×
05.02.2020
220.017.fe9d

Способ выделения бактерий p. Bacillus из ризопланы и ризосферы прикорневой зоны растений

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ выделения бактерий p. Bacillus из ризопланы и ризосферы прикорневой зоны растений. Способ включает выдерживание измельченных корней растений совместно с прилегающими частичками почвы в серной кислоте с концентрацией от 75% до 96% и температурой t=20-250°С в течение 1,5-3 мин, посев на L-агар и культивацию при 37°С в течение 24 ч. Изобретение обеспечивает выделение небольшого количества колоний бактерий из ризопланы и ризосферы прикорневой зоны растений для дальнейшей идентификации по видовым признакам. 1 табл., 1 пр.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к биотехнологии бактерии, в первую очередь - к технологии извлечения природных штаммов из ризопланы и ризосферы прикорневой зоны растений. Изобретение предназначено для селективного извлечения «диких» штаммов спорообразующих бактерий, в первую очередь - p. BACILLUS, обладающих уникальными биопродуцентными характеристиками, что позволяет сократить затраты на получение искусственных штаммов.

Известен способ извлечения бактерий из ризопланы и ризосферы прикорневой зоны растений, включающий следующие операции: корни с почвой помещают в колбу, содержащую 100 мл стерильной воды, и взбалтывают в течение 2 мин. Стерильным крючком или пинцетом корни извлекают из колбы и переносят в другую емкость, содержащую 100 мл стерильной водопроводной воды. Процедуру повторяют, последовательно промывая корни в семи колбах (по 2 мин в каждой). Желательно, чтобы в последней (седьмой) колбе в воду перед стерилизацией было добавлено 5-7 г песка. Суспензию после первого отмывания рассматривают как образец ризосферы. Содержимое остальных шести колб сливают вместе и расценивают как образец ризопланы [Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. / Практикум по микробиологии, Учебники и учеб. пособия для высш. учеб. заведений. Изд. 4-е перер. и доп. М., «Колос» 1993, с. 121-123].

Недостатком данного способа является почти полное отсутствие селективности, что приводит к длительным процессам последующей селекции.

Известен способ выделения бактерий ризопланы тыквы обыкновенной. Способ осуществляется по методу последовательных отмываний корней [Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер. - М.: Дрофа, 2004, - 256 с.]. Для этого в пробирке с физиологическим раствором размачивали прилипшие к корням частицы почвы, затем 3 раза переносили в пробирки со стерильным физиологическим раствором и 4 раза промывали в стерильной воде. Очищенные таким образом корни измельчали стерильным пинцетом и ножницами, после чего помещали в стерильную чашку Петри. Затем отбирали навеску корней массой 5 г и растирали их в стерильной фарфоровой ступке. Измельченные корни смывали в колбу с таким расчетом, чтобы объем полученной суспензии составил 50 мл. В колбу добавляли 5 г кварцевого песка и встряхивали суспензию в течение 5 минут. Затем 5 мл жидкости переносили в другую колбу, содержащую 45 мл стерильной воды. Из первой колбы 5 мл суспензии добавляли во вторую колбу с 45 мл воды, из третьей - в четвертую. Таким образом, готовили 7 десятикратных разведений, которые высевали на поверхность плотных питательных сред. Недостаток способа в том, что высеваются как спорообразующие, так и не спорообразующие микроорганизмы, что требует дополнительных процедур для их разделения и идентификации.

Наиболее близким аналогом-прототипом можно считать способ селективного выделения из почвы отдельных групп почвенных бактерий. Для преимущественного выделения из почвы грамположительных спорообразующих бактерий проводят пастеризацию почвенных суспензий (прогревание при 80° в течение 10-15 мин), при которой погибают вегетативные клетки и сохраняются споры бактерий. Для элиминирования бацилл, при учете стрептомицетов, нокардий, коринеподобных бактерий и грамотрицательных бактерий используют добавление в питательные среды красителя метилового красного (0,015%) [Зенова Г.М., П.Ф. Степанов А.Л., Лихачева А.А., Манучарова Н.А. /Практикум по биологии почв: Учеб. пособие - М.: Издательство МГУ, 2002. С. 36-37].

