3-(2-ОКСОИМИДАЗОЛИДИНИЛ-5)ИНДОЛЫ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к органической и фармацевтической химии, а именно к производным индолов и 2-имидазолидинонов, конкретно к 3-(2-оксоимидазолидинил-5)индолам общей формулы I, обладающим противовоспалительной активностью, и к способу их получения.

где R¹=Н, C₁-C₆ алкил;

R²=Н, C₁-C₆ алкил, С₆Н₄Х, где X=Н, Me;

R³=арил.

Заявляемые соединения общей формулы I, их свойства и способы получения в литературе не описаны.

Заявляемые соединения общей формулы I представляют собой бис-гетероциклические соединения, содержащие в своем составе ядра 2-имидазолидинона и индола, конкретно производные 1- и/или 2-замещенного индола, в котором в третьем положении находится 1-арил-2-оксоимидазолидин-5-ильный заместитель.

Известно, что соединения, содержащие 2,3-алкилиндольный скаффолд, проявляют широкий спектр биологической активности [Шульц Э.Э., Карцев В.Г., Толстиков Г.А. Химия и биологическая активность индольных алкалоидов. М.: Научное партнерство, 2018. - 880 с.]. В свою очередь, соединения, содержащие фрагмент 2-имидазолидинона перспективны для изучения их биологической активности: имидазольное кольцо играет ключевую роль в структуре и функциях некоторых важных биологических объектов (гистидин, гистамин, прекурсоры пурина и др.). Содержащий в своем составе акцептор водородной связи структурный аналог имидазола - 2-имидазолидинон может как усиливать, так и полностью изменять биологические свойства исследуемых объектов. Так, например, 2-имидазолидинон является составной частью антигипертензивного препарата имидаприла, применяющегося и для лечения хронической сердечной недостаточности [Demolis P. et al., Fundam. Clin. Pharmacol. 8, 80, 1994]. В свою очередь, производное фенилиндола, содержащее в своем составе ядро 2-имидазолидинона, известно как антипсихотический препарат сертиндол и используется при лечении шизофрении [Lewis R., Bagnall A.M., Leitner M., Sertindole for schizophrenia. Cochrane Database of Systematic Reviews, 3, 2005,. Art. No.: CD001715].

Поиск новых терапевтических агентов, в том числе и в ряду замещенных индолов, необходим из-за проблем, связанных с непереносимостью известных лекарственных средств, потерей их эффективности в процессе лечения, а также неизбирательностью действия. Бис-гетероциклические соединения, содержащие индольный фрагмент, перспективны с точки зрения коррекции имеющейся биологической активности, проявления новых ее видов, улучшения их фармакологических свойств и создания новых лекарственных препаратов. Они представляют собой мощный структурный инструмент, с помощью которого можно направленно модифицировать молекулы фармакологически активных соединений. Так, известно, что соединения, содержащие пиримидоиндольный скаффолд, были использованы в дизайне противоопухолевых препаратов [Reader J.C., Matthews Т.P., et al., J. Med. Chem. 2011, 54, 8328]. Замещенные им идазол ил индолы также проявляют физиологическую активность, в частности в качестве ингибиторов протеинкиназы С [WO 99/32483, 1999, C07D 403/04], и могут быть использованы при лечении воспалительных, иммунологических, бронхолегочных, сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний [WO 00/78750 А1, 2000, C07D 403/04].

Введением дополнительного гетероцикла в биоактивные молекулы можно изменять их рKа, конструировать конформационные затруднения, варьировать гидрофильно-гидрофобный баланс, увеличивать липофильность, причем указанные параметры можно модулировать как в отдельности, так и в различных комбинациях.

Известно, что введение дополнительного гетероциклического ядра часто позволяет получить соединения, превосходящие по активности действующие препараты [Archana S. et al. Res. Chem. Intermed., Springer, 2017, 43(4), 2471]. Введение 2-оксоимидазолидинильной группы в гетероциклический скаффолд на основе замещенных индолов обеспечивает его дополнительное взаимодействие с гидрофобными карманами белка-мишени. В то же время 3-(2-оксоимидазолидинил-5)индолы I как потенциальные лекарственные препараты содержат и другие фармакофорные элементы, в частности акцепторы и доноры водородной связи, в положениях 1 и/или 2.

