×
05.06.2020
220.018.2428

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК представителей семейства Оленевые

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области молекулярной генетики, геносистематики. Использование набора синтетических олигонуклеотидов позволяет достоверно идентифицировать представителей семейства Оленевые. Изобретение может быть использовано для выявления фальсификата дериватов (кровь, рог, мясо и др.) оленей и подмены их другими продуктами животноводства (курица, КРС, свинья, лошадь, мелкий рогатый скот); в ходе проведения скрининга сырьевого состава мясной продукции, для выявления состава сырья и БАД, а также для контроля на соответствие состава, декларированного производителем. Разработаны праймеры и разрушаемые зонды на основе данных видоспецифичных нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК животных. В качестве видоспецифичных участков нами используется фрагмент митохондриального гена цитохромоксидазы 1 (СОХ 1). 1 пр.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики. Использование набора синтетических олигонуклеотидов позволяет достоверно идентифицировать представителей семейства Оленевые. Изобретение может быть использовано для выявления фальсификата дериватов (кровь, рог, мясо и др.) оленей и подмены их другими продуктами животноводства (курица, КРС, свинья, лошадь, мелкий рогатый скот); в ходе проведения скрининга сырьевого состава мясной продукции, для выявления состава сырья и БАД, а также для контроля на соответствие состава декларированного производителем.

Среди большого количества методов генодиагностики с целью идентификации присутствия ДНК интересующего вида в образце, в качестве основы нашего изобретения был принят формат ПЦР с детекцией в режиме реального времени на основе разрушаемого зонда. ПЦР в реальном времени имеет преимущество перед обычными ПЦР-системами идентификации - отсутствие необходимости последующего анализа, что минимизирует риск контаминации в лаборатории. Характерна также повышенная чувствительность и отсутствие ложноположительного результата при неспецифичном отжиге праймеров. Кроме того, следует отметить обеспеченность практически всех молекулярно-генетических диагностических лабораторий оборудованием, необходимым для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени и широкое использование метода в клинической диагностике и органами госконтроля.

На основе анализа возможных методов детекции продукта полимеразной цепной реакции нами выбран метод на основе разрушаемого зонда, на основе того, что он относится к специфичным методам детекции, возможности свободного его использования без нарушения авторских и смежных прав (первоначально система разрушаемого зонда предложена в 1991 году, при этом все патенты на настоящий момент закончили свое действие).

Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка праймеров и разрушаемых зондов на основе данных видоспецифичных нуклеотидных последовательностей фрагмента митохондриального гена цитохромоксидазы 1 (СОХ 1) представителей семейства Оленевых. В качестве видоспецифичных участков нами используется фрагмент митохондриального гена цитохромоксидазы 1 (cytochrome oxidase subunit I (COX1) gene), обладающий большой копийностью в геноме (от ~100 до >1000 копий в одной клетке). Аналитические методы, основанные на анализе генов митохондриальной ДНК очень чувствительны, надежны и полезны для образцов низкого качества, таких как старые пятна крови, волоски животных, перья птицы и частицы костей из-за большого количества копий мтДНК в то время как методы, использующие ядерную ДНК, часто не применимы к сильно деградированным образцам. Другим преимуществом этих методов является то, что для определения видовой принадлежности исследуемого образца, даже если нет эталонного образца, может использоваться поиск с помощью алгоритма BLAST [Nakamura Н., Muro Т., Imamura S., Yuasa I. (2008) Forensic species identification based on size variation of mitochondrial DNA hypervariable regions. // International Journal of Legal Medicine, 123(2). 177-184].

Прототип - рассмотрим идентификацию некоторых видов оленей с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и капиллярного электрофореза на основе флуоресценции с использованием 4 видоспецифических праймеров, комплементарных участку D-петли митохондриальной ДНК, и цитохрома b в качестве внутреннего ПЦР-контроля. В прототипе используются специфичные наборы праймеров RED для благородного оленя (Cervus elaphus), NIP для пятнистого оленя (Cervus nippon), WAP для вапити (Cervus elaphus subspecies), REIN для северного оленя (Rangifer tarandus) для амплификации фрагмента митохондриального гена цитохромоксидазы 1 (СОХ 1) участка мДНК [Eung Soo, K., Young Hwa, K., Byoung Seob, K., Seung Eun, О., Eui Jung, D., & Mi Young, L. (2012). Multiplex polymerase chain reaction (PCR) and fluorescencebased capillary electrophoresis for identification of deer species from antlers. // African Journal of Biotechnology, 11(13)].

