Результат интеллектуальной деятельности: Способ расчета дозы клеток-предшественниц гемопоэза в лейкоцитаферезном продукте путем учета изменения целостности клеточных мембран при хранении

Изобретение относится к области медицины, а именно к клеточной иммунологии, и может быть использовано для расчета трансплантационной дозы клеток-предшественниц гемопоэза в донорском лейкоцитаферезном продукте (ЛП), предназначенном для трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) взрослым и детям. При расчете дозы CD34⁺ клеток учитывается изменение целостности их мембран при хранении в условиях охлаждения до трансплантации.

Одним из эффективных методов лечения онкогематологических заболеваний является трансплантация клеток-предшественниц гемопоэза, которые обеспечивают восстановление всех ростков кроветворения [1]. Трансплантационная доза клеток-предшественниц считается ключевым фактором успеха трансплантации, она представляет собой расчетное значение этих клеток в трансплантационном материале.

Проблема планирования и прогнозирования сохранения необходимой дозы клеток-предшественниц до пересадки стоит достаточно остро. При подготовке донорского ЛП в ряде случаев проходит несколько суток от момента его получения до трансплантации. Интервал времени, затраченный на этап получения клеток-предшественниц методом лейкоцитафереза, весьма варьирует. Центр получения клеточного продукта и трансплантационный центр могут быть территориально разобщены между собой, что требует затрат времени на логистику. Зачастую трансплантационный материал подвергается длительной высокотехнологичной обработке с очисткой от нежелательных клеточных фракций и, наоборот, с обогащением целевыми функционально-активными клетками. В обязательном порядке должны быть учтены временные затраты на так называемый входной количественный контроль материала.

Известно несколько способов характеристики трансплантационного материала на предмет наличия в нем клеток-предшественниц, обладающих репопулирующими свойствами. Такую информацию в первую очередь дает определение способности клеток-предшественниц гемопоэза к образованию колоний в специально созданных лабораторных условиях [2]. Однако в результате культурального исследования получение заключения возможно не ранее чем через 10 суток, поэтому этот метод не может в полной мере соответствовать требованиям трансплантационных центров по оценке количественных характеристик клеточного материала.

Благодаря открытию иммунофенотипических характеристик клеток-предшественниц гемопоэза, а именно, высокой экспрессии на мембране маркера CD34, стала возможна их иммунологическая идентификация [3, 4]. Уточнение свойств клеток-предшественниц, широкое использование гибридомных технологий для производства моноклональных антител к клеточным маркерам, внедрение метода лазерной проточной цитофлуориметрии привело к разработке и совершенствованию методов учета CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза. Следует указать, что эти методы используют лазерную проточную цитофлуориметрию, как подход, позволяющий проанализировать тысячи клеток за несколько минут и получить достоверный результат [5].

Известен способ количественного определения CD34⁺ клеток в кроветворной ткани с использованием тройного мечения клеток за счет связывания с моноклональными антитела к маркерам CD34 и CD45 и окрашивания флуоресцентным ДНК-тропным красителем 7-аминоактиномицином D (7-AAD) [6, 7]. Способ позволяет рассчитать процентное количество клеток-предшественниц как долю от всех клеток, помеченных по CD45 и негативных по 7-AAD. Поскольку 7-AAD проникает только через разрушенные мембраны, то способ позволяет исключить из анализа все нежизнеспособные лейкоциты. С помощью этого метода также возможно рассчитать абсолютное количество CD34-позитивных клеток-предшественниц и число CD45-позитивных клеток, относящихся к лейкоцитарному ростку. Способ предполагает использование только проточного цитофлуориметра (одноплатформенный метод), что достигается использованием искусственных флуоресцирующих частиц с известной концентрацией. Очевидным недостатком способа является возможная неточность расчета трансплантационной дозы, связанная с иммунофенотипической негативностью некоторых клеток-предшественниц гемопоэза по маркеру CD45. Внедрение этого метода невозможно без наличия высококвалифицированного персонала, прошедшего валидационное тестирование. Кроме того, расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц гемопоэза на основании оценки образца лейкоцитаферезного продукта сразу после его получения не учитывает возможное снижение жизнеспособности клеток при хранении. При использовании данного способа невозможно прогнозирование эффективной дозы жизнеспособных клеток-предшественниц гемопоэза [4, 8].

