Результат интеллектуальной деятельности: КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ ОСТЕОГЕННОЙ САРКОМЫ ЧЕЛОВЕКА793 OsSar RVV

Изобретение относится к области биотехнологии. Полученная новая клеточная линия остеогенной саркомы 793 OsSar RVV обладает стабильными морфологическими и культуральными характеристиками. Данная клеточная линия может использоваться в клеточной иммунотерапии солидных опухолей для создания биомедицинских клеточных продуктов, пригодна для лабораторных исследований с целью разработки диагностических наборов и тест-систем для определения активности фармацевтических препаратов. Клеточная линия депонирована в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК(П) 789Д.

Остеогенная саркома (ОС) является достаточно редкой опухолью, заболеваемость которой в мире составляет в среднем 3,4 миллиона человек в год [Mirabello L, Troisi RJ, Savage SA (2009) International osteosarcoma incidence patterns in children and adolescents, middle ages and elderly persons. Int J Cancer 125, 229-234. doi: 10.1002/ijc.24320], В то же время ОС является третьим из наиболее распространенных видов злокачественного новообразования в подростковом возрасте после лимфом и опухолей головного мозга с ежегодной частотой 5,6 случаев на миллион детей в возрасте до 15 лет [Pakos ЕЕ, Nearchou AD, Grimer RJ, Koumoullis HD, Abudu A, Bramer JAM, Jeys LM, et al. (2009) Prognostic factors and outcomes for osteosarcoma: an international collaboration. Eur J Cancer 45, 2367-2375. doi: 10.1016/j.ejca.2009.03.005]. В настоящее время стандартом лечения остеосаркомы является неоадъювантная химиотерапия, хирургическое лечение и адъювантная химиотерапия. Хотя после введения химиотерапии результаты лечения пациентов с ОС улучшились, в случае метастатической или неоперабельной ОС результаты лечения остаются, по-прежнему, неудовлетворительными. Чтобы улучшить клиническую эффективность терапии ОС, необходима разработка новых системных методов лечения. За последние 10 лет не было никаких существенных достижений в этом направлении, однако наблюдается медленный прогресс в терапии ОС, так как происходит активное изучение патофизиологических аспектов возникновения и развития данного злокачественного новообразования. Разрабатываются новые системы доставки лекарств, новые подходы иммунотерапии и пересматриваются старые догматы неоадъювантной химиотерапии и хирургической резекции [Misaghi A., Goldin A., Awad М., Kulidjian А.А. (2018) Osteosarcoma: a comprehensive review. SICOTJ 4,12. doi: 10.1051/sicotj/2017028]. Создание клеточных моделей, позволяющих вести экспериментальную работу invitro с использованием клеток человека, является важной составляющей этих исследований. Существование банков постоянных линий опухолевых клеток позволяет проводить исследования на идентичном материале, что важно для выработки стандартных подходов к решению ряда проблем в биологии и медицине. В наши дни работы по приготовлению клеточных линий приобрели систематический характер, однако каждая вновь полученная клеточная линия имеет индивидуальные неповторяющиеся свойства и характеристики, так как является продуктом, полученным из биологического материала конкретного индивидуума. В то же время, получение клеточных линий из сарком человека представляет значительные трудности, и количество подобных клеточных линий ограничено в мировом научном сообществе [Kito F, Oyama R, Sakumoto M, Takahashi M, Shiozawa К, Qiao Z, Sakamoto H, Hirose T, Setsu N, Yoshida A, Kawai A, Kondo T. (2018) Establishment and characterization of novel patient-derived osteosarcoma xenograft and cell line. In Vitro Cell Dev Biol Anim. Aug; 54(7), 528-536. doi: 10.1007/s11626-018-0274-2].

