N,N-КОМПЛЕКС ДИХЛОРОДИ-[3,5-ДИМЕТИЛ-4-((БЕНЗИЛСУЛЬФАНИЛ)МЕТИЛ)-1H-ПИРАЗОЛ]ДИГИДРАТ МЕДИ(II) - СЕЛЕКТИВНЫЙ ИНГИБИТОР ФЕРМЕНТА α-АМИЛАЗА

Предлагаемое изобретение относится к области новых соединений, обладающих ингибирующей активностью в отношении фермента α-амилаза, конкретно, к N,N-комплексу дихлороди-[3,5-диметил-4-((бензилсульфанил)метил)-1H-пиразол]дигидрат меди(II) формулы (1):

Подобные соединения могут найти применение в качестве синтетических сахароснижающих агентов, механизм терапевтического действия которых базируется на блокирующем эффекте α-амилазы - фермента ответственного за расщепление сложных углеводов пищи и полисахаридов [Камынина Л.Л. Роль и место ингибиторов альфа-амилазы в комбинированном лечении сахарного диабета: Автореф … дис. кан. мед. наук. - М.: 2012. - 24 с.].

Известны моноядерные комплексы меди(II) [В. Kupcewicz, K. Sobiesiak, K. Malinowska, K. Koprowska, М. Czyz, В. Keppler, Е. Budzisz. Copper(II) complexes with derivatives of pyrazole as potential antioxidant enzyme mimics // Med. Chem. Res., 2013, 22, 2395-2402] с лигандами на основе пиразола: 5-(2-гидроксибензоил)-3-метил1-(2-пиридинил)-1Н-пиразол-4-фосфоновой кислоты диметиловый эфир, 5-(2-гидроксифенил)-3-метил-1-(2-пиридил)-1Н-пиразол-4-карбоновой кислоты метиловый эфир и 1-бензотиазол-2-ил-5-(2-гидроксифенил)-3-метил-1Н-пиразол-4-карбоновой кислоты метиловый эфир, проявляющие окислительно-восстановительный потенциал Cu(II)/Cu(I) (E1/2) и способны действовать, как имитаторы антиоксидантных ферментов (антиоксидантные свойства). Известные комплексы меди(II) с пиразольными лигандами не проявляют ингибирующую активность по отношению к ферменту α-амилаза.

Известен ингибитор α-амилазы на основе растительных препаратов (Арфазетин), используемый в виде отвара [Реестр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств и товаров аптечного ассортимента. Режим доступа: https://www.rlsnet.ru/tn_index_id_6257.htm; Р.В. Кунакова, Р.А. Зайнуллин, Э.К. Хуснутдинова, Б.И. Ялаев, Е.П. Сегура, А.Д. Ильин.

Растения как перспективные источники ингибиторов амилазы при разработке функциональных продуктов питания и профилактики сахарного диабета // Вестник АН РБ, 2016, Т. 21, №1 (81), С. 6-15]. Терапевтический эффект обусловливают биологически активные вещества, содержащиеся в компонентах сбора: флавоноиды, антоциановый гликозид миртиллин - в побегах черники обыкновенной; флавоноиды (рутин, робинии) и тритерпеновые гликозиды - в створках плодов фасоли; витамины С, Р, каротиноиды и органические кислоты - в плодах шиповника; флавоноиды, кремниевая кислота и сапонины - в траве хвоща полевого; флавоноиды и производные антрацена (гиперицин) - в траве зверобоя; эфирное масло и флавоноиды из цветков ромашки. Недостатками данного лекарственного средства является использование ограниченных растительных ресурсов.

Известен ингибитор α-амилазы на основе олигосахаридов (Акарбоза) получаемый путем ферментации с помощью микроорганизмов штамма Actinoplanes utahensis [Acarbose - Compound Summary. PubChem. Open chemistry database. Режим доступа https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/444254#section=Top], тормозящий переваривание и всасывание углеводов в тонкой кишке и, как следствие, сокращающий рост концентрации глюкозы в крови после употребления углеводсодержащей пищи. Недостатком данного препарата служат отсутствие препаративных методов его синтеза и побочные реакции организма, а также низкая биодоступность препарата.