Описаны производные имидазолининдолов общей формулы А, которые можно рассматривать как структурные аналоги заявляемых соединений [WO 00/78750 A1, 2000, C07D 403/04], однако они содержат ароматический фрагмент имидазолона вместо имидазолидинона, как в случае соединений формулы I, и получаются путем внутримолекулярной конденсации соответствующих соединений формулы Б. Получить соединения формулы I таким способом не представляется возможным. Соединения А проявляют физиологическую активность и рекомендованы для применения при лечении воспалительных, иммунных и ряда других заболеваний.

где R₁=Н, C₁-C₆ алкил, фторзамещенный C₁-C₆ алкил, фенил, карбоС₁-С₆алкокси;

R₂=Н, C₁-С₆ алкил, аминоС₁-С₆ алкил, гидрокси-С₁-С₆ алкил;

R₃=Н, С₁-С₆ алкокси; R₄=Н, гидрокси-С₁-С₃ алкил или амидинотио-С₁-С₃ алкил.

Известен способ получения производных индолов путем амидоалкилирования, заключающийся в реакции α-гидроксиалкиламидов (структурно близких к заявляемым) с индолом [Свиридова Л.А., Афанасьева С.В., Голубева Г.А., Терентьев П.Б., Бундель Ю.Г. ХГС, 1990 (9), 1207-1213]. Однако распространить этот способ на получение 3-(2-оксоимидазолидинил-5)индолов не удалось. Кроме того, в описанных авторами условиях реализуется 2,3-перегруппировка Планше, свойственная производным индолов [Ciamician G., Plancher G. Chem. Ber., 29, 2475 (1896)], и образуется трудноразделимая смесь 2- и 3- производных индолов.

Наиболее близким к заявляемому способу является известный способ получения бис-гетероциклических соединений на основе индола, конкретно способ получения пирролидинилиндолов, аналогов бисгетероциклов формулы I [Sadovoy А.V., Kovrov А.Е., Golubeva G.A., Sviridova L.A. Chem. Heterocycl. Comp., 2011, 46, (10), 1215]. Однако этот способ апробирован только для производных циклических амидов кислот и имеет ограничения с точки зрения дизайна физиологически активных бисгетероциклических производных индолов, что обусловлено низким содержанием алифатических гетероядер, способных вступать в подобного рода взаимодействия.

Задачей настоящего изобретения является создание ранее неизвестных 3-(2-оксоимидазолидинил-5)индолов, включающих комбинацию фармакофорных элементов двух различных классов гетероциклов - индолов и 2-имидазолидинонов.

Совокупность таких фармакофорных элементов, как индольное и имидазолидиновое ядра, в структуре заявляемых 3-(2-оксоимидазолидинил-5)индолов формулы I может обеспечить широкий спектр их физиологической активности.

Технический результат - получены новые соединения, обладающие противовоспалительной активностью, которые могут найти применение в медицине, и разработан технологичный способ их получения.

Поставленная задача решается новыми соединениями 3-(2-оксоимидазолидинил-5)индолами общей формулы I,

где R¹=Н, С₁-С₆ алкил; R²=Н, C₁-C₆ алкил, С₆Н₄Х, где X=Н, Me; R³ = арил, обладающими противовоспалительной активностью, а также способом их получения.

Заявляемый способ включает взаимодействие 5-гидроксиимидазолидин-2-онов общей формулы II

где R³ = арил,

с эквимолярным количеством индола формулы III

где R¹=Н, C₁-C₆ алкил; R²=Н, C₁-C₆ алкил, С₆Н₄Х, X=Н, Me,

в присутствии 1-10 мол. % эфирата трехфтористого бора в тетрагидрофуране при комнатной температуре.

Заявляемый способ позволяет получать соединения формулы I в одну стадию, он основан на реакции электрофильного замещения индолов общей формулы III по наиболее активному положению 3 при взаимодействии с 5-гидроксиимидазолидин-2-оном II (Схема 1) в присутствии каталитических количеств эфирата трехфтористого бора.

