Результат интеллектуальной деятельности: Штамм микроорганизмов Staphylococcus warneri S1 в качестве деструктора углеводородов, содержащихся в почвах, загрязненных нефтью и нефтепродуктами

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии, экологии, охране окружающей среды и представляет собой новый штамм бактерий, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов, который может быть использован в нефтяной промышленности и нефтехимии для очистки почвы и природных водоемов от нефти и нефтепродуктов (моторных топлив, минеральных масел, газовых конденсатов).

Несмотря на значительное количество работ, посвященных микробиологической утилизации нефтеотходов и биовосстановлению загрязненных углеводородами почв, данная проблема остается открытой для новых решений, при этом остро стоит вопрос биологической очистки почв, загрязнение которых вызвано нефтью с повышенным содержанием сернистых соединений.

Известен штамм микроорганизмов Pseudomonas stutzeri MEV-S1 в качестве деструктора углеводородов в почвах, загрязненных нефтью и нефтепродуктами [Патент РФ №2228952, опубл. 20.05.2004]. Недостатком этого биологического средства при применении в подобном качестве является сравнительно низкая степень очистки от различных углеводородов тех нефтезагрязненных почв, загрязнение которых вызвано нефтью с повышенным содержанием сернистых соединений.

Известен также штамм микроорганизмов Micrococcus luteus VKM Ac-2627D - деструктор углеводородов в почвах, загрязненных нефтью и нефтепродуктами [Патент РФ №2687131, опубл. 07.05.2019]. Недостатком данного биологического средства, которое по совокупности признаков и достигаемому техническому эффекту является наиболее близким к заявляемому нами объекту и взято нами за прототип, также является сравнительно низкая степень очистки от различных углеводородов тех нефтезагрязненных почв, загрязнение которых вызвано нефтью с повышенным содержанием сернистых соединений.

Таким образом, технической проблемой, на решение которой направлено изобретение, является расширение арсенала микробиологических деструкторов углеводородов, содержащихся в почвах при загрязнении нефтью и нефтепродуктами, а также увеличение степени очистки почв при утилизации нефтепродуктов и нефти с повышенным содержанием сернистых соединений, с помощью бактериальных штаммов микроорганизмов.

Техническим результатом изобретения является новый продукт, расширяющий номенклатуру штаммов, и способный очищать от различных углеводородов почвы, загрязнение которых вызвано нефтью или нефтепродуктами с повышенным содержанием сернистых соединений, с эффективностью, превышающей таковую для прототипа на 20-60%.

Указанная техническая проблема решается, и технический результат достигается тем, что получен новый штамм микроорганизмов Staphylococcus warneri S1 - деструктор углеводородов, содержащихся в почвах, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

До настоящего времени штамм микроорганизмов Staphylococcus warneri S1 и его применение в качестве деструктора углеводородов, содержащихся в почвах, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в литературе не описаны. Известно, однако, применение близкого к нему микробиологического объекта - штамма Staphylococcus warneri IEGM-KL-1 по иному назначению, а именно для ингибирования роста клеток грампозитивных бактерий [Патент РФ №2200195, опубл. 10.03.2003].

В связи с этим есть все основания полагать, что заявляемый нами объект соответствует критериальному признаку изобретения - новизна. Поскольку из уровня техники не выявлены решения, совпадающие с существенными признаками, характеризующими заявляемый новый объект, невозможно предсказать априори наличие у него указанных свойств, а именно существенного повышения степени очистки почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами с повышенным содержанием сернистых соединений, по сравнению с таковой для штамма-прототипа, то отмеченное обстоятельство позволяет сделать заключение, что заявляемый нами объект явным образом не следует из известного в данной отрасли техники уровня и ему присущ критериальный признак изобретения - изобретательский уровень. Подтверждением соответствия критерию промышленная применимость является указание, в какой области может быть использован заявляемый штамм микроорганизмов, показана возможность реализации назначения изобретения.

Штамм депонирован в Национальном биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра «Курчатовский институт») под регистрационным номером В-13521, дата депонирования 16.12.2019.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик по [Зенова, Г.М. Практикум по микробиологии почв / Г.М. Зенова, А.Л. Степанов, Н.А. Лихачева и др. // М.: Изд-во Моск. ун-та. - 2002. - 120 с.; Колешко, О.И. Экология микроорганизмов почвы. Лабораторный практикум / О.И. Колешко // Минск: Высшая школа. - 1981. - 175 с.; Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: МГУ. - 1991. - 304 с.], а также идентификация штамма Staphylococcus warneri S1 до вида - с помощью анализа 16S РНК. По результатам проведенного анализа сиквенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм наиболее близок к виду Staphylococcus warneri (99%).

Полученный штамм Staphylococcus warneri S1 характеризуется следующими признаками.

