СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ КАРЦИНОМЫ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ С

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, гастроэнтерологии и инфекционным болезням, и позволяет определить риск развития гепатоцеллюлярной карциномы у больных хроническим гепатитом С.

В настоящее время гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) находится на втором месте среди онкологических причин, приводящих к смерти во всем мире. Основными этиологическими агентами ГЦК являются вирусы гепатитов В и С, вызывающие хронические заболевания печени. Несмотря на известные успехи в лечении вирусных гепатитов достижение стойкого вирусологического ответа не сопровождается снижением риска развития ГЦК.

Средняя выживаемость через 5 лет после постановки диагноза ГЦК составляет всего 5-6% пациентов. В связи с поздней обращаемостью больных за медицинской помощью и, соответственно, поздней диагностикой эффективность оперативного лечения остается неудовлетворительной, так как частота рецидивов в течение 5 лет диспансерного наблюдения составляет 80% случаев, а через 20 лет достигает 100% [Villanueva, А., 2013].

В связи с этим последнее десятилетие характеризуется интенсивными разработками методов прогнозирования развития ГЦК на фоне хронических заболеваний печени с использованием диагностических алгоритмов (шкал). Как правило, в состав формулы входят физиологические параметры индивидуума (пол, возраст, наличие цирроза печени), биохимические показатели (билирубин, альбумин), содержание биомаркеров ГЦК в крови (альфа-фетопротеин, L3-фракция альфа-фетопротеина, дез-гаммакарбоксипротромбин) и уровень вируса в крови (вирусная нагрузка).

Так, известна шкала BALAD, предложенная группой японских исследователей (см. Toyoda, Н., Kumada, Т., Osaki, Y., Oka, Н., Urano, F., Kudo, M., & Matsunaga,T. (2006). Staging hepatocellular carcinoma by a novel scoring system (BALAD score) based on serum markers. Clinical Gastroenterology and Hepatology, 4(12), 1528-1536.) Название шкалы BALAD сформировано из первых букв названий индикаторных показателей (В - билирубин, А - возраст, L - L3 альфафетопротеин, А - альфафетопротеин, D - дез-гаммакарбоксипротромбин).

Известна модифицированная шкала BALAD, при этом перечень учитываемых биомаркеров остался прежним, однако из формулы был исключен билирубин и добавлен возраст пациента. Указанная шкала получила название GALAD и была апробирована в этнических группах азиатов и некоторых европейских странах (Италия, Великобритания) (см. Johnson, P.J. (2017) The BALAD-2 and GALAD Biomarker Models for Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology & hepatology, 13(4), 231.

К недостаткам данных формул следует отнести то, что обе шкалы не включают специфических параметров, касающихся этиологического фактора, приведшего к развитию ГЦК, и поэтому могут быть эффективными у больных циррозом печени и в то же время недостаточно специфичными для больных страдающих или перенесших вирусные гепатиты В или С. Это обусловлено тем, что один из компонентов формулы альфа-фетопротеин (АФП), используемый в обеих формулах, существенно зависит от этиологического агента, вызвавшего поражение печени. При хронических вирусных гепатитах В и С содержание АФП повышено даже в отсутствии первичного рака печени и коррелирует с активностью печеночных трансаминаз. Кроме этого существуют технические сложности в определении уровня АФП-L3 и большие погрешности его определения у больных с уровнем АФП менее 30 нг/мл. Вместе с тем, уровень другого компонента формул BALAD и GALAD - дез-гамма-карбоксипротромбин зависит не только от размера опухоли, но и от других факторов (дефицит витамина К, недоедание, острая печеночная недостаточность, использование препаратов витамина К в лечении и др.), что повышает вероятность появления ложноположительных результатов.

Известны диагностические шкалы для больных хроническим вирусным гепатитом В (см. Wong, G. L. Н., Chan, Н. L. Y., Wong, С.K. Y., Leung, С., Chan, С.Y., Но, P. P. L., … & Lau, Т. K. Т. (2014). Liver stiffness - based optimization of hepatocellular carcinoma risk score in patients with chronic hepatitis B. Journal of hepatology, 60(2), 339-345.). В большинстве из них кроме поло-возрастной характеристики индивидуума используется количественные показатели репликации вируса гепатита В.

