Результат интеллектуальной деятельности: Трансформант дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий бета-глюканазу

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения трансформантов дрожжей Pichia pastoris, способных продуцировать бета-глюканазу (β-глюканазу).

β-глюканы представляют собой семейство полисахаридов, состоящих из мономеров D-глюкозы, соединенных посредством β-гликозидных связей и являются естественным компонентом клеточных стенок бактерий, грибов, дрожжей или злаков, таких как овес или ячмень. β-глюканы различного происхождения различаются структурой, уровнем разветвления и молекулярной массой, а также физико-химическими свойствами.

β- глюканазы - группа ферментов, катализирующих расщепление β-глюканов с β-1,2-, β-1,3-, β-1,4- и β-1,6-связями.

Важное значение среди ферментов, относящихся к этой группе имеют β-1,3-1,4-глюканазы, которые находят широкое применение, в частности, в пивоварении и при производстве пищевых добавок [FEBS Lett., 1975, 52, 202-207].

Применение β-глюканаз в процессе пивной ферментации приводит к увеличению экстракции семян ячменя и уменьшению количества сусла, снижению образования избыточной вязкости и уменьшения появления осадка в пиве. β-1,3-1,4-глюканазы применяют также в качестве добавки к кормам сельскохозяйственных животных с однокамерным желудком. В птицеводческих и свиноводческих отраслях водорастворимый некрахмальный полисахарид β-глюкан действует как антипитательный агент. Корм для домашних животных, смешанный с ферментами β-1,3-1,4-глюканазы и ксиланазы, усиливает увеличение веса, потребление корма и усвояемость азота (+5,6%) и липидов (+6,2%), а также уменьшает образование липкого помета, что существенно уменьшает санитарные проблемы [Trends in Biotechnology, 1993, 11(10), 424-430].

Природными источниками β-глюканаз являются различные микроорганизмы: бактерии, грибы, дрожжи и актиномицеты.

Большинство кормовых ферментных препаратов, в состав которых входят β-глюканазы, имеют грибное происхождение, тогда как разработка рекомбинантных продуцентов ферментов на основе дрожжей представляет большой интерес с научной и технологической точки зрения, поскольку они более удобны для проведения генно-инженерных работ и быстрее накапливают целевой фермент в сравнении с грибными продуцентами. Существенным преимуществом дрожжевых продуцентов является также то, что на их основе значительно легче создавать продуценты моноферментов, тогда как грибные продуценты обычно синтезируют комплексы целлюлитических ферментов. Промышленное получение моноферментов позволяет более эффективно решать задачи составления оптимальной композиции ферментов при использовании различных субстратов.

Наиболее перспективным является создание продуцентов ферментов на основе рекомбинантных штаммов метилотрофных дрожжей Pichia pastoris. При использовании несбраживаемых источников углерода (глицерина, метанола и т.п.) дрожжи Pichia pastoris способны к росту с образованием биомассы высокой плотности, что позволяет получать значительные количества гетерологичного белка [Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, 54(6), 741-750]. При этом процесс культивирования метилотрофных дрожжей достаточно прост, поскольку их рост не блокируется продуктами метаболизма [FEMS Microbiol. Rev., 2000, 24:45-66, doi: 10.111l/j.l574-6976.2000.tb00532.x].

Известны примеры создания продуцентов β-глюканаз на основе дрожжей Pichia pastoris.

Показано [J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2012 39(6), 869-876], что ген bgl16C1 из Penicillium pinophilum, кодирующий эндо-1,3(4)-β-D-глюканазу, эффективно экспрессируется в клетках дрожжей Pichia pastoris, при этом активность рекомбинантной β-глюканазы в культуральной жидкости при культивировании в 15-литровом ферментере составляет 28721 ед/мл.

Известны также рекомбинантные штаммы Pichia pastoris, продуцирующие термостабильную β-1,3-1,4-глюканазу из Bacillus amyloliquefaciens. [CN 101899458].

В работе [Биотехнология, 2018, Т. 34, №5, С. 12-22] описан ген bgl из Bacillus pumilus, кодирующий β-глюканазу, относящуюся к классу эндо-β-1,3(4)-D-глюканаз (Е.С. 3.2.1.6).

