют с Аккутазой 20-25 минут. Осаждают клетки центрифугированием и далее пересаживают на слой Перицитов для селективной адгезии (3 пункт). Пересаживают клетки для селекции в отношении 1 лунка 6-луночного планшета с незрелыми дифференцированными клетками на 3 мембранных вставки (12-луночного планшета) или 24 мембранных вставки (96-луночного планшета).

Сокультивирование iPS-EC клеток, перицитов и астроцитов для формирования клеточной модели ГЭБ (фиг. 2).

Засевают перициты на нижнюю поверхность мембраны, покрытой ВКМ, в плотности 2,5*105 клеток/см2, в полной питательной среде (DMEM + 10% FBS). Ставят на 2 часа в СО2-инкубатор для прикрепления клеток. После этого, меняют среду на ЕС питательную среду, инкубируют еще 24 часа. Засевают незрелые (Immature) iPS-EC клетки (пункт 2) на слой из перицитов (в отношении 1 лунка 6-дуночного планшета с незрелыми iPS-EC клетками на 24 мембранные вставки 96-луночного планшета) в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты. Дают клеткам прикрепиться в течение 2 часов в СО2-инкубаторе. После этого, переверачивают мембранные вставки в лунках в их нормальное положение (дном вниз), и засевают астроциты на верхнюю (внутреннюю) сторону мембранной вставки в плотности 2,5*105 клеток/см2, в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты. Инкубируют 24 часа в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты. Через 24 часа меняют среду на ЕС питательную среду без добавок, инкубируют еще 24 часа.

В результате формируется плотный клеточный барьер с физиологически релевантными значениями TEER (>2000 Ω⋅см2), которые сохраняются длительное время (более 3 дней).

Для наилучшего понимания сущности заявляемого изобретения ниже представлен перечень материалов и оборудования, используемых в настоящем описании:

«Трансвелл» («Transwell») - емкость для выращивания клеток или клеточных моделей, которые используются в микрофлюидных устройствах при проведении исследований клеточных моделей. Трансвеллы имеют форму цилиндра или усеченного конуса, объем от 100±25 мкл до 1,5±0,15 мл, верхний диаметр от 4,26±0,50 ммдо 24±0,5 мм, нижний диаметр от 4,26±0,50 мм до 24±0,5 мм, высоту от 6±0,5 мм до 20±0,5 мм, дно выполнено в виде пористой мембраны с диаметром пор от 0,4 до 8,0 мкм и плотностью пор от 1×105 до 1×108 пор на 1 см2. Трансвеллы могут быть выполнены из полиэстера, поликарбоната или политетрафторэтилена. Из уровня техники известны Трансвеллы фирмы Corning Inc. В настоящем изобретении используются Трансвеллы с толщиной мембраны 10 μm, материал мембраны поликарбонат (PC), диаметр пор в мембране 3 μm.

Клетки для сокультивирования: iPS(IMR)-EC (клетки микроваскулярного эндотелия головного мозга человека, дифференцированные из iPS клеток линии IMR90-4) (WiCell); imHBVP (иммортализованные перициты головного мозга человека) (Celther); fHA-hTERT (иммортализованные астроциты человека) (abm).

Культуральный пластик (Corning): Т25 флаконы; 6-луночныепланшеты; 96-луночные планшеты с мембранными вставками Transwell; 96-луночные планшеты.

Компоненты клеточной модели ГЭБ: Мембранные вставки Transwell для 96-луночного планшета.

Поверхность PC мембраны, обращенная в сторону нижнего отсека лунки ("сосудистый отсек"), покрыта следующими компонентами ВКМ: коллаген IV + агрин + энтактин + ламинин (411+511), для адгезии к поверхности мембраны перицитов и iPS-EC эндотелиальных клеток.

Поверхность PC мембраны, обращенная в сторону верхнего отсека лунки ("мозговой отсек"), покрыта следующими компонентами ВКМ: ламинин 211 для адгезии к поверхности мембраны астроцитов.