Реакцию осуществляют в мягких условиях: при комнатной температуре в ТГФ в течение непродолжительного времени (0,5-3 ч), и заявляемые 3-(2-оксоимидазолидинил-5)индолы I получают с выходами 19-32%.

Несомненным достоинством заявляемого способа является возможность получения соединений формулы I в одну стадию из доступных исходных соединений - 1- и/или 2-замещенных индолов III и легко синтезируемых из глицина гидроксиимидазолидин-2-онов II [Cortes S., Kohn Н., J. Org. Chem., 1983, 48 (13), 2247] (Схема 2), при использовании стандартного катализатора - эфирата трехфтористого бора.

Предлагается технологичный способ получения производных индолов общей формулы I, который не требует нагревания реакционной среды, использования специальной аппаратуры, предполагает регенерацию отработанных растворителей и возможность масштабировать процесс без уменьшения выхода целевого продукта.

На фиг. 1 представлены результаты исследования противовоспалительного действия соединений Ia-If на линии клеток BV-2, обработанной 1 мкг/мл бактериального липополисахарида, 18 ч инкубации, реакция Гриса, среднее значение ± стандартное отклонение (на основании 3 экспериментов).

На фиг. 2 представлены данные по цитотоксичности соединений Ia-If в отношении клеток человеческой нейробластомы SH-SY5Y (24 ч инкубации), МТТ-тест, приведено среднее значение ± стандартное отклонение (на основании 3 экспериментов).

На фиг. 3 представлены результаты исследования цитотоксичности соединений Ia-If в отношении клеток мышиной микроглии BV-2 (24 ч инкубации), МТТ-тест, среднее значение ± стандартное отклонение (на основании 3 экспериментов).

Противовоспалительное действие

В условиях индукции воспалительного ответа бактериальным липополисахаридом на линии клеток мышиной микроглии BV-2 для всех соединений зафиксирована противовоспалительная активность (фиг. 1). Наибольшей активностью обладали соединения Ie и Id, обеспечивавшие подавление до 50% ответа уже в диапазоне низких концентраций от 0.1 до 10 мкМ.

Цитотоксичность

Для клеток нейробластомы SH-SY5Y соединения были низкотоксичными (фиг. 2). Соединения Ia, Ib и Ic не проявляли токсического действия вплоть до концентрации 100 мкМ. Для соединений Ie, Id, If была зафиксирована цитотоксичность в диапазоне концентраций от 10 до 100 мкМ с EC₅₀ соответственно 147±10, 95±5, 57±5 мкМ (среднее значение ± стандартное отклонение, на основании 3 экспериментов).

Значения EC₅₀ вычисляли с помощью программы GraphPad Prism 6.01 путем аппроксимирования экспериментальных данных кривой, описываемой формулой Хилла:

где Е - наблюдаемый эффект, n_H - коэффициент Хилла, характеризующий наклон кривой, а А - концентрация вещества.

Для линии BV-2 также зафиксирована низкая цитотоксичность (фиг. 3). Вещества Ia и Ic вновь оказались нетоксичными, соединения Ie, Id и Ib вызывали гибель от 20 до 40% клеток при концентрации 100 мкМ. Соединение If проявило значимую токсичность в интервале концентраций 10-100 мкМ с EC₅₀=19±3 мкМ (среднее значение ± стандартное отклонение, на основании 3 экспериментов).

Изобретение иллюстрируется конкретными примерами осуществления, приведенными ниже.