Поскольку гены β-глюканаз различного происхождения экспрессируются в дрожжах Pichia pastoris с различной эффективностью [Биотехнология, 2018, 34(4), 26-36] для конструирования высокопродуктивных штаммов важной задачей является отбор генов, кодирующих β-глюканазу и эффективно работающих в дрожжах Pichia pastoris.

Поиск новых высокоактивных β-глюканаз, обладающих свойствами, необходимыми для их индустриального использования и способных эффективно выражаться в дрожжах, а также создание на их основе промышленно значимых продуцентов является актуальной задачей.

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих β-глюканазу,

Задача решена путем получения - трансформанта дрожжей Pichia pastoris, продуцирующего β-глюканазу, содержащего ген bgl, кодирующий эндо-β-1,3(4)-D-глюканазу из Bacillus safensis или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее, чем на 96%.

К ферментам, аминокислотная последовательность которых гомологична эндо-β-1,3(4)-D глюканазе из Bacillus safensis [NCBI: WP_034622736.1] [NCBI: MH553379] не менее, чем на 96% относятся, например, эндо-β-1,3(4)-D-глюканаза из Bacillus pumilus [NCBI: МН553379], или эндо-β-1,3(4)-D-глюканаза из Bacillus stratosphericus [NCBI: WP_103132685.1], или эндо-β-1,3(4)-D-глюканаза из Bacillus altitudinis [NCBI: WP_073416011.1], или эндо-β-1,3(4)-D-глюканаза из Bacillus aerius [NCBI: PYH23823.1], или эндо-β-1,3(4)-D-глюканаза из Bacillus cellulasensis [NCBI: KIL24001.1], или эндо-β-1,3(4)-D-глюканаза из Bacillus australimaris [NCBI: WP_060698046.]

Получение трансформанта включает введение гена bgl из Bacillus safensis в клетки дрожжей Pichia pastoris с помощью экспрессионной кассеты, включающей в свой состав ген bgl, промотор, работающий в дрожжах Pichia pastoris, сигнальный пептид для осуществления секреции фермента в культуральную жидкость, терминатор, маркерный ген и, предпочтительно, сайт для гомологичной интеграции в хромосому. Интеграцию осуществляют путем либо гомологичной, либо негомологичной рекомбинации. Трансформацию экспрессионной кассеты в клетки дрожжей Pichia pastoris осуществляют путем электоропорации [http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/pich_{_}man.pdf] или методом с использованием полиэтиленгликоля или протопластов [http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K173001].

Конструирование экспрессионной кассеты осуществляют стандартными методами генетической инженерии [Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. - СПб.: СПбГТУ, 1999. Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch Е. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.] с использованием генетических элементов, подходящих для работы с дрожжами Pichia pastoris. В качестве промоторов используют AOX1, DAS, FLD1, ICL1, PHO89, THI11, ADH1, ENO1, GUT1, GAP, TEF1, PGK1, GCW14, G1, G6 или другие [Appl Microbiol Biotechnol (2014) 98:5301-5317]. В качестве сигнальных пептидов используют α-фактор, PHO1, SUC2, PHA-E, KILM1, pGKL, CLY, CLY-L8, K28 pre-pro-toxin или другие [Appl Microbiol Biotechnol (2014) 98:5301-5317]. В качестве селективных маркеров используют любые подходящие маркеры, например, гены резистентности к антибиотикам зеоцину, генетицину (G418) или бластицидину С, а также гены комплементирующие ауксотрофные мутации в геноме Pichia pastoris, например, HIS4, МЕТ2, ADE1, ARG4, URA3, URA5, GUT1 [Yeast 2005; 22: 249-270]. В качестве плечей для гомологичной интеграции используют последовательности генов АОХ1, HIS4 [http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/V17520] или другие последовательности, гомологичные участкам хромосомы дрожжей Pichia pastoris.

Изобретение проиллюстрировано следующей фигурой.

Фиг. 1. Экспрессионная кассета 1

Фиг. 2 Электрофорез гена bgl Bacillus safensis

Изобретение подтверждено следующими примерами.