Недостатком данного способа является низкая и неоднозначная селекция, после которой необходимо использовать дополнительные процедуры для разделения бактерий по роду.

Целью настоящего изобретения является - упрощение процесса выделения из ризопланы и ризосферы прикорневой обрасти растений бактерий p. Bacillus за счет:

уменьшения времени проведения исследования;

уменьшения количества используемых химических реактивов;

удешевление процесса, за счет использование недорогих химических реактивов (используется один, недорогой, общедоступный реактив - серная кислота);

упрощение выбора колоний для дальнейшей идентификации по видовым признакам, за счет небольшого количества колоний, выросших на твердой среде.

Поставленная цель достигается тем, что корни растений совместно с прилегающими частичками почвы выдерживают в серной кислоте с концентрацией от 75% до 96% в течение 1,5-3 минут, после чего 0,1 мл пробы высевают в чашки Петри на твердую питательную среду, культивируют при 37°С в течение не менее 24 часов для роста колоний.

Выросшие колонии - бактерии p. Bacillus - используют для дальнейшей идентификации видовых признаков и используют по назначению.

Пример. В стерильную колбу объемом 100 мл помещают 50 мл серной кислоты с концентрацией от 96% до 25%. Приготовление различных концентраций серной кислоты осуществляют по стандартным методикам, с учетом плотности кислоты (Справочник химика 21. Электронный ресурс: режим доступа: www.chem21.info. Дата доступа: 04.05.2019). Затем охлаждают выстаиванием до комнатной температуры (t=20-25°С) и помещают в колбу измельченные стерильными ножницами до 2-3 см части корней растений с прилипшими частицами почвы. Затем однократно перемешивают стерильной стеклянной палочкой, выдерживают 1,5-10 минут и производят посев 0,1 мл пробы стерильной пипеткой на чашки Петри с L-агаром следующего состава (г/л): агар-агар - 18, дрожжевой экстракт - 5, пептон - 15, хлорид натрия - 5, дистиллированная вода - до 1 л (рН 6,8-7,0). Стерилизация среды при 1.1 кгс/см2 40 минут. Пробу равномерно распределяют по поверхности среды стерильным шпателем Дригальского и культивируют в термостате в течение 24 часов при температуре 37°С. В чашках наблюдают рост колоний. Далее отбирают изолированные колонии для видовой идентификации.

Идентификацию ризобактерий осуществляли по морфологическим, тинкториальным, биохимическим свойствам с помощью:

- Хоулт Дж. Криг Н. Определитель бактерий Берджи, в 2 томах. Том 1. Москва. Издательство "Мир", 1997;

- Gordon, R. The genus Bacillus / R. Gordon // In Handb. Microbiol. Cleveland (Ohio). - 1973. - V. 1. - P. 71-88;

- Васильев Д.А., Калдыркаев А.И., Феоктистова H.A., Алешкин А.В. Идентификация бактерий Bacillus cereus на основе их фенотипической характеристики. Научное издание. - Ульяновск: НИИЦМиБ УлГСХА им. П.А. Столыпина, 2013, - 98 с.

Морфологические и тинкториальные свойства выделенных штаммов микроорганизмов изучали с помощью биологического микроскопа марки Биомед 5.

Идентификацию ризобактерий осуществляли по следующим методикам с использованием указанных питательных сред и реактивов.

Окраска по методу Грама:

1. Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги и на него наносят карболовый раствор генцианового фиолетового. Окрашивание проводят на протяжении 1-2 мин.

2. Бумажку снимают, краситель сливают и, не промывая препарат водой, обрабатывают его на протяжении 1-2 мин раствором Люголя до почернения.

3. Сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96%-ным этиловым спиртом (препарат несколько раз помещают в стакан со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек). Обесцвечивание проводят не более 30 с.

4. Препарат промывают водой.

5. Мазок дополнительно окрашивают на протяжении 1-2 мин водным раствором фуксина.

6. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные - в розовый.

Реактивы для окраски по Граму:

1. Карболовый раствор генциана фиолетового: 1 г генциана фиолетового, 10 мл ректификованного этилового спирта, 5 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 мл дистиллированной воды. В ступке растереть краситель с карболовой кислотой до получения кашицеобразной массы, прибавить небольшими порциями спирт и развести водой. Слить раствор в бутыль, поместить в термостат до растворения, профильтровать.