Наиболее близким является способ оценки риска развития гепатоцеллюлярной карциномы у больных с хроническим гепатитом С, прошедших курс противовирусной терапии (см. Морозов В.Г. и др. Риск развития гепатоцеллюлярной карциномы у больных с хроническим гепатитом С после противовирусной терапии препаратами прямого противовирусного действия: собственные наблюдения // Инфекционные болезни. - 2018. - Т. 16. - №. 4. - С. 38-47). В математическую формулу способа вошли значение α-фетопротеина (АФП), пол пациента, значение аланинаминотрансферазы (АЛТ), степень фиброза и показатели плотности печеночной ткани по данным эластографии. Однако, чувствительность и специфичность способа составляет 35,9% и 14,3%, соответственно. Отношение правдоподобия положительного результата составляет 1,4, то есть вероятность положительного результата у больного практически равна вероятности положительного результата у здорового. Кроме того, проведение эластографии ограничено в небольших населенных пунктах и сельской местности, зависит от квалификации врача и имеет ограничения поточности для некоторых групп населения, что в достаточной степени затрудняет использование данного способа оценки риска в клинической практике.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение чувствительности и точности определения риска развития гепатоцеллюлярной карциномы у больных хроническим гепатитом С, а также простота и доступность выполнения.

Новым в предлагаемом способе является то, что в формуле определения риска используют совокупность лабораторных показателей венозной крови пациента и его биологических информационных критериев, имеющих высокую чувствительность и статистически значимые признаки, вычисляют их числовые значения, используя поправочные коэффициенты, и рассчитывают по формуле уровень риска развития гепатоцеллюлярной карциномы у больных хроническим гепатитом С.

Достоинством предложенного способа определения риска развития ГЦК являются совместное использование сывороточных белковых маркеров - альфа-фетопротеина (АФН) и остеопонтина (ОПН) как прогностических критериев, а также возможность использования их в рутинной клинической практике. АФП является наиболее изученным биомаркером ГЦК. Но уровень АФП коррелирует с размером опухоли, что затрудняет его использование для диагностики раковых образований небольшого размера. Поэтому в качестве дополнительного информативного критерия авторами был выбран ОПН, который показал высокую чувствительность при диагностике ГЦК на ранних стадиях. Отмечено, что гепатоцеллюлярная карцинома чаще встречается у мужчин, чем у женщин, и диагностируется, в основном, в возрасте 50-60 лет, по это причине возраст и пол были выбраны авторами в качестве информативных критериев. Кроме того, такие показатели гематологических тестов как количество эритроцитов и уровень аланинаминотрансферазы являются стандартными признаками хронических заболеваний печени. Известно, что при ГЦК наблюдается повышение количества эритроцитов (эритроцитоз) вследствие продукции опухолевыми клетками печени эритропоэтина, который стимулирует образование эритроцитов в костном мозге. Повышение в крови уровня фермента АЛТ, преимущественно представленного в клетках печени, является показателем повреждения печени. При этом ГЦК вызывает умеренное повышение активности АЛТ по сравнению с уровнем АЛТ при вирусных инфекциях, где активность фермента превышает норму в 4-10 раз. Информативные признаки выбраны с использованием F-критерия Фишера, коэффициенты подобраны посредством метода наименьших квадратов (МНК).

Предлагаемый способ имеет чувствительность 79% (64 - 91; CI 95%), специфичность - 76% (64 - 85; CI 95%). Отношение правдоподобия положительного результата составляет 3,27 (2,1-5,1; CI 95%), то есть вероятность положительного результата у больного в 3,27 раз выше вероятности положительного результата у здорового. Статистически достоверно чувствительность предлагаемого способа выше чувствительности известного способа - р <0.05.

Для сравнения обоих способов были обследованы 55 больных гепатоцеллюлярной карциномой и 70 больных хроническим гепатитом С. Диагноз ХГС устанавливали на основании данных анамнеза, клинического обследования, определения активности печеночных трансаминаз, выявлении анти-HCVIgG и PHKHCV. Степень фиброза печени определяли с помощью аппарата FibroScan-502. Диагноз ГЦК устанавливался с учетом критериев европейской ассоциации по изучению болезней печени (EASL). Больные наблюдались и лечились в ГБУЗ «Областная клиническая инфекционная больница (г. Иркутск), «Областного клинический консультативно-диагностический центр» (г. Иркутск), «Областной онкологический диспансер» (г. Иркутск). У всех больных диагноз был верифицирован морфологически. Для лабораторных исследований использовались пробы крови, полученные во время диспансерного наблюдения до верификации диагноза ГЦК. Группу сравнения составили 70 больных ХГС, у которых через 3-10 месяцев после взятия крови на ОПН и АФП была выполнена мультифазная контрастная компьютерная томография и/или динамическая контрастная магнитно-резонансная томография и не было обнаружено объемного образования печени и изменений сосудистой васкуляризации, характерной для ГЦК. Образцы сывороток пациентов ХГС были собраны во время диспансерного наблюдения. Все образцы сыворотки центрифугировали и хранили при -80°С. Информированное согласие было получено от каждого участника исследования, а проведение настоящей работы было одобрено комитетом по этике Иркутского государственного медицинского университета. Статистическую обработку материалов проводили с использованием программы Meta Disc 1.4 Software, которая находится в открытом доступе по ссылке: https://meta-disc.software.informer.com/1.4/. Оценивали такие показатели как диагностическая чувствительность (Se), специфичность (Sp), положительное прогностическое значение (PPV), отрицательное прогностическое значение (NPV) и отношение правдоподобия положительного результата (PLR). Для выявления достоверности различий показателей в сравниваемых группах применяли непараметрические критерии статистики (хи-квадрат (χ²)). Уровень статистической значимости был принят при р ≤0,05. Результаты сравнения двух способов приведены в таблице (см. Приложение к заявке).

