Способ моделирования термического поражения кожи степени IIIA

Изобретение относится к экспериментальной фармакологии, а именно к способам моделирования патологических процессов и может быть использовано для изучения механизмов ожоговой болезни, а также разработки новых методов ее лечения.

Ожоговая травма в современных условиях остается актуальной и важной проблемой в структуре травматизма. Известны различные методики воспроизведения термического ожога с использованием разнообразных устройств для моделирования ожоговой поверхности у лабораторных животных. Известные способы моделирования ожоговой травмы в эксперименте касаются моделирования ожогов кожи различной степени тяжести.

Известен способ моделирования плоскостной раны [Louise Dunn, Hamish С. Prosser, Joanne Т. M. Tan, Laura Z. Vanags, Martin K. C., Christina A. Bursil. Murine Model of Wound Healing // Journal of Visualized Experiments. - May 2013, 75].

Известный способ заключается в том, что животным (мышам) при помощи биопсионного инструмента отмечают операционную область, после чего при помощи зажима и глазных ножниц создают рану по всей глубине кожи. Область раны ограничивают силиконовыми накладками. Однако, известный способ, прежде всего, относится к области экспериментальной фармакологии и комбустиологии, то есть предназначен для моделирования физического, а не термического поражения кожи. Кроме того, известный способ требует высоко оснащенного операционного помещения.

Существуют многочисленные научные разработки в области моделирования травматологических состояний, в частности, ран. Однако при этом вопрос экспериментального моделирования ожогов все еще остается недостаточно изученным, что делает поиск подобных моделей актуальным. Поскольку ожоги легких степеней (I и II) не требуют специализированной медицинской помощи, наиболее актуальной представляется разработка моделей ожогов III и IV степеней.

Ожог III степени - очень тяжелая и крайне болезненная травма термического характера, в той или иной степени затрагивающая все слои кожных покровов, и способная вызывать необратимые изменения на поврежденных участках. Ожоги III степени чаще всего возникают в результате пожара. В отличие от прочих ожогов, повреждения III степени характеризуются поражением всех слоев кожи и невозможностью ее самостоятельного полного восстановления.

За прототип предлагаемого изобретения выбран способ моделирования термического ожога кожи с применением контактного высокотемпературного способа (устройство на основе электропаяльника), позволяющей варьировать степень поражения кожи при обязательном гистологическом контроле. Данный метод заключается в прикладывании к предварительно депилированной коже лабораторных животных (крыс) разогретой до 200°С медной пластины размером 25×25 мм с силой 1,5 Н (Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. - М.: Гриф и К, 2012.-944 с). Недостатком описанного способа является необходимость в точном контроле температуры и давления, требующая специализированных измерительных приборов или особой подготовки персонала. Кроме того, большая площадь ожога может приводить к незапланированным осложнениям и тем самым поставить под угрозу исход эксперимента.

Задачей данного изобретения является создание модели ожоговой травмы степени IIIA, обеспечивающей одинаковое у всех задействованных в эксперименте лабораторных животных (крыс), адекватное клиническим условиям поражение кожных покровов без повреждения жизнеспособности подкожных мышц. Кроме того, предлагаемый способ не требует наличия специализированного оборудования или редко применяемых в лабораторной практике приборов, а также позволяет разрабатывать экспериментальный дизайн, соответствующий современным принципам 3R (англ. «replacement, reduction, refinement» - «замена, сокращение, усовершенствование») [Russell W.M.S., Burch R.L. The Principlesof Humane Experimental Technique / London:Methuen - 238 pp].

Поставленная задача решается тем, что у находящихся под эфирным наркозом экспериментальных животных, в частности крыс, на предварительно подготовленных (выбритых) участках кожи в нижней части лопаток, симметрично с обеих сторон тела, осуществляют термическое поражение кожи (ожог). Для этого пробирку (содержащую груз для создания общей массы пробирки 132,5 г) диаметром 18 мм, наполненную кипящей водой при 100°С, удерживают на коже в течение 10 секунд, поставив ее плоским дном. Дно пробирки должно быть сухим. Для нанесения второго ожога, на другую лопатку, пробирку повторно нагревают.