Спектры ЯМР ¹Н полученных соединений регистрировали на приборах Bruker Avance 400 (рабочая частота 400 МГц) и Agilent 400-MR (рабочая частота 400 МГц) в ДМСО-d₆, спектры ЯМР ¹³С - на приборе Bruker Avance™600 (рабочая частота 150.93 МГц). Элементный анализ выполняли в лаборатории элементного анализа ИНЭОС РАН. Температуры плавления определяли на приборе Electrothermal IA 9100. Контроль за ходом реакций и чистотой продуктов осуществляли методом ТСХ на пластинах Silufol-UV₂₅₄ с закрепленным слоем силикагеля. Элюент CHCl₃ - МеОН (10:1), проявление парами йода и реактивом Ковача. Растворители очищали по стандартным методикам. Исходное соединение 1-фенил-5-гидроксиимидазолидин-2-он (II) получали восстановлением LiAlH₄ соответствующего производного гидантоина, синтезируемого из глицина и фенилизоцианата [Cortes S., Kohn Н., J. Org. Chem., 1983, 48 (13), 2247]. Выход 56%. Т. пл. 112-114°С. ИК-спектр, υ, см^-1: 1700 (С=O). ¹Н ЯМР-спектр, δ, м.д.(ДМСО_d6) 3.08 (1Н, д, J=3 Гц, Н-4), 3.58-3.62 (1Н, м, Н-4'), 5.58-5.62 (1Н, дд, Н-5), 6.42 (1Н, д, ОН), 6.95-7.05 (2Н, м, Ph), 7.24-7.30 (2Н, м, Ph), 7.35 (1Н, с, NH), 7.60 (2Н, д, Ph).

Общая методика получения соединений Ia-If.

Растворяют 1 ммоль 1-фенил-5-гидроксиимидазолидин-2-она (II) и 1 ммоль индола III в 10 мл сухого тетрагидрофурана. При перемешивании добавляют несколько капель (1-10 мол. %) эфирата трехфтористого бора. Реакционную смесь перемешивают от получаса до трех часов, образовавшийся осадок отфильтровывают и промывают небольшим количеством диэтилового эфира. Фильтрат упаривают, образовавшееся масло кристаллизуют из этилового спирта.

Пример 1

3-(1-Фенил-2-оксоимидазолидинил-5)-1H-индол (Ia)

К раствору 0.188 г (1 ммоль) 1-фенил-5-гидроксиимидазолидин-2-она II и 0.117 г (1 ммоль) индола III в 10 мл тетрагидрофурана при перемешивании добавляют 5 мол. % эфирата трехфтористого бора. Реакционную смесь перемешивают 1 час, затем образовавшийся осадок отфильтровывают и промывают небольшим количеством диэтилового эфира. Объединенный фильтрат упаривают, образовавшееся масло кристаллизуют из этилового спирта. Получают 0.083 г 3-(1-фенил-2-оксоимидазолидинил-5)-1Н-индола (Ia). Выход 30%. Т. пл. 244°С. ИК-спектр, υ, см^-1: 1680 (С=O); 3350 (NH). Найдено, %: С 71.41; Н 5.46; N 14.23. 2C₁₇H₁₅N₃O×H₂O. Вычислено, %: С 71.31; Н 5.63; N 14.68. Масс-спектр, m/z: 277 [М]⁺.

¹Н ЯМР-спектр, δ, м.д.: 3.35-3.37 (1Н, м, Н-4), 3.84-3.88 (1Н, м, Н-4'), 5.72 (1Н, дд, J=6.23 Гц, J=9.24 Гц, Н-5), 6.87 (1Н, т, J=7.36 Гц, p-Ph), 6.95 (1Н, с, NH_imid), 6.97-7.00 (1Н, м, Ind), 7.06-7.08 (1Н, м, Ind), 7.13-7.15 (2Н, м, m-Ph), 7.31 (1Н, с, 2-Ind), 7.33-7.34 (1Н, д, J=7.66 Гц, Ind), 7.46-7.47 (2Н, д, J=8.01 Гц, o-Ph), 7.62-7.63 (1Н, д, J=7.66 Гц, Ind), 10.87 (1Н, с, NH_ind). ¹³С ЯМР-спектр, δ, м.д.: 45.80, 53.86, 112.25, 114.58, 119.15, 119.34,120.88 (2С), 121.70, 122.67, 124.57, 125.46, 128.42 (2С), 137.28, 140.22, 159.62.

Пример 2

1-Метил-3-(1-фенил-2-оксоимидазолидинил-5)индол (Ib)

Аналогично примеру 1 из 0.178 г (1 ммоль) 1-фенил-5-гидроксиимидазолидин-2-она II и 0.131 г (1 ммоль) 1-метилиндола III после 0.5 часа перемешивания получено 0,073 г 1-метил-3-(1-фенил-2-оксоимидазолидинил-5)индола Ib. Выход 25%. Т. пл 233°С. ИК-спектр, υ, см^-1: 1695 (С=O). Найдено, %: С 71.77; Н 5.72; N 13.63. 2C₁₈H₁₇N₃O×Н₂О. Вычислено, %: С 71.98; Н 6.04; N 13.99. Масс-спектр, m/z: 291 [М]⁺.