Компоненты ВКМ для клеточной модели ГЭБ: Ламинин 511 (BioLamina), Ламинин 411 (BioLamina), Коллаген IV (MERCK), Агрин (R&D Systems), Энтактин (R&D Systems), Ламинин 211 (BioLamina).

Компоненты ВКМ для моно-культур клеток:

Культивирование, поддержание iPS клеток - Matrigel (Corning);

Дифференцировка iPS клеток (со стадии селекции) - Коллаген IV (MERCK); Фибронектин (Sigma-Aldrich); fHA-hTERT; Внеклеточный матрикс - Applied Cell Extracellular Matrix (G422) (ABM).

Культуральная среда (средаи компоненты от Thermo Fisher Scientific, Sigma Aldrich, R&D Systems или ABM):

Питательная среда для iPS и iPS-EC клеток: E8 питательная среда с добавлением или без 10 мкМ Y-27632; Е6 питательная среда; ЕС питательная среда с добавлением или без 20 нг/мл bFGF и 10 мкМ ретиноевой кислоты;

Питательная среда для imHBVP - DMEM с добавлением 10% FBS и антибиотиков (если необходимо);

Питательная среда для fHA-hTERT - Prigrow IV (abm) с добавлением 10% FBS.

Культуральная среда (для сокультивирования iPS-EC клеток, перицитов и астроцитов): ЕС питательная среда.

Диссоциирующие растворы: Stem Pro Аккутаза (для imHBVP клеток и iPS-ЕС клеток перед стадией селекции); Версен (для iPS клеток); Трипсин/ЭДТА (для fHA-hTERT клеток).

Способ сокультивирования iPS-EC клеток, перицитов и астроцитов для формирования клеточной модели гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), в котором перициты засевают на нижнюю поверхность мембраны, покрытой внеклеточным матриксом, в плотности 2,5*10 клеток/см, в полной питательной среде DMEM+10% FBS, ставят на 2 часа в CO-инкубатор для прикрепления клеток, меняют среду на ЕС питательную среду, инкубируют еще 24 часа, незрелые (Immature) iPS-EC клетки засевают на слой из перицитов в отношении 1 лунка 6-луночного планшета с незрелыми iPS-EC клетками на 24 мембранные вставки 96-луночного планшета в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты, дают клеткам прикрепиться в течение 2 часов в СО-инкубаторе, после чего переворачивают мембранные вставки в лунках дном вниз и засевают астроциты на верхнюю (внутреннюю) сторону мембранной вставки в плотности 2,5*10 клеток/см в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты и инкубируют 24 часа в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты, через 24 часа меняют среду на ЕС питательную среду без добавок, инкубируют еще 24 часа, при этом используют клетки микроваскулярного эндотелия головного мозга человека, дифференцированные из iPS клеток линии IMR90-4, иммортализованные перициты головного мозга человека и иммортализованные астроциты человека.
СПОСОБ СОКУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ IN VITRO МОДЕЛИ ГЕМАТО-ЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА
Источник поступления информации: Роспатент

Showing 1-10 of 20 items.
25.08.2017
№217.015.c09d

Фильтрующий материал и способ его изготовления

Изобретение относится к мембранной технологии, в частности к фильтрующим материалам для ультра- и нанофильтрации. Предложен материал, состоящий из пористой металлической подложки с размером пор 1,2-5,5 мкм, изготовленной из нержавеющей стали, керамического слоя ТiO с размером пор 0,2-0,25 мкм и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002616474
Дата охранного документа: 17.04.2017
29.12.2017
№217.015.f31f

Способ получения n-алкил-о-арилкарбаматов

Изобретение относится к способу получения N-алкил-О-арилкарбаматов общей формулы I, где R означает арильные группы, a R - алкильные группы нормального или разветвленного строения с числом атомов углерода от 1 до 4. Способ заключается в том, что осуществляют взаимодействие фенолов с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002637317
Дата охранного документа: 04.12.2017
19.01.2018
№218.016.05f4