Принципиальные отличия прототипа от заявленного изобретения следующие: идентифицируются представители семейства Оленевые с нуклеотидными последовательностями специфичных праймеров, отличные от заявленных.

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности представителей семейства Оленевые, включающий проведение полимеразной цепной реакции фрагмента митохондриального гена цитохромоксидазы 1 (СОХ 1) мДНК, где для идентификации представителей семейства Оленевые используют специфичные прямой, обратный праймеры и разрушаемый зонд.

Работа над созданием праймеров строится следующим образом.

1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей различных видов животных, либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности животных выбирается участок генома, встречающийся у всех видов.

2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения или вручную подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции (2 праймера и зонд). На данном этапе работа заключается в создании выравнивания многих последовательностей и выборе участка последовательности, где присутствуют отличия для создания прямого, обратного праймеров и зонда. Выравнивание геномных последовательностей означает сравнение последовательностей многих видов друг с другом, поиск гомологичных для животных участков.

3) Изготовление праймеров и зонда производится на автоматических синтезаторах.

4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей.

Анализ нуклеотидного полиморфизма последовательности фрагмента митохондриального гена цитохромоксидазы 1 (СОХ 1) на основании данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и секвенированных de novo последовательностей видов, не размещенных в генбанке, позволяет применить данные последовательности в качестве основы для создания праймеров. Для детекции накопления продукта ПЦР в ходе реакции используют технологию с разрушаемым зондом (Holland Р М, Abramson R D, Watson R, Gelfand D H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. // Proc Natl Acad Sci USA. 1991 August 15; 88(16): 7276-7280).

В качестве флуоресцентной метки используют, например, FAM, в качестве гасителя BHQ1 (возможны другие комбинации флуорофоров и гасителей и это не является предметом охраны авторских прав). Возможно расположение гасителя на 5'-конце флуорофора на 3'-конце зонда. Возможно расположение гасителя на 3'-конце флуорофора на 5'-конце зонда.

Аналогичные наборы, реакционные смеси, праймеры для амплификации и выявления видовой принадлежности представителей семейства Оленевые не известны.

Ход работы с применением набора синтетических олигонуклеотидов для амплификации состоит из следующих шагов.

Пример:

1) Образец животной ткани перед проведением ПЦР с помощью заявляемого набора проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора Diamont DNA kit, в соответствии с инструкцией производителя; в ходе этой процедуры из животного материала выделяется ДНК, которую в свою очередь используют для ПЦР.

2) Полимеразную цепную реакцию проводят на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, USA). Амплификация проводится по следующей программе: 1 цикл: 95°С - 3 мин.; 35 циклов: 95°С - 10 сек, 57°С - 15 сек (на данной стадии производится сканирование уровня флуоресценции). Инкубационная смесь, конечным объемом 25 мкл содержит: 14,1 мкл H2O; 2 мкл ДНК; 2,5 мкл 10Х буфер; 2,5 мкл 25 мМ MgCl2; по 1 мкл 10 мМ каждого праймера; 0,5 мкл. зонда; 1,2 мкл 20 мМ dNTPs; 0,2 мкл Taq-полимеразы. Результат амплификации определяют по нарастанию уровня флуоресценции.

Для выявления ДНК представителей семейства Оленевые (благородный олень (Cervus elaphus), пятнистый олень (Cervus nippori), северный олень (Rangifer tarandus), сибирский марал (Cervus elaphus sibiricus)) в качестве прямого праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: Cer-F 5'-AATGTTATCGTAACCGCACA-3', в качестве обратного праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: Cer-R 5'-TTCGAGGGAATGCTATGTCT-3', в качестве разрушаемого зонда используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: CerFAM FAM-5'-TCCCCTAATAATTGGTGCCC-3'-BHQ.

Для выявления представителей семейства Оленевые производили выделение ДНК из крови благородного оленя (Cervus elaphus), пятнистого оленя (Cervus nippori), северного оленя (Rangifer tarandus), сибирского марала (Cervus elaphus sibiricus). В качестве отрицательного контроля использовали ДНК, выделенную из крови коровы (Bos taurus) и свиньи (Sus scrofa), также в качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Амплификацию проводили для каждого образца ДНК в отдельной пробирке в соответствии с указанным выше программой ПЦР и составом реакционной смеси на амплификаторе CFX96. Результаты измерения уровня флуоресценции, отражающего протекание реакции ПЦР в реальном времени визуализировали с помощью стандартного программного обеспечения CFX Manager Bio-Rad (Фиг. 1).