¹Н ЯМР-спектр, δ, м.д.: 3.30 (1Н, м, Н-4), 3.68 (3Н, с, N-CH₃), 3.82 (1Н, т, J=9 Гц, Н-4'), 5.71 (1Н, дд, J=6.06 Гц, J=9.20 Гц, Н-5), 6.87 (1Н, т, J=7.36 Гц, p-Ph), 7.01-7.03 (1Н, м, Ind), 7.11-7.16 (1Н, м, Ind, 2Н, м, m-Ph), 7.33 (1Н, с, 2-Ind), 7.35-7.37 (1Н, д, J=7.7 Гц, Ind), 7.46-7.47 (2Н, д, J=8.03 Гц, o-Ph), 7.61-7.62 (1Н, д, J=7.7 Гц, Ind).

¹³С ЯМР-спектр, δ, м.д.: 32.79, 45.63, 53.17, 53.21, 110.51, 113.47, 119.34, 119.51, 120.60 (2С), 121.86, 122.68, 125.59, 128.52 (2С), 128.83, 137.50, 139.86, 159.50.

Пример 3

2-Метил-3-(1-фенил-2-оксоимидазолидинил-5)-1Н-индол (Ic)

Аналогично примеру 1 из 0.178 г (1 ммоль) 1-фенил-5-гидроксиимидазолидин-2-она II и 0.131 г (1 ммоль) 2-метилиндола III после 2 часов перемешивания получают 0.081 г 2-метил-3-(1-фенил-2-оксоимидазолидинил-5)-1Н-индола Ic. Выход 28%. Т. пл. 275°С. ИК-спектр, υ, см^-1: 1681 (С=O); 3240 (NH). Найдено, %: С 74.51; Н 6.27; N 14.32. C₁₈H₁₇N₃O. Вычислено, %: С 74.20; Н 5.88; N 14.32. Масс-спектр, m/z: 291 [М]⁺.

¹Н ЯМР-спектр, δ, м.д.: 2.41 (3Н, с, СН₃), 3.34 (1Н, м, Н-4), 3.76 (1Н, м, Н-4'), 5.72 (1Н, дд, Н-5), 6.84-6.87 (1Н, м, p-Ph), 6.90-6.92 (1Н, м, Ind), 6.95 (1Н, м, Ind), 7.11-7.16 (2Н, т, J=7.8 Гц, m-Ph), 7.19-7.20 (1Н, д, J=7.9 Гц, Ind), 7.33-7.34 (2Н, д, J=8.0 Гц, o-Ph), 7.48-7.50 (1Н, д, J=7.9 Гц, Ind), 10.88 (1Н, с, NH_ind).

¹³С ЯМР-спектр, δ, м.д.: 11.71, 44.86, 52.53, 109.21, 111.13, 118.28, 119.12, 120.81, 120.86, 122.81, 128.39 (4С), 133.79, 135,62, 139.74, 159.52.

Пример 4

1,2-Диметил-3-(1-фенил-2-оксоимидазолидинил-5)индол (Id)

Аналогично примеру 1 из 0.178 г (1 ммоль) 1-фенил-5-гидроксиимидазолидин-2-она II и 0.145 г (1 ммоль) 1,2-диметилиндола III после 2 часов перемешивания получают 0.058 г 1,2-диметил-3-(1-фенил-2-оксоимидазолидинил-5)индола Id. Выход 19%. Т. пл. 278°С. ИК-спектр, υ, см^-1: 1699 (С=O). Найдено, %: С 73.18; Н 6.07; N 13.32. 2C₁₉H₁₉N₃O×H₂O. Вычислено, %: С 72.59; Н 4.41; N 13.37. Масс-спектр, m/z: 305 [М]⁺.