Устройство для локального нанесения металлических покрытий электролитическим методом

Устройство относится к области гальванотехники и может быть использовано в электронном и термоэлектрическом приборостроении. Устройство содержит корпус, источник постоянного тока, кожух с закрепленным в нем анодом и электролизную ванну. Корпус разделен на две изолированные части - нижнюю и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002630996
Дата охранного документа: 15.09.2017
19.01.2018
№218.016.0e9f

Способ получения n-арил-о-алкилкарбаматов

Изобретение относится к способу получения N-арил-О-алкилкарбаматов общей формулы I, где R означает арильные группы, а R означает алкильные группы нормального или разветвленного строения с числом атомов углерода от 1 до 4. Способ заключается в том, что осуществляют взаимодействие спирта ROH и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002633358
Дата охранного документа: 12.10.2017
20.01.2018
№218.016.16cc

Способ изготовления фильтрующего материала

Изобретение относится к способам изготовления фильтрующих мембранных материалов. Способ изготовления включает формирование на пористой подложке из нержавеющей стали, имеющей толщину 150-250 мкм и средний размер пор 2-10 мкм, селективного слоя из титана толщиной 1-10 мкм. Формирование...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002635617
Дата охранного документа: 14.11.2017
20.01.2018
№218.016.1dbb

Способ лазерного модифицирования стекла

Изобретение относится к способу модифицирования структуры стекла под действием лазерного пучка для формирования люминесцирующих микрообластей. Фосфатное стекло, содержащее ионы серебра, локально облучают фемтосекундными лазерными импульсами с длиной волны в ближнем инфракрасном диапазоне, с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002640836
Дата охранного документа: 12.01.2018
13.02.2018
№218.016.1ef4

Способ получения 1-фенил-3-(4н-1,2,4-триазол-4-ил)мочевины

Изобретение относится к способу получения 1-фенил-3-(4H-1,2,4-триазол-4-ил)мочевины формулы I который осуществляют взаимодействием (4H-1,2,4-триазол-4-ил)амина и 1,3-дифенилмочевины в мольном соотношении от 3:1 до 4:1 при температуре 170-182°C под вакуумом с отгонкой анилина. Технический...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002641109
Дата охранного документа: 16.01.2018
13.02.2018
№218.016.1f89

Компактный бетавольтаический источник тока длительного пользования с бета-эмиттером на базе радиоизотопа ni и способ его получения

Изобретение относится к технике безотходной ядерной технологии. Компактный бетавольтаический источник тока длительного пользования с бета-эмиттером, представляющий собой сборку «сэндвичевой» структуры в виде стопки чередующихся между собой единичных или комплектных микроисточников тока, где...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002641100
Дата охранного документа: 16.01.2018
10.05.2018
№218.016.395c

Способ очистки газов от паров тритированной воды

Изобретение относится к области технологии радионуклидов и может быть использовано как в технологических процессах, использующих молекулярный тритий и тритийсодержащие соединения, так и для глубокой очистки газовых сбросов от трития предприятий атомной отрасли при решении экологических задач....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002647040
Дата охранного документа: 13.03.2018
10.05.2018
№218.016.4a9a

Способ получения n-(2-гидроксиэтил)-о-изопропилкарбамата

Изобретение относится к способу получения N-(2-гидроксиэтил)-O-изопропилкарбамата (формула I), который находит применение в качестве регулятора роста растений, а также повышает их устойчивость к стрессовым факторам. Согласно предлагаемому способу осуществляют взаимодействие...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002651792
Дата охранного документа: 24.04.2018
Showing 1-10 of 21 items.
10.08.2014
№216.012.e7f8

Способ очистки воды

Изобретение может быть использовано в области водоочистки подземных и поверхностных вод от железа и для получения питьевой воды для небольших населенных пунктов, сельскохозяйственных комплексов. Способ очистки воды включает прокачивание очищаемой воды в режиме кавитации через волновое...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002525177
Дата охранного документа: 10.08.2014
10.11.2014
№216.013.05a1

