Результат интеллектуальной деятельности: Набор для дифференцированного выявления в сыворотке крови маркеров на всех стадиях инфекционного заболевания методом мультипараметрического дот-иммуноанализа

Изобретение относится к наборам для иммунохимического анализа, направлено на усовершенствование тест-систем для выявления специфических маркеров инфекционных заболеваний в препаратах крови и может быть использовано в вирусологии и медицине.

Для инфекционных заболеваний характерны периоды, в течение которых серологические маркеры заболевания сменяют друг друга. С начала заболевания (с момента появления клинических симптомов) в крови определяются белки предшественники (ранние белки возбудителя), указывающие на размножение патогена в организме. На 5-7 день с момента появления клинических признаков в крови появляются антитела класса М (IgM), а белки предшественники постепенно исчезают. На третьей неделе начинают вырабатываться антитела класса G (IgG), а уровень IgM прогрессивно снижается. Если белки предшественники и IgM указывают на острое заболевание, то наличие IgG свидетельствует о поздней, хронической стадии заболевания или о ранее перенесенной инфекции. Для разных инфекций определение этих маркеров имеет различное значение. Так для ВИЧ-инфекции важно выявление раннего белка р24 и суммарных антител, поскольку присутствие и IgM и IgG свидетельствует о наличии инфекции. Тогда как, например, для лихорадок денге (ЛД) и Зика (ЛЗ) важно дифференцированное выявление всех трех маркеров (белка NS1, IgM и IgG), поскольку присутствие или преобладание того или иного маркера позволяет диагностировать стадию заболевания и судить о вероятных времени и источнике заражения, что важно в эпидемиологическом плане.

В настоящее время серологическое обследование проводится с использованием тест-систем, определяющих 1-2 маркера и для выявления всех маркеров требует выполнения ряда тестов, что предполагает одновременное наличие всех необходимых тест-наборов и немалые затраты времени и средств.

Настоящее изобретение предполагает возможность одновременного (в одном анализе) дифференциального выявления в исследуемых образцах специфических иммунологических маркеров (ранних белков возбудителя, антител класса IgM и антител класса IgG) со всех стадий инфекционного заболевания, в частности, маркеров лихорадки денге. Сущность такого выявления заключается в образовании специфических комплексов между маркерами из исследуемого образца и известными иммунореагентами захвата, в определенном порядке дискретно зафиксированными на плотной подложке. Образовавшиеся комплексы затем обнаруживаются с помощью иммунореагентов детекции, связанных с легко выявляемой меткой - каталитически активными золями золота.

Известны тест-системы для иммуноферментного анализа в планшетах для иммунологических реакций, например Anti-Dengue virus ELISA (IgM), Anti-Dengue virus ELISA (IgG) и Dengue virus ELISA (NS1), Euroimmun (Германия) [1], которые позволяют выявлять соответствующие одиночные маркеры ЛД. Для определения всех маркеров необходимо выполнение анализов в трех тест-системах, требующих увеличенных объемов исследуемого образца, денежных и трудозатрат.

Известны системы дот-иммуноанализа, позволяющие по одному образцу одновременно определять наличие IgM и IgG к ЛД. Например, в наборе «ImmunoComb® II Dengue IgM&IgG BiSpot» (Orgenics, Израиль) [2] в качестве реагентов захвата используются антитела против IgM и IgG человека, которые отдельными пятнами нанесены на пластмассовую подложку и позволяют выделять весь пул соответствующих антител из образца. Выявление среди них специфических антител производится за счет связывания антигенов вируса денге I-IV типов. Выявление специфических IgM при таком подходе может быть эффективным, поскольку в общем спектре IgM в образце антитела к текущей острой инфекции будут преобладать или составлять значительную долю. В противоположность этому специфические IgG составляют ничтожную долю на общем фоне IgG, приобретенных в результате перенесенных заболеваний или вакцинации, и для их выявления необходима очень чувствительная система детекции. Поэтому в наборе используются последовательные длительные операции обработки подложки биотинилированными анти-денге антителами, а затем конъюгатом авидина с щелочной фосфатазой, увеличивающих время анализа до 2 час и негативно отражающихся на стоимости набора. Описанный набор позволяет одновременно дифференцировать первичную и вторичную лихорадку денге только со второй-третьей недели заболевания.

Известны наборы для иммунохроматографического (lateral-flow immunoassay) анализа, рассчитанные на выявление всех трех маркеров ЛД. Так набор «Dengue NS1Ag + Ab Combo system» (Standard Diagnostics Inc., Корея) [3] допускает одновременное выявление трех маркеров лихорадки Денге, однако анализ выполняется на двух отдельных устройствах: на одном в виде отдельных полос выявляются антитела IgM и IgG, а на другом - белок NS1. Набор позволяет диагностировать ЛД на всех стадиях заболевания, однако, по сути, представляет собой два отдельных теста в одной упаковке.

Известен способ многопрофильного иммунохимического выявления антигенов в жидких образцах, описанный в патенте РФ №2296995 [4]. Сущность такого выявления заключается в специфической иммобилизации антигенов исследуемого образца набором известных антител (первичных иммунореагентов), в определенном порядке дискретно зафиксированных на плотной подложке аналитического устройства. Иммобилизованные антигены обрабатываются смесью антител, специфичных ко всему спектру анализируемых антигенов, (вторичный иммунореагент), в результате чего образуется тройной комплекс: первичный иммунореагент - антиген - вторичный иммунореагент. Образовавшиеся комплексы затем обнаруживаются с помощью конъюгата - антител, специфичных к вторичному иммунореагенту и связанных с легко выявляемой меткой.