Видовое название штамма - Staphylococcus warneri S1.

Родословная штамма. Выделен из загрязненной нефтью черноземной почвы Азнакаевского муниципального района Республики Татарстан.

Способ получения штамма. Найден в естественных условиях, а именно выделен из загрязненной нефтью черноземной почвы Азнакаевского муниципального района Республики Татарстан в 2016 году коллективом авторов И.А. Дегтяревой, Е.А. Прищепенко, А.Я. Давлетшиной, Т.Ю. Мотиной, М.И. Султановым.

Культурально-морфологические особенности штамма.

Грамположительные кокки, неспорообразующие, диаметр клетки 0.8-1.0 мкм, неподвижные. Форма колоний на плотных питательных средах (мясопептонном агаре (МПА)) округлая, от 0.3 до 0.9 см, бежевого цвета, блестящие, консистенция однородная, полужидкая, колония легко снимается с агара, на жидких (мясопептонный бульон (МПБ)) - с равномерным помутнением.

Физиолого-биохимические признаки. Факультативный анаэроб. Хемоорганотроф.

Растет при рН 6,8-7,4 при температуре от +15° до +45°С.

Растет на питательных средах (среда МПА (г/л водопроводной воды): мясопептонный бульон (МПБ) - 200 мл; пептон - 8,0; NaCl - 3,0; агар-агар - 20,0; среда Лурия (г/л дистиллированной воды): дрожжевой экстракт - 5,0; пептон - 15,0; NaCl - 5,0; агар - 15,0. Стерилизация всех этих сред при 1 атм.), в том числе на средах с 5-10% NaCl. На жидких средах дает равномерное помутнение.

Способен расти в жидкой среде с углеводородами в среде Ворошиловой-Диановой (г/л водопроводной воды): KNO₃ - 1,0; MgSO₄×7H₂O - 0,2; NaCl - 1,0; K₂HPO₄ - 1,0; углеводороды вносили после стерилизации. Стерилизация при 1 атм.

Хранение возможно в эппендорфе, на жидкой среде (МПБ, Ворошиловой-Диановой (В-Д), LB бульоне и др.) с добавлением количества 10% диметилсульфоксида к стерильной среде.

Бактерии штамма обладают высокой биохимической активностью, образуют ферменты катехол-2,3-диоксигеназу, фумарилацетоацетат-гидролазу и салицилат-1-монооксигеназу, участвуют в биодеградации ароматических углеводородов. Углеводы ферментируют до кислоты без газа, разжижают желатин, образуют сероводород.

Штамм не является зоопатогенным или фитопатогенным, не представляет опасности и по каким-либо другим причинам.

Испытания заявляемого штамма микроорганизмов Staphylococcus warneri S1 в качестве деструктора углеводородов проведены на серых лесных почвах, черноземных, подзолистых, загрязненных нефтью, дизельным топливом, другими видами нефтепродуктов (керосином, газовым конденсатом). Во всех случаях были получены сравнимые результаты - в результате использования заявляемого штамма степень очистки почв, загрязненных такими веществами, возрастает на 20-60% по сравнению с таковой для штамма-прототипа.

Изобретение может быть проиллюстрировано посредством приведенных ниже примеров.

Пример 1 (получение штамма микроорганизмов Staphylococcus warneri S1)

Штамм микроорганизмов Staphylococcus warneri S1 обнаружен авторами И.А. Дегтяревой, Е.А. Прищепенко, А.Я. Давлетшиной, Т.Ю. Мотиной, М.И. Султановым в естественных условиях, а именно выделен из загрязненной нефтью черноземной почвы Азнакаевского муниципального района Республики Татарстан в 2016 году.

Выращивание культуры данного микроорганизма осуществляют по методике [Saravanan V., Vijayakumar S. Isolation and screening of biosurfactant producing microorganisms from oil contaminated soil. J Acad Ind Res 2012; 1:264-8] в среде МПА следующего состава (г/л водопроводной воды): мясопептонный бульон (МПБ) - 200 мл; пептон - 8.0; NaCl - 3.0; агар-агар - 20.0; среде Лурия (г/л дистиллированной воды): дрожжевой экстракт - 5.0; пептон - 15.0; NaCl - 5.0; агар - 15.0; среде Ворошиловой-Диановой (г/л водопроводной воды): KNO₃ - 1.0; MgSO₄×7Н₂О - 0.2; NaCl - 1.0; K₂HPO₄ - 1.0. Стерилизацию всех сред проводят при давлении 1 атм. Культурально-морфологические особенности полученного штамма: грамположительные кокки, диаметр клетки 0.8-1.0 мкм, факультативный анаэроб, неспорообразующий, форма колоний на плотных питательных средах округлая, выпуклая, на жидких с равномерным помутнением.