2. Раствор Люголя: 1 г йода кристаллического, 2 г йодистого калия растворяют в 300 мл дистиллированной воды. Смесь поместить в бутыль матового стекла, хорошо закупорить и поставить на сутки в термостат, после чего добавить 300 мл дистиллированной воды. Хранить во флаконе из темного стекла.

3. Фуксин Циля: к 10 мл, насыщенного спиртового раствора основного фуксина прилить 90 мл 5% раствора карболовой кислоты. Карболовую кислоту влить в краситель, а не наоборот. Каждый краситель фильтруют не менее 2-х раз.

Тест Грегерсена:

Для работы используется 3%-ный раствор KOH.

На предметное стекло наносят каплю реактива, в которую стерильной бактериологической петлей вносят исследуемую чистую культуру бактерий. Тщательно перемешивают в течение 30 с и определяют вязкость полученной суспензии. При образовании вязких слизистых тянущихся нитей исследуемые клетки относят к грамотрицательным. Если вязкость суспензии не изменилась, то клетки являются грамположительными (Микробиология. Практикум: пособие / В.В. Лысак, Р.А. Желдакова, О.В. Фомина. - Минск: БГУ, 2015, - стр. 33-34).

Выявление каталазы проводят на предметном стекле в капле 3%-ного раствора перекиси водорода. Стерильной бактериологической петлей в каплю перекиси вносят исследуемую культуру и тщательно перемешивают. При наличии каталазы происходит разложение перекиси водорода с выделением пузырьков кислорода (Микробиология. Практикум: пособие / В.В. Лысак, Р.А. Желдакова, О.В. Фомина. - Минск: БГУ, 2015, – стр. 51).

Использовались готовые питательные среды МПА и МПБ. При посеве на МПА и МПБ использовали стандартные методы посева на плотные и жидкие питательные среды, бактерии культивировали при 37°С в течение 24 часов.

Таким образом, оптимальной является концентрация серной кислоты от 75 до 96%, т.к. при этой концентрации вырастают единичные крупные изолированные колонии, что делает их выборку (извлечение) и оценку морфологических свойств оптимальной. Минимальное время эксперимента, при котором вырастают изолированные колонии - 1,5-3 минуты.

Результаты идентификации колоний, выросших на питательных средах:

1. При росте на L-агаре - колонии средние и крупные. Максимальный диаметр составлял 0,7-1,2 см. Колонии округлой формы, серовато-белого цвета, матовые, бархатистые, с неровным краем. Все колонии сухие, не врастают в агар и легко отделяются от него.

2. Рост на МПА - колонии белые, серые, иногда желтые, морщинистые, твердые, восковидные, круглые или ползущие на стенку чашки.

3. Рост на МПБ - наблюдается помутнение среды, изредка образуется осадок.

4. Все штаммы грамположительные.

5. Прямые или почти прямые палочки, расположены одиночно, по две клетки или в коротких цепочках.

6. Образуют овальные споры, расположенные термально или субтермально.

7. Все штаммы подтвердили отрицательные реакцию Грегерсона.

8. Все штаммы подтвердили положительную реакцию на каталазу.

Все эти признаки подтверждают принадлежность выделенных штаммов к роду Bacillus. (Хоулт Дж. Криг Н. Определитель бактерий Берджи, в 2 томах. Том 1. Москва. Издательство "Мир", 1997; Gordon, R. The genus Bacillus / R. Gordon // In Handb. Microbiol. Cleveland (Ohio). - 1973. - V. l. - P. 71-88; Васильев Д.А., Калдыркаев А.И., Феоктистова H.A., Алешкин А.В. Идентификация бактерий Bacillus cereus на основе их фенотипической характеристики. Научное издание. - Ульяновск: НИИЦМиБ УлГСХА им. П.А. Столыпина, 2013, - 98 с.).

