Результат интеллектуальной деятельности: Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А.

В сентябре 2018 ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) рекомендовала заменить H3N2 компонент в составе противогриппозных вакцин для Южного полушария на 2019 гг. эпидемический сезон на А/Швейцария/8060/2017 (H3N2)-подобные вирусы [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2019 southern hemisphere influenza season. 27 September 2018. https://www.who.int/influenza/vaccines/ virus/recommendations/2019_south/en/]. Это было связано с появлением в циркуляции значительной доли штаммов подтипа H3N2, относящихся к группе 3с.2а2 (А/Швейцария/8060/2017-подобных). Антисыворотки к рекомендованному ранее ВОЗ (для подготовки противогриппозных вакцин для 2018-2019 эпидемического сезона в северном полушарии) штамму А/Сингапур/INFIMH-16-0019/2016, пассированному в системе развивающихся куриных эмбрионов, не ингибировали значительную часть вирусов, выделенных с февраля по сентябрь 2018 г, по данным ВОЗ. Сыворотки же, полученные против штамма А/Швейцария/8060/2017, эффективно ингибировали значительную долю циркулирующих штаммов [Chow E.J., Davis С.Т., Abd Elal A.I. и др., Update: Influenza Activity - United States and Worldwide, May 20-October 13, 2018// MMWR Morb Mortal Wkly Rep.- 2018 Oct 26. - V.67. - №42. - С. 1178-1185].

В результате появления в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа А/Швейцария/8060/2017 (H3N2), известный вакцинный штамм А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) - прототип [Ларионова Н.В., Баженова Е.А., Крутикова Е.В., Матюшенко В.А., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. Патент РФ №2683500 от 28.03.2019 - Опубл. БИ 2019. - №10] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может вызвать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной А/Швейцария/8060/2017-подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального вакцинного штамма для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического штамма А/Швейцария/8060/2017 (H3N2).

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол.- 1977 - №4,- С. 387-395.].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа - разрешен для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. - С. 66-83].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от безвредного донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Швейцария/ 8060/2017 (H3N2) с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии кроличьей антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированием методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts- и са-фенотип) и по формуле генома на соответствие формуле вакцинного штамма живой гриппозной вакцины.

Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Изучение антигенных свойств вакцинного штамма А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) показало, что:

- ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА с гомологичной сывороткой антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Швейцария/8060/2017 (H3N2), поскольку показатели взаимодействия реассортанта А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) и родительского штамма А/Швейцария/8060/2017 (H3N2) с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу А/Швейцария/8060/2017 (H3N2), полностью совпадали (табл. 1).

- второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - нейраминидаза (NA) - проверен методом частичного секвенирования, а также полногеномным секвенированием и идентичен вирусу А/Швейцария/8060/2017 (H3N2).

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали метод пиросеквенирования ДНК копий генов, аналогичный описанному [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Разработка протокола пиросеквенирования для анализа происхождения генов реассортантов при подготовке штаммов живой гриппозной вакцины. // «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология» - №2. - 2018. - с. 101-107] с использованием комплекта высокоспецифичных олигонуклеотидов, разработанных в программе PSQ Assay Design для анализа генома современных штаммов подтипа H3N2 и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) принадлежат эпидемическому родительскому вирусу А/Швейцария/8060/2017 (H3N2), гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) представлены в табл. 2.

Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома и показали, что вакцинный штамм А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 2).

Генетическую стабильность кодирующих мутаций вакцинного штамма А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма, подготовленного на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57, в куриных эмбрионах с использованием метода пиросеквенирования. Для данного анализа были разработаны специфические праймеры, позволяющие оценивать наличие данных мутаций с использованием пиросеквенатора PyroMark Q24. Праймеры разработаны с использованием компьютерной программы PSQ Assay Design. Пример пирограммы, полученной для фрагмента гена РВ1, содержащего аттенуирующую мутацию в позиции 1795 у донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), приведен на фиг. 1, где показан результат пиросеквенирования фрагмента гена РВ1, содержащего аттенуирующую мутацию в позиции 1795 у донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) для штаммов А/Ленинград/134/57 (H2N2) (фиг. 1 а), А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (фиг. 1 б), А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) (фиг. 1 в).

В результате пиросеквенирования вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2) - эпидемического предшественника донора аттенуации, не обладающего аттенуирующей мутацией, нет пика в первой позиции (Т), пик во второй позиции (С) обладает увеличенной высотой (фиг. 1, а). Наличие аттенуирующей мутации С→Т характеризуется пиками в позициях Т и С, одинаковой высоты, что можно увидеть на пирограмме, полученной для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (фиг. 1, б), черными стрелками отмечены пики, подтверждающие наличие мутации), а также на пирограмме, полученной для гена РВ1 вакцинного штамма А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) (фиг. 1, в).

В таблице 3 приведены результаты пиросеквенирования всех генов вакцинного штамма А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2), содержащих аттенуирующие мутации, соответствующие донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), до и после пятикратного пассирования в развивающихся куриных эмбрионах. Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию, присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2).

Таким образом, секвенирование генома вакцинного штамма А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) показало генетическую стабильность аттенуирующих мутаций.

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2), проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2), в развивающихся куриных эмбрионах обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила ≤1.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации достигала 5.0 logio ЭИД50/МЛ, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты фенотипического анализа представлены в таблице 4.

Безвредность для мышей. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) проводили на белых беспородных мышах в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты); Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с.] и с «Правилами надлежащей лабораторной практики» [Правила надлежащей лабораторной практик. Приказ Минздрава РФ №199н от 01.04. 2016. https://rg.ru/2016/09/02/minzdrav-prikaz199-site-dok.html1

Мышам вводили однократно одну человеческую дозу, соответствующую 0,5 мл, вакцинного вируса внутрибрюшинно в дозе 7.0 lg ЭИД₅₀/МЛ. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования (подвижность, поведенческие реакции, кинетика массы тела) показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл. 4) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Швейцария/8060/2017 (H3N2), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека. Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) депонирован 28.02.2019 года в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России под №2904 и имеет характеристики, представленные в образце паспорте штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов - 8.5 log₁₀ ЭИД₅₀/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:256.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Швейцария/2017/51 (H3N2) может быть использован для профилактики гриппа как у у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.