Известен ингибитор α-амилазы (2R,3R,4R,5S)-1-(2-гидроксиэтил)-2-(гидроксиметил)пиперидин-3,4,5-триол (Миглитол) [Реестр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств и товаров аптечного ассортимента. Миглитол (Miglitol). Режим доступа https://www.rlsnet.ru/mnn_index_id_2618.htm], являющийся пероральным антидиабетическим препаратом, который замедляет расщепление ди-, олиго- и полисахаридов до глюкозы и угнетает ее абсорбцию. Понижает постпрандиальный уровень глюкозы, положительно воздействует на липидный обмен. В отличие от Акарбозы, Миглитол всасывается кишечником.

Известен синтетический ингибитор α-амилазы (прототип) 4,4'-[этан-1,2-диилбис(сульфандиилметандиил)]бис(3,5-диметил-1H-пиразол) [V. Maksimov, R. Zaynullin, N. Akhmadiev, Е.Р. Segura-Ceniceros, J.L. Martinez Hernandez, Bikbulatova E., V. Akhmetova, R. Kunakova, R. Ramos, A. Ilyina. Inhibitory effect of 4,4'-[ethane-1,2-diylbis(sulfandiylmethanediyl)]bis(3,5-dimethyl-1H-pyrazole) and its derivatives on alpha-amylase activity // Med. Chem. Res., 2016, 25, 1384-1389] являющийся конкурентным ингибитором, получаемый реакцией формальдегида с 1,2-этандитиолом и 2,4-пентандионом в присутствии катализатора NiCl₂⋅6H₂O с последующим добавлением гидразингидрата в среде метанола в течение 3 ч.

Задачей изобретения является расширение арсенала биологически активных веществ выявлением ингибирующей активности в отношении фермента α-амилаза у нового металлокомплексного соединения.

Технический результат достигается тем, что в качестве металлокомплексного соединения, обладающего ингибирующей активностью в отношении фермента α-амилаза, предлагается N,N-комплекс дихлороди-[3,5-диметил-4-((бензилсульфанил)метил)-1H-пиразол]дигидрат меди(II) формулы (1).

Заявляемое соединение формулы (1) синтезируют по методике [Ахметова В.Р., Ахмадиев Н.С., Нуртдинова Г.М., Хисамутдинов Р.А., Ибрагимов А.Г., Джемилев У.М. Способ получения N,N-комплексов дихлороди-[3,5-диметил-4-(сульфанилметил)-1Н-пиразол]дигидрата меди(II). Патент №2677484 Российская Федерация. Бюл. №2. 5 с.] взаимодействием 4-((бензилсульфанил)метил)-3,5-диметил-1H-пиразола с дигидратом хлорида меди(II) (CuCl₂⋅2H₂O) в среде ацетонитрила при мольном соотношении 4-((бензилсульфанил)метил)-3,5-диметил-1H-пиразол : CuCl₂⋅2H₂O, равном 2:1, при температуре 20°C и атмосферном давлении в течение 4 ч, с образованием N,N-комплекса дихлороди-[3,5-диметил-4-((бензилсульфанил)метил)-1H-пиразол]дигидрат меди(II) формулы (1) с выходом 76%. 4-((Бензил сульфанил)метил)-3,5-диметил-1H-пиразол синтезирован по методике [Н.С. Ахмадиев, В.Р. Ахметова, Т.Ф. Бойко, А.Г. Ибрагимов. Катализируемая никелем многокомпонентная гетероциклизация 2,4-пентандиона в сульфанилметил-1Н-пиразолы. // ХГС, 2018, №3(54), 344-350].

Реакция протекает по схеме:

N,N-Комплекс дихлороди-[3,5-диметил-4-((бензилсульфанил)метил)-1H-пиразол]дигидрат меди(II) формулы (1) образуется только с участием 4-((бензилсульфанил)метил)-3,5-диметил-1H-пиразола и дигидрата хлорида меди(II), взятыми в мольном соотношении 2:1.

Пример получения N,N-комплекса дихлороди-[3,5-диметил-4-((бензилсульфанил)метил)-1H-пиразол]дигидрат меди(II) (1).