Сопоставительный анализ предлагаемого способа и прототипа показывает, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что в формуле определения риска используют совокупность лабораторных показателей венозной крови пациента и его биологических информационных критериев, имеющих высокую чувствительность и статистически значимые признаки, вычисляют их числовые значения, используя поправочные коэффициенты и рассчитывают уровень риска по формулам:

F₁=-73,1676+0,4846×В+6,5932×П+22,3483× Э+0,024×АЛТ+0,0015×АФП+0,056×ОПН

F₂=-72,7678+0,2393×В+9,9954×П+24,3663×Э+0,0018×АЛТ+0,0012×АФП-0,0009×ОПН, соответственно

где В - возраст пациента;

П - пол (1 – муж., 2 – жен.)

Э - эритроциты (×10¹²/л);

АЛТ - аланинаминотрансфераза (Ед/л);

АФП - альфа-фетопротеин (МЕ/мл);

ОПН - остеопонтин (нг/мл), при этом при F₁>F₂ определяют высокий риск развития гепатоцеллюлярной карциномы, а при F₁<F2 определяют низкий риск развития гепатоцеллюлярной карциномы у больных хроническим гепатитом С, что соответствует критерию «новизна».

Предлагаемый способ повышает чувствительности и точность определения риска развития гепатоцеллюлярной карциномы у больных хроническим гепатитом С. Высокая чувствительность предлагаемого способа позволяет выявить максимальное количество пациентов, у которых возможен риск развития ГЦК. Способ отличается простотой выполнения и доступностью, так как используемые в нем лабораторные показатели относятся к разряду рутинных общеклинических тестов, а информативные критерии присутствуют в паспортных данных пациента. Таким образом, данный способ может быть применен в условиях отсутствия специализированных медицинских учреждений на уровне участковых больниц или фельдшерско-акушерских пунктов, что позволяет обеспечить большую доступность медицинской помощи населению сельской местности.

Способ осуществляют следующим образом. Забор венозной крови у пациента производят натощак в соответствии с общими правилами забора биологического материала в пробирки с антикоагулянтом (ЭДТА) для гематологического и клинических анализов. Подсчет эритроцитов в крови осуществляют с помощью гематологического анализатора согласно стандартным методикам. Определение активности АЛТ в сыворотке крови проводят с использованием биохимического анализатора. Для определения уровня АФП используют анализатор ARCHITECT i System и набор реагентов 3Р36 ARCHITECT AFP. Уровень ОПН в сыворотке крови определяют с использованием ИФА набора "Human Osteopontin Platinum ELISA" (Afrymetrix eBioscience), регистрируют поло-возрастную характеристику пациента и определяют риск развития гепатоцеллюлярной карциномы по формулам.

Способ подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1.