Пример 2

Отбирают образец серой лесной почвы массой 1.0 кг, в которую вводят высокосернистую нефть из Ромашкинского месторождения Республики Татарстан с массовой долей сернистых соединений 2.0% в количестве 50 г (5% от массы почвы) и тщательно перемешивают. В загрязненную почву вносят 20 мл водной дисперсии штамма Staphylococcus warneri Sic титром 2.5×10⁹ клеток/см³, приготовленного по Примеру 1, после чего выдерживают полученную смесь при температуре +20°С в течение 10 суток.

Биологическую активность штамма в отношении его способности к очистке почв, загрязненных нефтью и/или нефтепродуктами, оценивают по степени снижения содержания углеводородов по истечении вышеуказанного периода времени (СО) в масс. %, которую определяют по формуле СО=100⋅[1-(C_t/C_o)], где C_o - содержание углеводородов (г/кг почвы) до введения дисперсии штамма микроорганизмов, C_t - содержание углеводородов (г/кг почвы) на момент завершения эксперимента (в данном случае - 10 суток). Определение содержания углеводородов в почве осуществляют ИК спектроскопическим методом в соответствии с методикой [Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в почвах и донных отложениях методом ИК-спектрометрии. ПНД Ф 16.1:2.2.22-98. - Москва, 1998. 35 с]. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 6.5 масс. %.

Данные по степени очистки почвы от углеводородов нефти представлены в Таблице 1.

Пример 3 осуществляют в условиях примера 2, однако процесс очистки почвы ведут в течение 20 суток. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 15.0 масс. %.

Пример 4 осуществляют в условиях примера 2, однако процесс очистки почвы ведут в течение 30 суток. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 22.5 масс. %.

Пример 5 осуществляют в условиях примера 2, однако процесс очистки почвы осуществляют в течение 45 суток. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 36.5 масс. %.

Пример 6 осуществляют в условиях примера 2, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +10°С. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 2.8 масс. %.

Пример 7 осуществляют в условиях примера 3, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +10°С. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 7.5 масс. %.

Пример 8 осуществляют в условиях примера 4, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +10°С. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 12.5 масс. %.

Пример 9 осуществляют в условиях примера 5, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +10°С. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 20.5 масс. %.

Пример 10 осуществляют в условиях примера 2, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +30°С. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 6.0 масс. %.

Пример 11 осуществляют в условиях примера 3, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +30°С. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 13.5 масс. %.

Пример 12 осуществляют в условиях примера 4, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +30°С. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 21.0 масс. %.

Пример 13 осуществляют в условиях примера 5, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +30°С. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 34.3 масс. %.

Пример 14 осуществляют в условиях примера 5, однако процесс очистки почвы осуществляют, вводя в очищаемую почву 40 мл/кг водной дисперсии штамма Staphylococcus warneri S1 с тем же самым титром 2.5×10⁹ клеток/см³. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 38.0 масс. %.

Пример 15 (сравнительный), осуществляют в условиях примера 2, однако в качестве деструктора углеводородов используют штамм микроорганизмов Micrococcus luteus М-171 (RCAM03279) в виде водной дисперсии с титром 2.5×10⁹ клеток/см³. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 5.2 масс. %.

Пример 16 осуществляют в условиях примера 15, однако процесс очистки почвы ведут в течение 20 суток. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 10.5 масс. %.

Пример 17 осуществляют в условиях примера 15, однако процесс очистки почвы ведут в течение 30 суток. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 17.3 масс. %.

Пример 18 осуществляют в условиях примера 15, однако процесс очистки почвы ведут в течение 45 суток. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 29.0 масс. %.

Пример 19 осуществляют в условиях примера 18, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +10°С. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 16.2 масс. %.

Пример 20 осуществляют в условиях примера 18, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +30°С. Степень очистки почвы от углеводородов нефти составляет 28.1 масс. %.

Пример 21 осуществляют в условиях примера 2, однако в качестве объекта для очистки от углеводородов используют серую лесную почву, загрязненную нефтепродуктом - дизельным топливом, полученным из высокосернистой нефти Ромашкинского месторождения Республики Татарстан (зимняя солярка Танэко). Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 7.2 масс. %.

Все данные по степени очистки почвы от углеводородов дизельного топлива представлены в Таблице 2.

Пример 22 осуществляют в условиях примера 21, однако процесс очистки почвы ведут в течение 20 суток. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 18.9 масс. %.

Пример 23 осуществляют в условиях примера 21, однако процесс очистки почвы ведут в течение 30 суток. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 26.7 масс. %.

Пример 24 осуществляют в условиях примера 21, однако процесс очистки почвы ведут в течение 45 суток. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 44.0 масс. %.

Пример 25 осуществляют в условиях примера 21, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +10°С. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 4.5 масс. %.