Наличие в образце ДНК представителей Оленевые определяли по превышению уровня флуоресценции реакционной смеси порогового уровня (Threshold). Пороговый уровень устанавливали в автоматическом режиме (15% от максимального уровня флуоресценции). В результате проведенного анализа выявили накопление продукта амплификации для образцов ДНК, выделенной из благородного оленя (Cervus elaphus), пятнистого оленя (Cervus nippon), северного оленя (Rangifer tarandus), сибирского марала (Cervus elaphus sibiricus). Не наблюдали накопление продукта амплификации в пробирках

с образцами ДНК, выделенной из крови коровы (Bos taurus), свиньи (Sus scrofa), а также с отрицательным контролем - деионизированной водой.

Разработан новый набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК представителей семейства Оленевые методом полимеразной цепной реакцией с детекцией в режиме реального времени. Набор обладает высокой чувствительностью и специфичностью, позволяющий быстро и достоверно провести идентификацию рассмотренных представителей семейства Оленевые.

Источник поступления информации: Роспатент

Showing 1-10 of 78 items.
13.01.2017
№217.015.74c5

Безопасный экстракционно-флуориметрический способ определения селена в воде

Изобретение относится к аналитической химии и касается способа определения селена в воде. Сущность способа заключается в том, что к анализируемому раствору добавляют 0,4 мл раствора 3%-ного щелочного борогидрида натрия восстановителя, закрывают пробкой, встряхивают и оставляют на 5 мин для...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002597769
Дата охранного документа: 20.09.2016
25.08.2017
№217.015.bad9

Люминесцирующие металлсодержащие полимеризуемые композиции и способ их получения

Изобретение относится к химии и технологии материалов, преобразующих электромагнитное излучение, и используется для получения люминесцирующих и избирательно поглощающих электромагнитное излучение металлсодержащих полимерных композиций для светотехники, опто- и микроэлектроники. Основой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002615701
Дата охранного документа: 06.04.2017
26.08.2017
№217.015.eda4

Индикатор для обнаружения повышенной концентрации аммиака в воздухе рабочей зоны

Изобретение относится к устройствам для выявления утечек аммиака и может быть использовано в областях химической и холодильной промышленностей, в сфере производства удобрений и аммиака, а также для контроля воздушной среды в производственных помещениях. Индикатор представляет собой основу...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002628883
Дата охранного документа: 22.08.2017
29.12.2017
№217.015.f6d1

Способ пластической деформации металлов и сплавов

Изобретение относится к области пластической обработки металлов, таких как алюминий и его сплавы, и может быть использовано в различных областях промышленности и науки для глубокого формования металлических материалов. Способ пластической деформации алюминия и его сплавов включает механическое...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002639278
Дата охранного документа: 20.12.2017
29.12.2017
№217.015.f79d

Способ получения линимента на березовых почках

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения линимента на березовых почках. Способ получения линимента на березовых почках, включающий подготовку свиного жира, закладку березовых почек и свиного жира в емкость и воздействие на смесь жира и почек...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002639571
Дата охранного документа: 21.12.2017
29.12.2017
№217.015.f90b

Дефектоскоп для сварных швов

Изобретение относится к методам неразрушающего контроля и позволяет обнаруживать дефекты малых размеров и глубокого залегания в сварных швах, соединяющих, преимущественно, неферромагнитные материалы. Дефектоскоп для сварных швов включает в себя аппаратную и программную части. Дефектоскоп...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002639592
Дата охранного документа: 21.12.2017
29.12.2017
№217.015.fb66

Способ концентрирования микроэлементов

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в практике аналитических, агрохимических, медицинских лабораторий. Осуществляют концентрирование микроэлементов для последующего аналитического определения путем соосаждения с диантипирилметаном, образующим в системе вода -...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002640337
Дата охранного документа: 27.12.2017
13.02.2018
№218.016.24a1

Мембранный экстрактор

Изобретение относится к экстракторам системы жидкость-жидкость для применения в биотехнологической, фармацевтической, химической, пищевой промышленности, и, в частности, может быть использовано для ускорения выделения целевых продуктов метаболизма микроорганизмов, например антибиотиков из...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002642641
Дата охранного документа: 25.01.2018
04.04.2018
№218.016.3134

Способ определения иодид-ионов катодной вольтамперометрией

Изобретение относится к области аналитической химии. Способ определения йодид-ионов катодной вольтамперометрией проводят на серебряном электроде в фоновом растворе 0,1 М ацетата натрия, выдерживая потенциал электролиза в диапазоне потенциалов (-0,15±0,05) В при скорости развертки 20 мВ/с - 50...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002645003
Дата охранного документа: 15.02.2018
10.05.2018
№218.016.442b

Биоразлагаемый поливной шланг для капельного орошения

Изобретение относится к области устройств для капельного орошения. Поливной сочащийся шланг для капельного орошения выполнен из биоразлагаемого бумажного крафт-шпагата. Крафт-шпагат пропитан жидким растительным маслом. Шланг выполнен методом плетения. Плетение шланга обеспечивает микропористую...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002649857
Дата охранного документа: 05.04.2018
Showing 1-10 of 15 items.
27.04.2013
№216.012.385f

Способ микроклонального размножения ириса сибирского (i.sibirica l.)