Термическое поражение кожи производится следующим образом:

Находящимся под эфирным наркозом экспериментальным мелким животным (в частности, крысам) на предварительно выбритую кожу спины в области лопаток (в проекции нижней части лопатки), отступая около 1 сантиметра от позвоночника справа и слева, наносят ожог дном плоскодонной стеклянной пробирки диаметром 18 мм, наполненной горячей водой и доведенной любым грузом до общей массы 132,5 грамма (1,3 Н) при 100°С в течение 10 секунд, что обеспечивает развитие ожога IIIA степени. Температура достигается нагревом пробирки на водяной бане. При нанесении ожога пробирку удерживают с помощью анатомического пинцета, зажима, или иного инструмента, вынимают из водяной бани и, быстро обсушив дно фильтровальной бумагой, ставят дном на кожу экспериментального животного под собственным весом. На фиг. 1 показана постановка пробирки на кожу животного. Необходимо визуально контролировать, чтобы обеспечивался полный контакт кожи со всей поверхностью дна пробирки. Время экспозиции составляет 10 секунд, после чего пробирку необходимо повторно разогреть на кипящей водяной бане перед нанесением второго ожога. Второй ожог наносится аналогичным способом с другой стороны позвоночника. Благодаря использованию грузов пробиркой на кожу создается давление одинаковой силы, а благодаря использованию воды обеспечивается теплоемкость конструкции, что в совокупности позволяет получить ожоги IIIA степени. Предполагается, что в дальнейшем на один из двух ожогов будет наноситься исследуемое вещество или с этим ожогом будут проводиться лечебные процедуры, в то время как второй ожог будет выступать в качестве внутреннего контроля, т.е. не будет подвергаться воздействию биологически активных веществ или лечебных процедур, однако может подвергаться воздействию носителя биологически активных веществ или SHAM - операции.

На фиг. 2 представлены ожоги через 12 часов после нанесения. Развитие ожогового поражения, которое впоследствии распространится на весь поврежденный участок.

Предлагаемый способ позволяет создать стабильные модели ожоговой травмы, соответствующей клиническим проявлениям ожога степени IIIA, что позволяет в дальнейшем исследовать новые методы лечения ожогов. Способ позволяет сократить количество животных, задействованных в эксперименте, а также достоверно воспроизводить развитие ожоговой травмы степени IIIA в эксперименте. Например, в стандартной схеме эксперимента по изучению противоожоговых средств следует использовать, как минимум, две группы животных - контрольную группу, не получающую лечение, и экспериментальную группу, ожоги которой обрабатываются исследуемым веществом или методом. При использовании предлагаемого способа аналогичный эксперимент возможно провести, используя только одну группу животных, каждое из которых будет иметь по два ожога, один из которых обрабатывается исследуемым веществом или методу, а второй остается без обработки. Таким образом возможно сократить число животных, используемых в эксперименте до половины, что позволяет проводить более гуманные эксперименты, а также сокращает затраты на содержание и кормление животных.

Для подтверждения полученного эффекта были проведены экспериментальные исследования на животных - лабораторных крысах-самцах линии Wistar, в возрасте 350 дней, весом 400±10 г в количестве 10 голов. В течение 10 секунд моделировали глубокий термический ожог кожи горячей водой (100°С) описанным ранее способом.

Для подтверждения развития искомой (IIIA) степени ожога было проведено гистологическое исследование кожи экспериментальных животных, для чего на 3 сутки с момента получения ожога животных подвергали эвтаназии с помощью диэтилового эфира.

Материалом для гистологических исследований были кусочки кожи размером 1,5*0,5 см, включающие центральную часть ожоговой раны и ее край с прилежащей тканью. Макропрепараты фиксировали в 10% нейтральном формалине, проводили обезвоживание в изопропиловом спирте, затем заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 7 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. Полученные гистологические препараты изучали и с помощью микроскопа Zeiss.

В ходе морфологического исследования было выявлено, что через 3 суток после ожога на коже спины у крыс наблюдается две раны округлой формы размером 2,3 см с неровными краями. Поверхность ран покрыта струпом с выступающими волосяными стержнями.

Ожог, полученный описанным выше способом, сопровождается развитием сухого коагуляционного некроза кожи без гибели поверхностного слоя мышц. Кожа в участках некроза полностью утрачивает свою структуру, коллагеновые волокна собраны в большие пласты. Волосяные луковицы частично сохранены. Цитоплазма клеток базального и шиповатого слоев эпидермиса оксифильна, ядра пикнотичны, так же, как и в клетках волосяных фолликулов. Ядра клеток сальных желез резко отечны, цитоплазма оксифильна, вакуолизирована. Коллагенновые пучки дермы набухшие, оксифильно окрашены. Однако поверхностные мышцы сохраняют структуру и характерную для них окраску, четко видны ядра миосимпластов. Наблюдается инфильтрация лейкоцитами рыхлой соединительной ткани. Цитоплазма клеток базального и шиповатого слоев эпидермиса оксифильна, ядра пикнотичны, так же, как и в клетках волосяных фолликулов. Ядра клеток сальных желез резко отечны, цитоплазма оксифильна, вакуолизированна. Коллагеновые пучки дермы набухшие, оксифильно окрашены.

Полученная гистологическая картина позволяет отнести ожог к IIIA степени, который у крыс заживает посредством краевой и спонтанной эпителизации [Волкова О.В. Основы гистологии с гистологической техникой / О.В. Волкова, Ю.К. Елецкий. - М.: Медицина, 1982.-304 с].