Пациент X., мужского пола, родился 04.06.1959 г. Обратился в ОГАУЗ «Иркутский областной клинический консультативно-диагностический центр» в марте 2015 года. На момент обращения больному исполнилось 56 лет. Из анамнеза установлено, что болен хроническим вирусным гепатитом С, который был впервые выявлен в 2013 г. Переливания крови, проведенные в прошлом операции, употребление внутривенно наркотиков отрицает. Хроническое течение подтверждено повторным выявлением РНК вируса гепатита С и флюктуирующим уровнем трансаминаз в крови с периодическим повышением до трех норм. По результатам эластометрии печени выявлен фиброз F4 (32,8 кПа) по шкале METAVTR. Острый период заболевания прошел незаметно, желтуху в анамнезе отрицает. Жалобы на быструю утомляемость, слабость, чувство дискомфорта и периодические тупые боли в правом боку. Вес 80 кг, рост 179 см, ИМТ 25,0. В легких дыхание везикулярное, хрипов нет. Тоны сердца ясные, ритмичные АД 120/80, ЧСС 68 ударов в минуту. Живот мягкий безболезненный. Пальпаторно обнаружено увеличение печени и селезенки. Симптом поколачивания отрицательный, периферических отеков нет. При лабораторном обследовании: эритроциты - 4,8*10⁹/л; лейкоциты 6,1*10⁹/л, тромбоциты 155*10⁹/л, АЛТ 84 Ед/л, ACT 56 Ед/л, общий билирубин 16 мкмоль/л, HBsAg, антитела к ВИЧ не выявлены. По данным УЗИ брюшной полости: увеличение печени до 160 мм, площадь селезенки 84 см². При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) обнаружена РНК вируса гепатита С, высокая степень вирусемии, lb генотип. Поставлен клинический диагноз: Хронический вирусный гепатит С, умеренная биохимическая активность, HCVRNA"+", 1 в генотип, фиброз печени F4 по шкале METAVIR, тромбоцитопения. Больному проведен 48-ми недельный курс лечения препаратами пегилированного интерферона-α2а и рибавирина. Лечение переносил удовлетворительно. В процессе лечения наблюдались осложнения в виде лейкопении (до 2,3*10⁹/л) и тромбоцитопении (до 65*10⁹/л). Достигнут стойкий вирусологический ответ, подтвержденный отсутствием вируса в ПЦР на момент окончания терапии и через 6 месяцев диспансерного наблюдения.

После окончания противовирусной терапии находился на диспансерном наблюдении. Каждые 5-8 месяцев проходил клинико-лабораторное и инструментальное обследование. При обследовании через 6 месяцев (на момент обследования больному исполнилось 57 лет): Эритроциты 4,1*10¹²/л. Лейкоциты 4,2*10⁹/л, тромбоциты 149*10⁹/л, АЛТ 27 Ед/л, ACT 36 Ед/л, общий билирубин 26 мкмоль/л, альбумин 40 г/л, глюкоза 6,4 ммоль/л, креатинин 67,5 ммоль/л. HCV RNA - не обнаружена. УЗИ брюшной полости: печень не увеличена. КВР 140 мм, не выходит за край реберной дуги. Площадь селезенки 72 см², асцита - нет, очаговых изменений в печени не выявлено. АФП 8,5 нг/мл, ОПН 472 нг/мл. Исходя из указанных результатов обследования расчетный риск развития ГЦК у данного пациента составил:

F₁=73,1676+0,4846×57+6,5932×1+22,3483×4,1+0,024×27

+0,0015×(08264×8,5)+0,056×472=55,9775666

F₂=-72,7678+0,2393×57+9,9954×1+24,3663×4,1+0,0018×27

+0,0012×(0,8264× 8,5)-0,0009×472=50,40175928

F₁>F₂, что позволяет отнести данного больного к группе пациентов с высоким риском развития ГЦК.

В феврале 2018 г. при очередном диспансерном визите у больного на УЗИ выявлено объемное образование в левой доле печени, в 1-2 сегменте размером 84*72 мм, средней эхогенности, неоднородное. Для уточнения диагноза проведено радиоизотопное исследование печени с меченными эритроцитами и мультиспиральная компьютерная томография печени. По данным радиоизотопного исследования: данных за гемангиому печени не выявлено. Заключение МСКТ с в/в усилением: Печень неоднородной структуры, на фоне пониженной плотности паренхимы до 42.5 еД.Н. и после контрастирования 62,0 еД.Н в S2 визуализируется гиподенсивное образование с нечеткими контурами, незначительно накапливает контраст. В аретриальную фазу контуры его становятся четче, размеры 0,8*0,9*0,7 см. Внутри и внепеченочные протоки не расширены. Заключение: объемное образование левой доли печени. Гепатоцеллюлярный рак. 28.03.2018 г. под контролем УЗИ выполнена тонкоигольная аспирационная биопсия образования в левой доле печени иглой 22G. Цитология пунктата печени: в мазках при пункции печени среди пролиферирующего печеночного эпителия обнаружены единичные опухолевые клетки карциномы. В апреле 2018 г. больному выполнена операция: левосторонняя гемигепатэктомия. Патолого-гистологическое заключение: гепатоцеллюлярная карцинома. В крае резекции роста опухоли нет. В лимфатических узлах метастазы не обнаружены. Выписан в удовлетворительном состоянии. По состоянию на июнь 2019 г. больной жив, состояние удовлетворительное. Таким образом, у данного больного гепатоцеллюлярная карцинома развилась через 2 года после успешного курса противовирусной терапии на фоне ранее сформировавшегося цирроза печени. Применение предлагаемого способа определения риска развития ГЦК позволило отнести его к категории лиц с высокой вероятностью развития ГЦК (F₁>F₂) за 6 месяцев до выявления заболевания методами визуализации (УЗИ, МСКТ) и гистологическим анализом биоптата ткани печени.