В настоящее время наиболее актуальными направлениями в разработке иммунотерапевтических методов лечения остеогенных сарком являются противоопухолевые вакцины на основе пептидов, дендритных клеток, ингибиторы «контрольных точек» иммунной системы и CAR-Технологии, основанные на применении генноинженерных вариантов Т-лимфоцитов [Miwa S., Shirai Т., Yamamoto N., Hayashi К., Takeuchi A., Igarashi K., Tsuchiya H. Current and Emerging Targets in Immunotherapy for Osteosarcoma. J Oncol. 2019 Jan 1;2019:7035045. doi: 10.1155/2019/7035045]. При разработке и применении этих видов иммунотерапии необходимо иметь достаточный арсенал клеточных линий остеогенных сарком для выделения активирующих молекул и для тестирования активности полученных биомедицинских клеточных продуктов.

Задачей настоящего изобретения является получение новой опухолевой клеточной линии ОС человека, которую потенциально возможно использовать как клеточную модель для изучения молекулярных основ канцерогенеза и разработки новых инновационных методов лечения этого вида злокачественного новообразования.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий, используемых для создания биомедицинских противоопухолевых клеточных продуктов, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличения продолжительности жизни при лечении ОС. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.

Указанный технический результат достигается тем, что получена новая клеточная линия 793 OsSar RVV из опухолевого образца остеогенной саркомы человека, экспрессирующая специфические антигены и продуцирующая специфические молекулы. Полученная клеточная линия 793 OsSar RVV обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК(П) 789Д.

Клеточная линия выделена из метастаза остеогенной саркомы в легкое больной Р., 42 г., проходившей лечение в специализированном онкологическом медицинском учреждении. Материал получен при хирургическом удалении метастатического образования.

Получение клеточной линии 793 OsSar RVV осуществлено следующим образом.

Опухолевая ткань получена хирургическим путем. Измельченные стерильным скальпелем образцы опухоли (1-3 мм²) подвергали механической дезагрегации в автоматическом режиме, помещая их на стерильные ножи, в течение 30 с - 1 мин. Полученную суспензию клеток пропускали последовательно через стерильные нейлоновые фильтры 100 мкм, 70 мкм, 50 мкм, суспендировали в полной среде и переносили в культуральную посуду, в которой осуществляли культивирование в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 35 пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии 793 OsSar RVV характеризуются следующим образом.

Культура представлена мелкими полигональными клетками с крупными ядрами, содержащими от 1 до 3 крупных ядрышек, ядерно-цитоплазматическое отношение сдвинуто в сторону ядра. Встречаются гигантские многоядерные клетки.

Маркерные признаки клеточной линии 793 OsSar RVV следующие.

Методом проточной цитометрии определена поверхностная экспрессия антигенов: HLA А/В/С - 92,3%; HLA DQ/DP/DR - 91,0%. Клетки экспрессируют раково-тестикулярные антигены NY-ESO-1 и семейств MAGE, BAGE, GAGE.

Методом ПЦР выявлена экспрессия раково-тестикулярных генов PASD1 и SSX1.

Методом иммуноферментного анализа супернатанта клеточной культуры выявлена продукция фоллистатина - 219,98 мкг/мл; G-CSF - 950,2 мкг/мл; фактора роста гепатоцитов - 565,38 мкг/мл; лептина - 619,07 мкг/мл; остеопонтина - 1314,89 мкг/мл.

Культуральные свойства клеточной линии 793 OsSar RVV представлены следующим образом.

Клеточная линия культивируется в питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина, инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование осуществляется при 37°С, 5% СО₂, 100% влажности. Культура имеет адгезионный монослойный тип роста. Во флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевают 2×10⁶ клеток. Пересев 1 раз в неделю в соотношении 1:3 с использованием равных объемов 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена.

Условия криоконсервации следующие.

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Криосреда: DMEM/F12 50%, эмбриональная телячья сыворотка 40%, DMSO 10%; 3×106 клеток/мл на ампулу. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до -25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре - 196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см². Жизнеспособность клеток оценивают по включению трепанового синего. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составляет 90%.

Контаминация исследована следующим образом.

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Методом ПНР были проведены исследования на наличие Mycoplasma pneumonia, genitalium, hominis - тест на микоплазму отрицателен.