Способ оценки жизнеспособности клеток в микробиореакторе с помощью оптического световода

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ оценки жизнеспособности клеток в микробиореакторе с помощью оптического световода. Способ включает помещение клеток в мембранную ячейку сменного клеточного блока микробиореактора, приготовление рабочего раствора витального красителя,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002532839
Дата охранного документа: 10.11.2014
27.11.2015
№216.013.944e

Способ комплексной переработки топинамбура

Настоящее изобретение относится к технологии комплексной переработки овощей и отходов растительного производства. Способ предусматривает мойку клубней топинамбура, измельчение с помощью гомогенизатора ST-2 до размеров частиц 1-2 мм, получение водных суспензий с гидромодулем 6,3, реагентную и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002569585
Дата охранного документа: 27.11.2015
20.06.2016
№217.015.034b

Устройство и способ автоматизированного поддержания концентрации растворенных газов в культуральной среде в микрофлюидной системе

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ автоматического поддержания концентрации растворенных газов в культуральной среде, находящейся в ячейке с клеточной моделью и циркулирующей по каналам микрофлюидной системы, и устройство для осуществления вышеуказанного способа....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002587628
Дата охранного документа: 20.06.2016
10.05.2016
№216.015.3d1d

Порт введения тестируемого химического соединения и отбора жидкости из ячейки для культивирования клеточных моделей

Изобретение относится к конструктивным элементам микробиореакторов. Предложен порт введения тестируемого химического соединения и отбора жидкости из ячейки для культивирования клеточных моделей. Порт изготовлен из неподвижной и подвижной детали. Каждая деталь снабжена двумя сквозными...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002583310
Дата охранного документа: 10.05.2016
20.05.2016
№216.015.3ef9

Микрофлюидный чип для создания клеточных моделей органов млекопитающих

Изобретение относится к области биохимии. Предложен микрофлюидный чип для создания клеточных моделей органов млекопитающих. Чип содержит пластину из поликарбоната, на которой отлит слой полидиметилсилоксана с размещенной в нём микрофлюидной системой. Микрофлюидная система включает объединенные...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002584598
Дата охранного документа: 20.05.2016
10.06.2016
№216.015.4773

Способ оценки герметичности и целостности системы клапанов микрофлюидной системы

Группа изобретений относится к микрофлюидным системам для работы с клетками тканей, человека, животных или растений и (или) культурами вирусов, и предназначена для оценки герметичности и целостности системы клапанов микрофлюидной системы в процессе их изготовления и эксплуатации. Устройство для...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002585804
Дата охранного документа: 10.06.2016
10.06.2016
№216.015.49f3

Способ оценки риска возникновения патологии беременности

Изобретение относится к медицине, а именно к способу оценки риска развития патологии беременности. Сущность способа состоит в том, что в качестве биомаркеров оценки риска развития патологии беременности используют концентрацию гипоксантина, ксантина, мочевой кислоты, для чего сыворотку крови...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002586412
Дата охранного документа: 10.06.2016
25.08.2017
№217.015.9aeb

Наноматериал для направленной доставки противоопухолевых препаратов и противоопухолевый препарат на его основе

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии и молекулярной биологии, и раскрывает наноматериал для направленной доставки противоопухолевого препарата к месту локализации опухоли. Наноматериал содержит наночастицы магнетита, покрытые гидрофильным полимером, содержащим в своем...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002610170
Дата охранного документа: 08.02.2017
25.08.2017
№217.015.ca34

Способ определения пуринов и пиримидинов в биологических жидкостях человека

Изобретение относится к области аналитической химии и касается способа определения пуринов и пиримидинов в сыворотке крови человека. Сущность способа заключается в том, что проводят приготовление стандартного раствора биомаркеров метаболизма пуринов и пиримидинов. Затем получают образцы...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002620155
Дата охранного документа: 23.05.2017
+ добавить свой РИД