Пример 1. Конструирование трансформанта дрожжей Pichia pastoris, несущего ген bgl из Bacillus safensis

Получают плазмидный вектор pPIC-bglSaf, содержащий интегративную экспрессионную кассету. В качестве источника гена bgl используют тотальную геномную ДНК штамма Bacillus safensis ВКПМ В-13331. Синтезируют ДНК гена bgl методом ПЦР с использованием праймеров bgl-saf-1 и bgl-saf-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции для клонирования - EcoRI и NotI, соответственно:

bgl-saf-1 5'-aagaattccaaacgggcggttcgttatatga-3'

bgl-saf-2 5'- aagcggccgcttatctaattgtgtaaggca-3'

Полученный фрагмент ДНК обрабатывают рестриктазами EcoRI и NotI и клонируют в состав экспрессионного вектора pPIC9 (http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/V17520).

В состав экспрессионного плазмидного вектора pPIC-bglPum входят следующие генетические элементы:

1. Ген bgl Bacillus safensis, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактора, под контролем АОХ1 промотора

2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1

3. Дрожжевой селективный маркер His4

4. Область интеграции - нуклеотидная последовательность гена АОХ1

5. Селективный маркер для клеток E.coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу,

придающий клеткам устойчивость к ампициллину.

6. Бактериальный pUC origin.

Для получения интегративной экспрессионной кассеты 1 (фиг. 1) плазмиду pPIC-bglSaf обрабатывают эндонуклеазой рестрикции BglII.

Полученную интегративную экспрессионную кассету трансформируют в клетки Pichia pastoris.

Штамм Pichia pastoris GS115 (his4) предварительно выращивают в жидкой питательной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (мас. 2%) до концентрации 1×10⁸ клеток на 1 мл. Клетки центрифугируют, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1 М сорбитола. Промытые клетки инкубируют в 25 мМ растворе дитиотрейтола в течение 15 минут, затем промывают в ледяном растворе 1 М сорбитола. Обработанные таким образом клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1 М сорбитола в концентрации 1-5×10⁹ клеток на 1 мл. Аликвоту, объемом 40 мкл клеточной суспензии, переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 400 нг ДНК экспрессионной интеграционной кассеты, и инкубируют во льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25 uF. После порации добавляют 1 мл ледяного раствора 1 М сорбитола.

Селекцию трансформантов ведут на агаризованной среде YNB (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия) с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 5 суток при температуре 30°С.

Для отбора наиболее продуктивных трансформантов проводят их культивирование в жидкой ферментационной питательной среде YP с добавлением метанола (3 мас. %) в 96-луночных планшетах при 30°С в течение 72 ч на качалке (250 об/мин). В качестве контроля используют штамм Pichia pastoris GS115 (his4).

Определение активности β-глюканазы в культуральной жидкости проводят с использованием ДНС метода [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428] в 96-луночном планшете следующим образом. В каждой лунке смешивают 25 мкл 1% раствора субстрата β-глюкана ячменя в 0,5 М ацетатном буфере (рН 6) и 25 мкл культуральной жидкости. Инкубацию проводят при 50°С 10 минут, после чего добавляют в лунку 50 мкл раствора ДНС. Планшет прогревают при 99°С 10 минут и измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 546 нм. В качестве стандарта используют раствор глюкозы.

По результатам ферментации отбирают наиболее продуктивный трансформант №47, который при культивировании в планшете синтезирует β-глюканазу в количестве 114 ед/мл культуральной жидкости.

Для подтверждения наличия в хромосоме полученного штамма вставки гена bgl Bacillus safensis методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) используют хромосомальную ДНК, выделенную из клеток этого штамма и специфические праймеры BglPum-f и BglPum-r

bgl-saf-1 5'-aagaattccaaacgggcggttcgttatatga-3'

bgl-saf-2 5'- aagcggccgcttatctaattgtgtaaggca-3'

Режим реакции ПЦР:

95°С - 3 мин - 1 цикл

30 циклов:

95°С - 30 сек

60°С - 30 сек

72°С - 60 сек

72°С - 5 мин - 1 цикл.

Для контроля величины амплифицированного фрагмента ДНК при электрофорезе использован молекулярный маркер GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Fermentas) (линия 2, фиг. 2, размер фрагментов снизу вверх 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п.н.). Наработка фрагмента ДНК размером 642 п.н. (линия 1 фиг. 2) свидетельствует о присутствии в хромосоме штамма вставки гена bgl Bacillus safensis

Пример 2. Продукция β-глюканазы трансформантом Pichia pastoris 47, несущим ген bgl из Bacillus safensis

Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 10 мл жидкой питательной среды YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 30°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10.