Кариологическая характеристика клеточной линии 793 OsSar RVV следующая.

Культура распадается на два основных субклона:

44,X-X,-,der 12,-15,-16,+mar - 40%

50, -X, +3, -7, +14, -15, +16, +19,+marl,mar2,mar3 - 60%

Использование клеточной линии 793 OsSar RVV представлено следующими примерами.

Пример 1 Использование клеточной линии 793 OsSar RVV для создания модельной системы, позволяющей оценить чувствительность опухолевых клеток к цитостатикам.

1. Клеточную линию 793 OsSar RVV культивировали как описано выше. При достижении конфлюэнтного монослоя клетки снимали с субстрата с помощью равновесной смеси 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена.

2. Клетки отмывали дважды в полной культуральной среде, производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

3. Производили клонирование клеток линии 793 OsSar RVV методом предельных разведений. Для этого в 24-луночную планшету (BD Bioscience, США) помещали клетки в стартовой концентрации 200 кл/лунка и прогрессивно уменьшали концентрацию клеток с шагом 2. В качестве фидерных клеток использовали культуру фибробластов легкого эмбриона человека FLECH, помещенную в инсерты с порами диаметром 0,4 мкм (BD Falcon, США) в концентрации 1×10⁵кл/мл.

4. Непрерывно культивировали клонированные клетки линии 793 OsSar RVV до появления клонов с количеством клеток не менее 100-150. Затем для изоляции полученных клонов использовали силиконовые цилиндры для клонирования диаметром 5 мм (Sigma-Aldrich, США).

5. Выделенные клоны наращивали в пластиковых флаконах 25 см³ (Sarstedt, ФРГ) в стандартных условиях и определяли их химиочувствительность.

6. Для оценки химиочувствительности клонированные опухолевые клетки линии 793 OsSar RVV высевали предварительно в 96-луночные планшеты (BD Bioscience, США) в количестве от 2×10⁴ клеток на лунку. Инкубировали в течение 24 часов в условиях СО₂-инкубатора, затем извлекали 100 мкл среды и добавляли 100 мкл раствора исследуемых химиопрепаратов.

7. В качестве химиотерапевтических агентов использовали ифосфамид, доксорубицин, цисплатин и этопозид. Добавляли химиотерапевтические агенты в конечной концентрации, соответствующей 10% пика концентрации в плазме крови больного. Эта концентрация соответствует терапевтической (Salmon S.E., 1981). Продолжительность инкубации с химиотерапевтическими агентами соответствовала периоду полувыведения препарата из циркуляции.

8. В качестве положительного контроля использовали клетки линии 793 OsSar RVV без воздействия, в качестве отрицательного контроля использовали клетки линии 793 OsSar RVV, убитые добавлением 3,7% форгмальдегида.

9. В лунки вносили по 10 мкл раствора МТТ в концентрации 10 мг/мл и оставляли планшеты на 4 часа в условиях СО₂-инкубатора.

10. После образования на поверхности лунок кристаллов формазана, питательную среду аккуратно аспирировали и вносили по 200 мкл диметилсульфоксида для их растворения.

11. Оптическую плотность раствора (Е) измеряли с помощью спектрофотометра Multiskan EX (Thermo Electron Inc., США). Результаты выражали в процентах по отношению к положительному контролю, жизнеспособность клеток в котором принимали за 100% с использованием стандартной формулы (Cree I.A., 2011):

Выживаемость (В) клеток в присутствии исследуемого вещества определяли как:

В=(Е опытных лунок - Е отрицательного контроля) / (Е положительного контроля - Е отрицательного контроля) × 100%.

12. Обнаружили, что исходная клеточная линия 793 OsSar RVV и ее клоны обладают химиорезистентностью по отношению к исследованным препаратам.

Изобретение расширяет арсенал клеточных линий, используемых для создания биомедицинских противоопухолевых клеточных продуктов, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличения продолжительности жизни при лечении ОС. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.