Известен способ количественного определения CD34⁺ клеток в кроветворной ткани с использованием двухплатформенного подхода, предполагающего применение проточного цитофлуориметра, в сочетании с гематологическим анализатором или микроскопом. Способ основан на одновременной окраске кроветворной ткани моноклональными антителами к маркеру CD34 и флуоресцирующим низкомолекулярным ДНК-тропным красителем Sytol6, который определяется на всех ядросодержащих клетках крови, окрашивая живые клетки с наибольшей интенсивностью, а некротические и позднеапоптотические - с наименьшей [9]. Способ позволяет с высокой точностью рассчитать процентное количество клеток-предшественниц как долю от всех Syto16-позитивных клеток [4]. Однако разграничение жизнеспособных клеток по степени флуоресценции Syto16 является весьма субъективным. Применение данного способа не дает убедительной информации о числе разрушенных клеток даже в день получения клеточного материала.

Все вышеперечисленные способы направлены на идентификацию и количественное определение клеток-предшественниц в продукте лейкоцитафереза сразу после его получения. Указанные подходы не позволяют прогнозировать трансплантационную дозу клеток-предшественниц с учетом изменения жизнеспособности клеток при хранении более 24 часов в условиях охлаждения. Прототип заявляемого способа отсутствует.

Задача заявляемого изобретения состоит в создании нового, более точного способа расчета трансплантационной дозы клеток-предшественниц, учитывающего изменение целостности мембран CD34-позитивных клеток ЛП, при хранении клеточного материала от 1 до 5 суток с момента получения до трансплантации в условиях охлаждения (плюс 2 ÷ плюс 6°C).

Поставленная задача решается тем, что для расчета трансплантационной дозы клеток-предшественниц используют моноклональные антитела к антигенам CD34, CD45 и флуоресцентный ДНК-тропный краситель 7-AAD, который применяют для оценки целостности клеточных мембран в качестве самостоятельного предиктора нежизнеспособности клеток. Подсчет CD34⁺ клеток осуществляют в пределах CD45⁺7-AAD^- клеток двухплатформенным методом с использованием проточного цитофлуориметра и гематологического анализатора. Количество CD34⁺ клеток в зависимости от времени хранения корректируется с помощью коэффициента k_n. Данный коэффициент вывели экспериментально на основании изменения целостности мембран CD34⁺ клеток, которую определяли по проникновению витального флуоресцентного ДНК-тропного красителя 7-AAD через поврежденные мембраны клеток. Для этого 50 продуктов лейкоцитафереза периферической крови доноров хранили в условиях, позволяющих сдерживать бактериальную контаминацию - при охлаждении до плюс 2 ÷ плюс 6°C в течение 5 дней. Окрашивание кроветворной ткани проводили с использованием тройного мечения клеток за счет связывания с моноклональными антитела к маркерам CD34 и CD45 и красителем 7-AAD. Снижение жизнеспособности клеток фиксировали методом проточной цитофлуориметрии через каждые 24 часа в течение 5 дней. На протяжении всего эксперимента не изменяли клоны антител к CD45 и CD34 и поддерживали идентичные условия для проведения иммунологических реакций и окрашивания клеток.

Зависимость изменения целостности мембран CD34⁺ клеток от времени хранения и коэффициенты изменения целостности мембран этих клеток представлены в таблице 1. Коэффициенты изменения целостности мембран CD34⁺ клеток, необходимые для определения процента жизнеспособных гемопоэтических стволовых клеток на n-й день хранения, вычисляли по формуле:

где k_n - коэффициент изменения целостности мембран клеток;

a_n - увеличение проницаемости мембран клеток для красителя 7-AAD, %.

Значимое снижение жизнеспособности CD34⁺ клеток наблюдалось через 1 сутки хранения в среднем на 1,53% (р < 0,05). Выявили, что при продолжении хранения проницаемость мембран клеток ЛП для флуоресцентного ДНК-тропного красителя 7-AAD увеличивалась.

Изобретение иллюстрировано фигурами 1-7.