Изобретение представляет собой способ микроклонального размножения I.sibirica L. in vitro. Растения, идентичные исходным экземплярам, получают методом прямой регенерации, минуя каллусную культуру, а в качестве эксплантов используют фрагменты трубки околоцветника и цветоножки. Экспланты...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002479992
Дата охранного документа: 27.04.2013
20.05.2013
№216.012.3f44

Способ получения растений-регенерантов ириса мечевидного (i. ensata thunb.) in vitro

Изобретение относится к способу получения растений-регенерантов ириса мечевидного (I.ensata Thunb.) in vitro. Способ включает стерилизацию бутонов при условии, что бутоны, смоченные в 96%-ном этиловом спирте, обжигают в пламени спиртовки, обеззараживают в 0,1%-ном растворе сульфохлорантина в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002481766
Дата охранного документа: 20.05.2013
20.01.2014
№216.012.9746

Способ очистки дымовых газов

Изобретение относится к комплексной очистке различных газообразных выбросов промышленных производств, в частности дымовых газов. Способ включает прокачивание потока очищаемых газов через емкость, заполненную 5,0-10,0 М водным раствором трифторуксусной кислоты, насыщенным кислородом, отделение...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002504425
Дата охранного документа: 20.01.2014
20.04.2014
№216.012.b990

Композиция на основе 24-эпибрассинолида для регулирования развития и защиты растений

Изобретение относится к области сельского хозяйства, точнее к химическим средствам, используется в растениеводстве. Композиция на основе 24-эпибрассинолида для регуляции развития и защиты растений включает в себя источник аминокислот - гидролизат соевого белка, ПАВ - гептаметилтрисилоксан,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002513232
Дата охранного документа: 20.04.2014
20.08.2014
№216.012.ed13

Набор синтетических олигонуклеитидов для выявления видовой принадлежности родиолы четырехнадрезной (rhodiola quadrifida (pall.) fisch. et mey.)

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности родиолы четырехнадрезной {Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey). Набор включает видоспецифичные участки для создания прямого, обратного праймеров и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002526499
Дата охранного документа: 20.08.2014
10.09.2014
№216.012.f321

Набор синтетических олигонуклеотидов для амплификации и секвенирования its1-5.8s-its2 сосудистых растений

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для амплификации и последующего секвенирования ITS1-5.8S-ITS2 сосудистых растений, включающего проведение полимеразой цепной реакции с помощью универсальных праймеров со следующим нуклеотидным...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002528063
Дата охранного документа: 10.09.2014
10.12.2014
№216.013.0e3b

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности аралии высокой (aralia elata (miq.) seem.)

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии и предназначено для выявления видовой принадлежности аралии высокой (Aralia elata (Miq.) Seem.). Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для ПЦР с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, включающий прямой и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002535060
Дата охранного документа: 10.12.2014
10.12.2014
№216.013.0e3e

Набор синтетичеcких олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности сушеницы болотной (filaginella uliginosa (l.) opiz)

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии и предназначено для выявления видовой принадлежности сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz). Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для ПЦР с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, включающий...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002535063
Дата охранного документа: 10.12.2014
10.12.2014
№216.013.0e3f

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности свободноягодника колючего, элеутерококка (eleutherococcus senticocus (rupr. et maxim.) maxim.)

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии и предназначено для выявления видовой принадлежности свободноягодника колючего, элеутерококка (Eleutherococcus senticocus (Rupr. et Maxim.) Maxim.). Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для ПЦР с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002535064
Дата охранного документа: 10.12.2014
27.04.2015
№216.013.461d

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности вереска обыкновенного (calluna vulgaris (l.) hull.)

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии и предназначено для выявления видовой принадлежности вереска обыкновенного (Calluna vulgaris (L.) Hull.). Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для ПЦР с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, включающий...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002549453
Дата охранного документа: 27.04.2015
+ добавить свой РИД