Способ выделения бактерий p. Bacillus из ризопланы и ризосферы прикорневой зоны растений, отличающийся тем, что измельченные корни растений совместно с прилегающими частичками почвы помещают в серную кислоту с концентрацией от 75% до 96% и температурой t=20-25°С, выдерживают в течение 1,5-3 мин, после чего 0,1 мл пробы высевают в чашки Петри на L-агар и культивируют при 37°С в течение 24 ч.
Источник поступления информации: Роспатент

Showing 1-10 of 78 items.
13.01.2017
№217.015.74c5

Безопасный экстракционно-флуориметрический способ определения селена в воде

Изобретение относится к аналитической химии и касается способа определения селена в воде. Сущность способа заключается в том, что к анализируемому раствору добавляют 0,4 мл раствора 3%-ного щелочного борогидрида натрия восстановителя, закрывают пробкой, встряхивают и оставляют на 5 мин для...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002597769
Дата охранного документа: 20.09.2016
25.08.2017
№217.015.bad9

Люминесцирующие металлсодержащие полимеризуемые композиции и способ их получения

Изобретение относится к химии и технологии материалов, преобразующих электромагнитное излучение, и используется для получения люминесцирующих и избирательно поглощающих электромагнитное излучение металлсодержащих полимерных композиций для светотехники, опто- и микроэлектроники. Основой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002615701
Дата охранного документа: 06.04.2017
26.08.2017
№217.015.eda4

Индикатор для обнаружения повышенной концентрации аммиака в воздухе рабочей зоны

Изобретение относится к устройствам для выявления утечек аммиака и может быть использовано в областях химической и холодильной промышленностей, в сфере производства удобрений и аммиака, а также для контроля воздушной среды в производственных помещениях. Индикатор представляет собой основу...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002628883
Дата охранного документа: 22.08.2017
29.12.2017
№217.015.f6d1

Способ пластической деформации металлов и сплавов

Изобретение относится к области пластической обработки металлов, таких как алюминий и его сплавы, и может быть использовано в различных областях промышленности и науки для глубокого формования металлических материалов. Способ пластической деформации алюминия и его сплавов включает механическое...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002639278
Дата охранного документа: 20.12.2017
29.12.2017
№217.015.f79d

Способ получения линимента на березовых почках

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения линимента на березовых почках. Способ получения линимента на березовых почках, включающий подготовку свиного жира, закладку березовых почек и свиного жира в емкость и воздействие на смесь жира и почек...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002639571
Дата охранного документа: 21.12.2017
29.12.2017
№217.015.f90b

Дефектоскоп для сварных швов

Изобретение относится к методам неразрушающего контроля и позволяет обнаруживать дефекты малых размеров и глубокого залегания в сварных швах, соединяющих, преимущественно, неферромагнитные материалы. Дефектоскоп для сварных швов включает в себя аппаратную и программную части. Дефектоскоп...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002639592
Дата охранного документа: 21.12.2017
29.12.2017
№217.015.fb66

Способ концентрирования микроэлементов

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в практике аналитических, агрохимических, медицинских лабораторий. Осуществляют концентрирование микроэлементов для последующего аналитического определения путем соосаждения с диантипирилметаном, образующим в системе вода -...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002640337
Дата охранного документа: 27.12.2017
13.02.2018
№218.016.24a1

Мембранный экстрактор

Изобретение относится к экстракторам системы жидкость-жидкость для применения в биотехнологической, фармацевтической, химической, пищевой промышленности, и, в частности, может быть использовано для ускорения выделения целевых продуктов метаболизма микроорганизмов, например антибиотиков из...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002642641
Дата охранного документа: 25.01.2018
04.04.2018
№218.016.3134

Способ определения иодид-ионов катодной вольтамперометрией

Изобретение относится к области аналитической химии. Способ определения йодид-ионов катодной вольтамперометрией проводят на серебряном электроде в фоновом растворе 0,1 М ацетата натрия, выдерживая потенциал электролиза в диапазоне потенциалов (-0,15±0,05) В при скорости развертки 20 мВ/с - 50...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002645003
Дата охранного документа: 15.02.2018
10.05.2018
№218.016.442b