Пример 26 осуществляют в условиях примера 22, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +10°С. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 9.4 масс. %.

Пример 27 осуществляют в условиях примера 23, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +10°С. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 14.4 масс. %.

Пример 28 осуществляют в условиях примера 24, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +10°С. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 24.2 масс. %.

Пример 29 осуществляют в условиях примера 21, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +30°С. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 6.8 масс. %.

Пример 30 осуществляют в условиях примера 22, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +30°С. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 17.3 масс. %.

Пример 31 осуществляют в условиях примера 23, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +30°С. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 23.8 масс. %.

Пример 32 осуществляют в условиях примера 24, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +30°С. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 40.5 масс. %.

Пример 33 осуществляют в условиях примера 32, однако процесс очистки почвы осуществляют, вводя в очищаемую почву 40 мл/кг водной дисперсии штамма Staphylococcus warneri S1 с тем же самым титром 2.5×10⁹ клеток/см³. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 48.5 масс. %.

Пример 34 (сравнительный), осуществляют в условиях примера 21, однако в качестве деструктора углеводородов используют штамм микроорганизмов Micrococcus luteus М-171 (RCAM03279) в виде водной дисперсии с титром 2.5×10⁹ клеток/см³. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 6.0 масс. %.

Пример 35 осуществляют в условиях примера 34, однако процесс очистки почвы ведут в течение 20 суток. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 11.8 масс. %.

Пример 36 осуществляют в условиях примера 34, однако процесс очистки почвы ведут в течение 30 суток. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 18.8 масс. %.

Пример 37 осуществляют в условиях примера 34, однако процесс очистки почвы ведут в течение 45 суток. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 31.0 масс. %.

Пример 38 осуществляют в условиях примера 37, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +10°С. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 18.2 масс. %.

Пример 39 осуществляют в условиях примера 37, однако процесс очистки почвы ведут при температуре +30°С. Степень очистки почвы от дизельного топлива составляет 30.1 масс. %.

Как можно видеть из приведенных данных в Таблице 1 и 2, заявляемый в качестве деструктора углеводородов штамм микроорганизмов Staphylococcus warneri S1 позволяет существенно - на 22-43% повысить степень очистки почвы, загрязненной высокосернистой нефтью, и на 20-60% в случае загрязнения продуктом ее переработки - дизельным топливом, по сравнению с той степенью ее очистки, которая может быть достигнута при использовании с этой же целью штамма-прототипа.

Для наглядности в таблице 3 приведены данные примеров, описывающих эксперименты, произведенные в одинаковых условиях как для заявляемого штамма Staphylococcus warneri S1, так и для штамма Micrococcus luteus М-171 (RCAM03279) по прототипу для корректности сравнения.

Степень очистки почвы от углеводородов нефти:

для примеров 2 и 15 составляет 6.5% и 5.2% соответственно, что превышает данные прототипа на 25%,

для примеров 3 и 15 составляет 15.0% и 10.5% соответственно, что превышает данные прототипа на 43%,

для примеров 4 и 17 составляет 22.5% и 17.3% соответственно, что превышает данные прототипа на 30%,

для примеров 5 и 18 составляет 36.5% и 29.0% соответственно, что превышает данные прототипа на 26%,

для примеров 9 и 19 составляет 20.5% и 16.2% соответственно, что превышает данные прототипа на 26%,

для примеров 13 и 20 составляет 34.3% и 28.1% соответственно, что превышает данные прототипа на 22%.

Степень очистки почвы от углеводородов дизельного топлива:

для примеров 21 и 34 составляет 7.2% и 6.0% соответственно, что превышает данные прототипа на 20%,

для примеров 22 и 35 составляет 18.9% и 11.8% соответственно, что превышает данные прототипа на 60%,

для примеров 23 и 36 составляет 26.7% и 18.8% соответственно, что превышает данные прототипа на 42%,

для примеров 24 и 37 составляет 44.0% и 31.0% соответственно, что превышает данные прототипа на 42%,

для примеров 28 и 38 составляет 24.2% и 18.2% соответственно, что превышает данные прототипа на 33%,

для примеров 32 и 29 составляет 40.5% и 30.1% соответственно, что превышает данные прототипа на 34%.

Таким образом, можно сделать вывод, что заявляемый штамм Staphylococcus warneri S1 позволяет повысить степень очистки почвы на 22-43% от углеводородов нефти, и на 20-60% от углеводородов дизельного топлива по сравнению с прототипом.

Предложен новый продукт, расширяющий номенклатуру штаммов, преимуществом которого является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью (превышающей таковую для прототипа на 20-60%) по отношению как к высокосернистой нефти, так и к продуктам ее переработки в относительно короткие сроки, в диапазоне температур от +10 до +30°С, который может быть использован для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, керосин авиационный, бензин).