В стеклянном сосуде при перемешивании и температуре 20°C растворяют 0.05 г (0.28 ммоль) дигидрат хлорида меди(II) в 15 мл ацетонитрила, прибавляют 0.06 г (0.28 ммоль) 4-((бензилсульфанил)метил)-3,5-диметил-1H-пиразола и перемешивают при комнатной температуре (~20-°C) в течение 4 ч. Образовавшийся ярко-зеленый осадок фильтруют через

бумажный фильтр (синяя лента), промывают ацетонитрилом, водой, высушивают без нагревания на воздухе и получают с выходом 76% N,N-комплекс дихлороди-[3,5-диметил-4-((бензилсульфанил)метил)-1Н-пиразол]дигидрат меди(II) (1).

Спектральные характеристики соединений (1).

N,N-Комплекс дихлороди-[3,5-диметил-4-((бензилсульфанил)метил)-1H-пиразол]дигидрат меди(II) (1).

Порошок зеленого цвета, Т_пл.=156-158°С.

ИК-спектр (ν, см^-1): 290 (Cu-Cl), 493, 685 (C-S), 723, 1164, 1290, 1576, 3197, 3279. УФ-спектр (λ, нм): 294.60. Найдено (%): С, 49.69; Н, 5.36; Cl, 10.88; Cu, 9.85^*; N, 9.20; S, 10.43. C₂₆H₃₆Cl₂CuN₄O₂S₂. Вычислено (%): С, 49.16; Н, 5.71; Cl, 11.16; Cu, 10.00; N, 8.82; S, 10.10.

^*Определение меди проводили атомно-абсорбционным методом (непрерывный метод в пламени ацетилен-воздух) на спектрофотометре Shimadzu АА-6800 в ГБУ РБ Управление государственного аналитического контроля

Выявление амилолитической активности термостабильной α-амилазы микробного происхождения соединения формулы (1) проведено с использованием ферментного препарата α-амилазы Termamyl® SCDS компании Novozymes. Определение необходимой концентрации рабочего раствора ферментного препарата проводилось по методике [ГОСТ Р 54330-2011 «Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения амилолитической активности. - М.: Стандартинформ, 2012. - 14 с.]. Метод основан на гидролизе крахмала ферментами амилолитического комплекса до декстринов различной молекулярной массы.

За единицу активности амилолитического фермента принято такое количество фермента, которое в строго определенных условиях температуры, рН и времени действия катализирует до декстринов различной молекулярной массы 1 г растворимого крахмала, что составляет 30% от введенного в реакцию.

С выбранной концентрацией фермента была проведена серия осахариваний растворов крахмала различной концентрации для определения зависимости начальной скорости ферментативной реакции от начальной концентрации субстрата. Для большей точности и удобства представления зависимости начальной скорости от начальной концентрации субстрата отображаются на графиках в обратных координатах 1/V₀ и 1/S₀, где зависимость приобретает линейный характер.

На графике Лайнуивера-Берка точка пересечения прямой с осью ординат будет иметь значение, равное обратной величине максимальной скорости реакции 1/V_max.

Полученные значения начальных скоростей и расчетные значения 1/S_o и 1/V_o для графиков в обратных координатах сведены в таблицу.

Как видно из рис. 1, наклоны тренда прямой зависимости концентрации крахмала от времени отличаются в контрольном и опытном варианте, из чего следует, что в присутствии комплекса меди(II) (1) скорость ферментативного расщепления значительно снижается по сравнению с исходной скоростью. На рис. 2 представлен график в обратных двойных координатах Лайнуивера-Берка. По характеру расположения кривых было установлено, что N,N-комплекс дихлороди-[3,5-диметил-4-((бензилсульфанил)метил)-1H-пиразол]дигидрат меди(II) формулы (1) является конкурентным ингибитором.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что соединение (1) может быть использовано в качестве средства с ингибирующей активностью в отношении фермента α-амилаза.

Существенные отличия предлагаемого способа.

Соединение (1) является эффективным средством, проявляющее ингибирующую активность в отношении фермента α-амилаза. В отличие от известных средств синтез соединения (1) осуществляется в одну препаративную стадию исходя из доступных средств.