Биоразлагаемый поливной шланг для капельного орошения

Изобретение относится к области устройств для капельного орошения. Поливной сочащийся шланг для капельного орошения выполнен из биоразлагаемого бумажного крафт-шпагата. Крафт-шпагат пропитан жидким растительным маслом. Шланг выполнен методом плетения. Плетение шланга обеспечивает микропористую...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002649857
Дата охранного документа: 05.04.2018
Showing 1-10 of 14 items.
20.07.2015
№216.013.62fa

Способ и система коррекции дефектных пикселей изображения

Изобретение относится к области обработки дискретной информации в битовом потоке, а именно к способу/системe коррекции дефектных пикселей изображения. Техническим результатом изобретения является обеспечение карты дефектных пикселей меньшего размера, что позволяет сократить объем памяти для...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002556885
Дата охранного документа: 20.07.2015
20.12.2015
№216.013.9bd9

Устройство и способ приведения к единому формату различных цифровых видеосигналов

Изобретение относится к области обработки видеосигналов. Технический результат заключается в приведении к единому формату различных цифровых видеосигналов. Устройство и способ приведения к единому формату различных цифровых видеосигналов, универсальных по обрабатываемым видеосигналам, которые...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002571522
Дата охранного документа: 20.12.2015
13.01.2017
№217.015.74c5

Безопасный экстракционно-флуориметрический способ определения селена в воде

Изобретение относится к аналитической химии и касается способа определения селена в воде. Сущность способа заключается в том, что к анализируемому раствору добавляют 0,4 мл раствора 3%-ного щелочного борогидрида натрия восстановителя, закрывают пробкой, встряхивают и оставляют на 5 мин для...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002597769
Дата охранного документа: 20.09.2016
26.08.2017
№217.015.eda4

Индикатор для обнаружения повышенной концентрации аммиака в воздухе рабочей зоны

Изобретение относится к устройствам для выявления утечек аммиака и может быть использовано в областях химической и холодильной промышленностей, в сфере производства удобрений и аммиака, а также для контроля воздушной среды в производственных помещениях. Индикатор представляет собой основу...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002628883
Дата охранного документа: 22.08.2017
13.02.2018
№218.016.24a1

Мембранный экстрактор

Изобретение относится к экстракторам системы жидкость-жидкость для применения в биотехнологической, фармацевтической, химической, пищевой промышленности, и, в частности, может быть использовано для ускорения выделения целевых продуктов метаболизма микроорганизмов, например антибиотиков из...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002642641
Дата охранного документа: 25.01.2018
10.05.2018
№218.016.48e5

Способ управления способностью растворов солей к нуклеации при кристаллизации

Изобретение относится к технологическим процессам, касающимся выделения из растворов солей в виде кристаллической массы, и предназначено для нереагентного изменения способности кристаллогидратов металлов регулировать инициирование зародышей и таким образом управлять числом зародышей и размерами...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002651006
Дата охранного документа: 18.04.2018
28.09.2018
№218.016.8c64

Питательная среда для культивирования bacillus subtilis вкпм в-12079

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Питательная среда для культивирования бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 содержит пептон ферментативный, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, 96%-ный спиртовой экстракт кофе арабика и дистиллированную воду при заданном соотношении...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002668173
Дата охранного документа: 26.09.2018
28.09.2018
№218.016.8c9f

Питательная среда для культивирования bacillus subtilis

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Питательная среда для культивирования бактерий Bacillus subtilis содержит пептон ферментативный, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, 40%-ный спиртовой экстракт кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L.) и дистиллированную воду...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002668178
Дата охранного документа: 26.09.2018
28.09.2018
№218.016.8cb6

Способ активации спор бактерий bacillus subtilis вкпм в-12079 перед определением количества жизнеспособных клеток

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ активации спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 перед определением количества жизнеспособных клеток. Способ включает активацию сухих спор Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 ультразвуком в течение 15-20 секунд при температуре 32-34°С,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002668180
Дата охранного документа: 26.09.2018
25.01.2019
№219.016.b3d5

Питательная среда для культивирования pseudomonas fluorescens ap-33

Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда для культивирования Pseudomonas fluorescens АР-33 содержит мелассу, калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный, сульфат магния семиводный, горох шлифованный, предварительно обработанный автоклавированием, янтарную кислоту, лапрол для...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002678133
Дата охранного документа: 23.01.2019
+ добавить свой РИД