Способ осуществляется следующим образом:

Этап 1. Иммунологическое мечение клеток с одновременной окраской флуоресцентным ДНК-тропным красителем. Для этого определяют концентрацию лейкоцитов образца, используя гематологический анализатор, и готовят клеточную суспензию с концентрацией клеток 5×10³ кл / мкл методом разведения. В цитометрическую пробирку вносят 50 мкл клеточного образца, затем добавляют по 5 мкл моноклональных антител к маркерам CD45 и CD34, которые были конъюгированы с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и фикоэритрином (РЕ) соответственно, и 5 мкл флуоресцентного ДНК-тропного красителя 7-AAD. Пробирку встряхивают на медицинском вихревом смесителе и осуществляют инкубацию при температуре плюс 20 ÷ плюс 25°C в темноте для предотвращения разрушения FITC и РЕ под воздействием света. В пробирку добавляют 1 мл лизирующего раствора на основе хлорида аммония, не содержащего фиксирующих компонентов, встряхивают, проводят лизирование в течение 5 минут в темноте при температуре плюс 20 ÷ плюс 25°C.

Этап 2. Оценка результатов иммунологической реакции и ДНК-окрашивания на лазерном проточном цитофлуориметре. Анализ реакции осуществляют непосредственно после ее окончания не позднее 1 часа с момента постановки. Пробирки помещают в пробозаборник лазерного проточного цитофлуориметра. Каждая частица образца, пересекающая луч лазера, анализируется прибором, как отдельное событие. Учитывают прямое светорассеяние (FSC), боковое светорассеяние (SSC) и флуоресценцию с длинами волн для FITC, РЕ и 7-AAD. Используют протокол по гейтированию и логическим ограничениям, рекомендованный Международным обществом по гематотерапии и тканевой инженерии (ISHAGE - International Society for Hematotherapy and Graft Engineering) [4] (фиг. 1-7). Определяют абсолютное число CD45⁺ и CD34⁺ клеток, процент CD34-позитивных клеток-предшественниц.

На фигуре 1 представлен прямоугольный регион «CD45⁺», который ограничивает CD45-позитивные клетки среди всех событий, пересекающих луч лазера, исключая ядросодержащие эритроидные элементы, нелизированные эритроциты, разрушенные клетки. Среди CD45-позитивных клеток выделен полигональный регион лимфоцитов - «Lympho», который включает клетки с высокой экспрессией антигена CD45 и низкими значениями гранулярности.

На фигуре 2 представлен полигональный регион «CD34⁺», характеризующийся высокой экспрессией маркера CD34. Этот график ограничивается событиями, попадающими в регион CD45-позитивных 7-AAD-негативных клеток.

На фигуре 3 представлен полигональный регион «CD45dim», исключающий события с высокой и средней экспрессией маркера CD45, ограниченный событиями, экспрессирующими антиген CD34 на высоком уровне.

На фигуре 4 представлен полигональный регион «HSC 1», состоящий из клеток с высокой экспрессией CD34, низкой экспрессией CD45 и по иммунофенотипу соответствующий клеткам-предшественницам гемопоэза. Этот график ограничивается событиями, попадающими в регион «CD45dim».

На фигуре 5 представлен полигональный регион «HSC 2», который включает только события из региона «Lympho». В процессе измерения образца проводят визуальный контроль и корректировку регионов «Lympho» и «HSC 2», не допуская попадания в регионы клеток со средней гранулярностью. При помощи средств программного обеспечения прибора производят копирование формы региона «HSC 2» на график фигуры 4 в виде региона «HSC 1», что контролирует попадание в данный регион только низкогранулярных недифференцированных клеток.

На фигуре 6 представлен полигональный регион «Debris», который отражает события, относящиеся к разрушенным клеткам и клеточным обломкам.

На фигуре 7 представлен прямоугольный регион «7-AAD⁺», в который попадают все нежизнеспособные клетки образца, информацию о данных событиях учитывают при формировании количества CD34-позитивных предшественников гемопоэза.

Анализируют по 100 тысяч событий в каждой пробе, что обеспечивает высокую достоверность получаемых результатов. Настройки прибора сохраняют на протяжении всего эксперимента.

Этап 3. Расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц гемопоэза. Для этого подсчитывают относительное содержание CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза (CD34⁺ относ.) по формуле 2, которые выделены при последовательном гейтировании из региона CD45-позитивных клеток.

где CD34 абс. - количество клеток-предшественниц, которое определяется, как число событий с высокой экспрессией антигена CD34, низкой экспрессией антигена CD45 и низкой гранулярностью, подсчитанное в полигональном регионе «HSC 1»;

k_n - коэффициент изменения целостности мембран CD34⁺ клеток на n-ый день хранения (Таблица 1);

CD45 абс. - количество лейкоцитов в образце, которое определяется, как число событий позитивных по антигену CD45, подсчитанное в прямоугольном регионе «CD45⁺».