Пример 2

Пациентка Я., женского пола, дата рождения 16.06.1962 г. Обратилась в ОГАУЗ «Иркутский областной клинический консультативно-диагностический центр» в апреле 2015 г. с жалобами на слабость, ноющие боли в правом боку, снижение массы тела. На дату обращения за медицинской помощью больной исполнилось 53 года. Из анамнеза выяснено, что с 2012 г. страдает хроническим вирусным гепатитом С. Противовирусное лечение ранее не получала, принимала гепатопротекторы, мембраностабилизирующие препараты. Из эпидемиологического анамнеза: в 12 лет лечилась по поводу гнойного лимфаденита правой подмышечной области. Проходила курс гемотерапии с внутримышечным введением крови от родственника (сестры). В анамнезе наличие желтухи отрицает. Употребление наркотиков отрицает. Вес 55 кг, рост 168 см, ИМТ 19,5. В легких дыхание везикулярное, хрипов нет. Тоны сердца ясные, ритмичные АД 110/70, ЧСС 60 ударов в минуту. Живот мягкий безболезненный. Печень не выходит за край реберной дуги, селезенка не пальпируется. Симптом поколачивания отрицательный, периферических отеков нет. При лабораторном обследовании: эритроциты - 5,4*10¹²/л; лейкоциты 7,5*10⁹/л, тромбоциты 199*10⁹/л, АЛТ 46 Ед/л, ACT 41 Ед/л, общий билирубин 15 мкмоль/л, HBsAg, антитела к ВИЧ не выявлены. В анализе ПЦР РНК вируса гепатита С обнаружена, средняя степень вирусемии, lb генотип.Эластичной печени 12,5 кПа (F3 по шкале METAVIR).

По данным УЗИ брюшной полости: печень, селезенка не увеличены. Поставлен клинический диагноз: Хронический вирусный гепатит С, умеренная биохимическая активность, HCV RNA "+", 1в генотип, фиброз печени F3 по шкале METAVIR, класс А по Чайлд-Пью, тромбоцитопения. Больной проведен 48-недельный курс лечения препаратами пегилированного интерферона-α2а и рибавирина. Лечение переносила удовлетворительно. В модификации дозы противовирусных препаратов необходимости не было. Достигнут стойкий вирусологический ответ, подтвержденный отсутствием вирусав ПЦР на момент окончания терапии и через 6 месяцев диспансерного наблюдения.

В процессе диспансерного наблюдения каждые 5-7 месяцев больная четырежды сдавала анализы. РНК HCV не обнаруживалась, биохимические показатели крови без патологических сдвигов. Уровень АЛТ варьировал от 27 до 36 мммоль/л. В лабораторных анализах через 1 год после завершения противовирусной терапии (к этому времени больной исполнилось 55 лет): Эритроциты 5,1*10¹²/л. Лейкоциты 4,9*10⁹/л, тромбоциты 231*10⁹/л, АЛТ 30 Ед/л, ACT 36 Ед/л, общий билирубин 15 мкмоль/л, альбумин 46 г/л, глюкоза 4,4 ммоль/л, креатинин 80,5 ммоль/л. АФП 2,0 нг/мл, ОПН 27,4 нг/мл. По данным УЗИ печени очаговых изменений в печени не выявлено. Оценка риска развития ГЦК по данным представленных анализов составила:

F₁=-73,1676+0,4846×55+6,5932×2+22,3483×5,1+0,024×30

+0,0015×(0,8264×2)+0,056×27,4=81,5240492

F₂=-72,7678+0,2393×55+9,9954×2+24,3663×5,1+0,0018×30+

0,0012×2-0,0009 ×27,4=84,68395336

F₂>F₁, что позволяет отнести данную больную к группе пациентов с низким риском развития ГЦК.

По настоянию больной через 4,5 месяца после выше приведенного обследования в связи с формированием стойкого состояния фобии рака печени выполнена МСКТ печени. Заключение: очаговых изменений в печени не обнаружено. Данных за гепатоцеллюлярный рак не выявлено. Таким образом, данная больная 2,5 года после успешного курса противовирусной терапии находилась на диспансерном наблюдении. Применение предлагаемого способа определения риска развития ГЦК позволило отнести ее к категории лиц с отсутствием риска (F₁<F₂), что было подтверждено через 4,5 месяца после выполнения настоящего исследования методами визуализации (УЗИ, МСКТ).