Ферментацию проводят при 30°С на качалке (250 об/мин) в питательной среде состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, вода - остальное с добавлением глюкозы (1 мас. %) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 5 мл. Через 18 часов добавляют метанол (1 мас. %) Ферментацию продолжают в течение 72 часов, добавляя метанол (1 мас. %) через каждые 24 часа. После окончания ферментации определяют количество фермента β-глюканазы в культуральной жидкости с использованием ДНС метода.

Через 72 часа ферментации количество фермента составило 597 ед/мл культуральной жидкости.

Пример 3. Конструирование трансформантов дрожжей Pichia pastoris, несущих ген bgl из Bacillus altitudinis

Получают плазмидный вектор pPIC-bglAlt, содержащий интегративную экспрессионную кассету. В качестве источника гена bgl используют тотальную геномную ДНК штамма Bacillus altitudinis ВКПМ В-11231. Синтезируют ДНК гена bgl методом ПЦР с использованием праймеров bgl-alt-1 и bgl-alt-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции для клонирования - EcoRI и NotI, соответственно:

bgl-alt-1 5'-aagaattccaaacgggcggttcgttatatga-3'

bgl-alt-2 5'-aagcggccgcttatctaattgtgtaaggca-3'

Полученный фрагмент ДНК обрабатывают рестриктазами EcoRI и NotI и клонируют в состав экспрессионного вектора pPIC9 (http://www.thermofisher.coni/order/catalog/product/V17520).

В состав экспрессионного плазмидного вектора pPIC-bglAlt входят следующие генетические элементы:

1. Ген bgl_Bacillus altitudinis, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактора, под контролем АОХ1 промотора

2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1

3. Дрожжевой селективный маркер His4

4. Область интеграции - нуклеотидная последовательность гена АОХ1

5. Селективный маркер для клеток E.coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину.

6. Бактериальный pUC origin.

Для получения интегративной экспрессионной кассеты плазмиду pPIC-bglAlt обрабатывают эндонуклеазой рестрикции BglII.

Трансформацию указанной интегративной экспрессионной кассеты в дрожжи Pichia pastoris GS115 (his4), отбор наиболее активных трансформантов и определение активности β-глюканазы в культуральной жидкости проводят как описано в примере 1.

По результатам ферментации отобран наиболее продуктивный трансформант №68, который при культивировании в планшете синтезирует β-глюканазу в количестве 98 ед/мл культуральной жидкости.

Пример 3. Конструирование трансформантов дрожжей Pichia pastoris, несущих ген bgl из Bacillus pumilus

Получают плазмидный вектор pPIC-bglPum, содержащий интегративную экспрессионную кассету. В качестве источника гена bgl используют тотальную геномную ДНК штамма Bacillus pumilus Bg57 ВКПМ В-13195. [Биотехнология, 2018, Т. 34, №5, С. 12-22] Синтезируют ДНК гена bgl методом ПЦР с использованием праймеров bgl-pum-1 и bgl-pum-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции для клонирования - EcoRI и NotI, соответственно:

bgl-pum-1 5'-aagaattccaaacgggcgggtcgttttatga-3'

bgl-pum-2 5'-aagcggccgcttatctttttgtgtaacgca-3'

Полученный фрагмент ДНК обрабатывают рестриктазами EcoRI и NotI и клонируют в состав экспрессионного вектора pPIC9 (http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/V17520).

В состав экспрессионного плазмидного вектора pPIC-bglPum входят следующие генетические элементы:

1. Ген bgl_Bacillus pumilus, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактора, под контролем АОХ1 промотора

2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1

3. Дрожжевой селективный маркер His4

4. Область интеграции - нуклеотидная последовательность гена АОХ1

5. Селективный маркер для клеток E.coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину.

6. Бактериальный pUC origin.

Для получения интегративной экспрессионной кассеты плазмиду pPIC-bglPum обрабатывают эндонуклеазой рестрикции BglII.

Трансформацию указанной интегративной экспрессионной кассеты в дрожжи Pichia pastoris GS115 (His4), отбор наиболее активных трансформантов и определение активности β-глюканазы в культуральной жидкости проводят как описано в Примере 1.

По результатам ферментации отобран наиболее продуктивный трансформант №85, который при культивировании в планшете синтезирует β-глюканазу в количестве 103 ед/мл культуральной жидкости.