Вычисляют трансплантационную дозу CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза {Доза CD34⁺) по формуле 3.

где CD34⁺ относ. - относительное содержание CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза, %;

С (лейк.) - концентрация лейкоцитов в образце, кл / мкл;

V - объем ЛП, мкл;

m - масса тела больного - реципиента CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза, кг.

Представленные ниже клинические примеры подтверждают возможность использования заявляемого способа при количественном определении гемопоэтических стволовых клеток в ЛП и расчете трансплантационной дозы клеток-предшественниц.

Пример 1

ЛП, полученный от донора М. за одну процедуру афереза, имеет следующие характеристики: CD34 абс. = 337 событий, CD45 абс. = 68133 событий, С (лейк.) = 201000 кл / мкл, V=200000 мкл, m=35 кг, время хранения 4 суток при температуре плюс 2 ÷ плюс 6°C, k₄=0,947.

Расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц в образце без учета поправочных коэффициентов по формулам 2, 3:

Расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц в образце по заявляемому способу с учетом поправочных коэффициентов по формулам 2, 3:

Пример 2

ЛП, полученный от донора П. за одну процедуру афереза, имеет следующие характеристики: CD34 абс. = 580 события, CD45 абс. = 99069 событий, С {лейк.)=194000 клеток/мкл, V=390000 мкл, m=90 кг, время хранения 3 суток при температуре плюс 2 плюс 6°C, k₃=0,958.

Расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц в образце без учета поправочных коэффициентов (коэффициент сокращается, так как равен единице) по формулам 2, 3:

Расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц в образце по заявляемому способу с учетом поправочных коэффициентов по формулам 2, 3:

При расчете по заявляемому способу содержание CD34⁺ клеток в образце характеризуется более точно с учетом изменения целостности мембран целевых клеток. Приведенные примеры подтверждают актуальность использования заявляемого способа для расчета трансплантационный дозы клеток-предшественниц в ЛП при хранении клеточного материала более 24 часов.

Неочевидность предложенного решения вытекает из недостаточности современных представлений об изменении целостности клеточных мембран разных популяций ядросодержащих клеток крови при длительном хранении в условиях охлаждения.

Список литературы

1. Трансфузиология: Клиническое руководство / под ред. М.Ф. Заривчацкого. - Пермь: ГБОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Минздрава России, 2014. - 900 с.

2. Цырлова А.И. Функциональная гетерогенность стволовых кроветворных клеток: выявление методами колониеобразования in vitro. Автореф. дисс. … канд. биол. наук. Новосибирск, 2000. - 19 с.

3. Civin С.I., Strauss L.S. J. Immunol. Antigenic analysis of hematopoiesis. III. A hematopoietic progenitor cell sutface antigen defined by a monoclonal antibody raised against KG-1 a cell. 1984, 133:157-164.

4. Пат. 2513511 РФ, G01N 33/533, C12N 5/0789. Способ количественного определения клеток-предшественников (cd34+) в кроветворной ткани / Гривцова Л.Ю., Тупицын Н.Н. (Россия). - №2012154857/15; Заявлено 19.12.2012; Опубл. 20.04.2014; Бюл. №11.

5. Sutherland DR, Anderson L, Keeney M, et. al. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. J Hematotherapy. 1996, 5:213-226.

6. Dauber K., et al. Enumeration of viable CD34+ cells by flow cytometry in blood, bone marrow and cord blood: results of a study of the novel BD™ stem cell enumeration kit. Cytotherapy. 2011, 13:449-458.

7. Keeney M, Chin-Yee I, Weir J, et. al. Single platform flow cytometric absolute CD34+ cell counts based on the ISHAGE guidelines. Cytometry. 1998, 34:61-70.

8. Gratama J.W., Kraan J., Keeney M, and al. Validation of the single-platform ISHAGE method for CD34+ hematopoietic stem and progenitor cell enumeration in an international multicenter study. Cytotherapy. 2003, 5 (1) 55-65;

9. Методическое пособие к лабораторным занятиям по специальному курсу «Патология клетки» для студентов биологического факультета / авт.-сост.: С.В. Глушен, Т.В. Романовская, В.В. Гринев. - Минск, 2009. - 43 с.