¹Н ЯМР-спектр, δ, м.д.: 2.45 (3Н, с, 2-СН₃), 3.30-3.34, (1Н, м, Н-4), 3.58 (3Н, с, N-CH₃), 3.78-3.82 (1Н, м, Н-4'), 5.76-5.80 (1Н, м, Н-5), 6.84-6.86 (1Н, м, p-Ph), 6.94-6.96 (1Н, м, Ind), 7.02-7.04 (1Н м, Ind), 7.11-7.13 (2Н, м, m-Ph), 7.30-7.33 (1Н, м, Ind; 2Н, o-Ph), 7.51 (1Н, д, J=7.9 Гц, Ind).

¹³С ЯМР-спектр, δ, м.д.: 10.33, 29.67, 44.97, 52.80, 109.30, 109.84, 118.42, 119.41(2С), 120.91(2С), 122.85,128.83 (3С), 135.54, 137.01, 139.74 159.89.

Пример 5

2-р-Толил-3-(1-фенил-2-оксоимидазолидинил-5)-1Н-индол (Ie)

Аналогично примеру 1 из 0.178 г (1 ммоль) 1-фенил-5-гидроксиимидазолидин-2-она II и 0.207 г (1 ммоль) 2-р-толилиндола III после 2 часов перемешивания получают 0.118 г 2-р-толил-3-(1-фенил-2-оксоимидазолидинил-5)-1Н-индола Ie. Выход 32%. Т. пл. 317°С. ИК-спектр, υ, см^-1: 1684 (С=O); 3282 (NH). Найдено, %: С 74.27%; Н 5.69; N 10.70. C₂₄H₂₃N₃O. Вычислено, %: С 74.78; Н 6.01; N 10.90. Масс- спектр, m/z: 367 [М]⁺.

¹Н ЯМР-спектр, δ, 2.42 (3Н, с, Tol - СН₃), 3.54-3.58 (1Н, м, Н-4), 4.01-4.06 (1Н, м, Н-4'), 5.59-5.63 (1Н, м, Н-5), 6.77-6.79 (1Н, м, p-Ph), 6.94-7.08 (4Н Ph, м, 1Н, м, Ind), 7.02-7.04 (1Н,м, Ind), 7.21 (1Н, с, NH_imid), 7.28-7.31 (1Н, м, Ind), 7.38-7.46 (4Н, м, Tol), 7.57-7.59 (1Н, м, Ind), 11.32 (1Н, с, NH_ind).

¹³С ЯМР-спектр, δ, м.д.: 21.34, 44.93, 52.85, 109.79, 111.96, 119.47, 119.65, 120.32 (2С), 121.95, 122.60, 128.26 (3С), 129.03 (2С), 129.42 129.93 (2С), 136.59, 137.59, 138.13, 139.63, 159.40.

Пример 6

1-Метил -2-р-толил-3-(1-фенил-2-оксоимидазолидинил-5)индол (If)

Аналогично примеру 1 из 0.178 г (1 ммоль) 1-фенил-5-гидроксиимидазолидин-2-она II и 0.221 г (1 ммоль) 1-метил-2-р-толил-индола III после 3 часов перемешивания получают 0,107 г 1-метил -2-р-толил-3-(1-фенил-2-оксоимидазолидинил-5)-индола If. Выход 28%. Т. пл. 183°С. ИК-спектр, υ, см^-1: 1701 (С=O). Найдено, %: С 78.44; Н 6.02; N 10.65. C₂₅H₂₃N₃O. Вычислено, %: С 78.71; Н 6.08; N 11.02. Масс-спектр, m/z: 381 [М]⁺.

¹Н ЯМР-спектр, δ, м.д.: 2.45 (3Н, с, Tol - CH₃), 3.43-3.45, (1Н, м, Н-4), 3.49 (3Н, с, N-СН₃), 3.88-3.91 (1Н, м, Н-4'), 5.19 (1Н, м, Н-5), 6.80-6.82 (1Н, м, p-Ph), 7.00-7.06 (2Н, м, Ph; 2Н, м, Tol; 1Н, м, Ind), 7.13-7.16 (1Н, м, Ind), 7.31-7.33 (2Н, м, Ph), 7.41-7.45 (1Н, м, Ind; 2Н, м, Tol), 7.60-7.62 (1Н, м, Ind).

¹³С ЯМР-спектр, δ, м.д.: 21.40, 30.57, 45.30, 54.45, 109.57, 110.16, 119.75, 119.99, 122.01, 122.39, 123.83, 125.12, 127.70, 128.20 (4С), 129.34 (2С), 130.39, 137.36, 138.38, 138.91, 140.09, 160.17.

Методы определения цитотоксичности и противовоспалительного действия соединений Ia-If

Для биологических экспериментов использовали питательную среду DMEM, L-глутамин, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В, МТТ, раствор трипсина в ЭДТА, раствор Эрла, D-глюкозу, раствор Версена фирмы Панэко, Россия; ДМСО, липополисахарид, сульфаниламид, нафтилэтилендиамин и Triton Х-100 фирмы Sigma-Aldrich, США; изопропанол и HCl фирмы Химмед, Россия; эмбриональную коровью сыворотку фирмы BioSera, Франция.

Эксперименты проводили на клетках мышиной микроглии линии BV-2 (CVCL_0182) и человеческой нейробластомы линии SH-SY5Y (ATCCCRL-2266). Клетки культивировали в среде DMEM, в которую добавляли следующие компоненты до приведенных ниже конечных концентраций: L-глутамин - до 4 мМ; эмбриональную коровью сыворотку - до 10%; пенициллин - до 100 ед/мл; стрептомицин - до 100 мкг/мл и амфотерицин В - до 2.5 мкг/мл. Все линии клеток культивировали при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% содержанием CO₂.

Для оценки противовоспалительного действия накануне эксперимента клетки в культуральной среде высеивали в 96-луночный планшет с плотностью 15 тыс. на лунку (100 мкл на лунку). Воспаление индуцировали бактериальным липополисахаридом (LPS). Для этого 100 мкл свежей культуральной среды, содержащей LPS (1 мкг/мл) и испытуемое вещество в концентрации 100, 10, 1 и 0.1 мкМ (получены серийным разведением из стокового раствора в ДМСО), добавляли к 100 мкл старой среды в лунках. Клетки инкубировали в течение 18 ч, после чего оценивали воспалительный ответ по накоплению в среде продукта метаболизма оксида азота - NO₂^-. Концентрацию нитрит-аниона измеряли по методу Гриса. Для этого к 75 мкл анализируемой смеси добавляли 12.5 мкл 0.04% водного раствора сульфаниламида, выдерживали при комнатной температуре 10 мин с защитой от света, затем добавляли 12.5 мкл 2% раствора нафтилэтилендиамина в 3М HCl в воде, выдерживали еще 10 мин при комнатной температуре с защитой от света, после чего определяли оптическое поглощение при длине волны 540 нм. В качестве контроля использовали клеточные образцы только со средой культивирования и со средой культивирования с добавлением LPS.

Для оценки цитотоксичности клетки (15 тыс. клеток в 100 мкл культуральной среды) рассеивали в 96-луночные планшеты с плотностью 15 тыс. на лунку. В лунки вносили по 100 мкл растворов исследуемых веществ в культуральной среде, приготовленных серийным разведением их стоковых растворов в ДМСО до конечных концентраций 100, 10, 1 и 0.1 мкМ (финальное содержание ДМСО не более 0.5% по объему). Контроль содержал только ДМСО, положительный контроль - 0.5% Triton Х-100. Клетки инкубировали при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% содержанием CO₂ в течение 24 ч. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-теста. Для этого среду удаляли и заменяли раствором МТТ в жидкости Эрла (0.5 мг/мл) с добавлением 1 г/л D-глюкозы и инкубировали 1.5 ч в CO₂-инкубаторе. После этого добавляли к лункам равный объем 0.04 М HCl в изопропаноле и инкубировали с перемешиванием при 37°С 30 мин. Оптическую плотность полученного раствора оценивали при длинах волн 594 и 620 нм с помощью аппарата Эфос 9304 (МЗ Сапфир, Россия). Процент клеток, выживших при действии конкретной дозы исследуемого соединения, подсчитывали как частное от деления средней оптической плотности в лунках после инкубации с данной дозой на среднюю оптическую плотность в контрольных лунках. Действие каждого соединения во всех концентрациях изучали трижды и получали усредненные данные по результатам трех экспериментов.