Недостатками такого подхода являются подбор первичных и вторичных иммунореагентов не только по специфичности, но и по виду животного, в которых они были наработаны, а также многостадийность и длительность процедуры анализа.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является набор для многопрофильного иммунологического анализа антител в препаратах крови, описанный в патенте РФ №2495434 [5], в состав которого входят следующие составные части. 1. Устройство в виде подложки с набором дискретно нанесенных на ее поверхность антигенами возбудителей инфекционных заболеваний и дополнительно блокированной неспецифическими природными или синтетическими полимерами. Подложка представляет собой пластину с зубцами в виде гребня, на поверхности каждого зубца (иммуночипа) которой расположены дискретно нанесенные антигены возбудителей вирусных инфекций и контроль (иммуноглобулины человека) для контроля качества антивидового конъюгата и проявляющей системы, причем, в качестве отрицательного контроля один из сегментов зубца подложки оставлен свободным от специфических белков для оценки фоновых явлений. Зона нанесения антигенов и контролей на каждом иммуночипе очерчена контрастной рамкой для позиционирования при инструментальном учете результатов анализа. 2. Емкость для проведения анализа, выполненная в виде многоячеистой аналитической ванны с возможностью введения каждого зубца подложки в отдельную ячейку. Ванна заполнена готовыми рабочими растворами: для отмывок и разведения образца, конъюгата и системы проявления. Ячейки ванны герметизированы.

В качестве антигенов возбудителей вирусных инфекций в наборе используют антигены возбудителей вакциноуправляемых инфекций: краснухи, эпидемического паротита, кори и полиомиелита или их рекомбинантные или синтетические аналоги.

В качестве конъюгата используют вторичные иммунореагенты: антитела к иммуноглобулинам человека, или стафилококковый белок А, связанный со щелочной фосфатазой, (например, Protein A, Alkaline Phosphatase Conjugate фирмы «Merck», кат. №539251), а в качестве проявляющей системы - субстрат для выявления щелочной фосфатазы (предпочтительно, BCIP/NBT Liquid Substrate System фирмы «SIGMA-ALDRICH» кат. №В1911). В альтернативном варианте конъюгата используют вторичные иммунореагенты (антитела к иммуноглобулинам человека или стафилококковый белок А), связанные с каталитически активными золями золота, а в качестве проявляющей системы - раствор "физического проявителя", включающий: 0,2% - метола; 0,2% - азотнокислого серебра; 0,5% - лимонной кислоты, бидистиллированную воду - остальное до 100%.

Частным примером прототипа является описаный в статье A. Poltavchenko et all. «А Kit for Multiplexed Detection of Antibodies to Agents of Hemotransmissible Infections». OnLine Journal of Biological Sciences 2016, 16 (3): 137.144 (DOI: 10.3844/ojbsci.2016.137.144) [6] набор для выявления антител к возбудителям гемотрансмиссвных инфекционных заболеваний. На иммуночипах этого набора нанесены антигены шести возбудителей ГТИ: ВИЧ, ВГС, ВГВ, сифилиса, цитомегаловирусной инфекции и токсоплазмоза, а также контроль работоспособности системы детекции - IgG из крови человека; в качестве конъюгата используются антитела против IgG человека, связанные с наночастицами золота, а в качестве проявляющей системы - физический проявитель, описанный в прототипе.

Набор-прототип предназначен только для одновременного выявления специфичных антител, и не позволяет дифференцировать специфические антитела классов IgM и IgG.

Техническим результатом заявляемого изобретения является обеспечение возможности диагностики заболевания на всех стадиях инфекционного процесса за счет одновременного дифференцированного выявления в образцах специфических антигенов и антител классов IgM и IgG.

Указанный технический результат достигается тем, что в наборе для дифференцированного выявления в сыворотке крови маркеров на всех стадиях инфекционного заболевания методом мультипараметрического дот-иммуноанализа, включающем подложку-иммуночип, выполненную в виде гребня с зубцами с дискретно нанесенными на поверхности каждого зубца реагентами захвата и контролями, а также емкость для проведения анализа, содержащую изолированные ячейки с растворами для отмывок и разведения образца, конъюгатом, растворами для проявления и стабилизации окраски, согласно изобретению набор реагентов захвата представлен общим антигеном возбудителя (для выделения из образца специфических IgG), антителами против IgM человека (для выделения пула IgM из образца) и моноклональными антителами для детекции ранних антигенов возбудителя; встроенные контроли расположены на отдельных сегментах подложки-иммуночипа и включают сегмент с нанесенными IgG человека (контроль работоспособности антивидовых детекторных антител), сегменты с нанесенными выявляемыми антигенами (контроль работоспособности детекторных антител к выявляемым антигенам) и свободный от специфических белков сегмент для оценки фоновых явлений, а конъюгат содержит смесь золей золота, связанных с антителами против IgG человека (детекция IgG), с общим антигеном возбудителя (детекция специфических IgM) и с моноклональными антителами для детекции ранних антигенов возбудителя.

В качестве моноклональных антител для детекции ранних антигенов возбудителя используют пары моноклональных антител к разным эпитопам определяемого белка.

Для диагностики лихорадки Денге в качестве набора реагентов захвата используют видовой антиген вируса Денге или смесь антигенов вируса Денге типов I-IV, антитела против IgM человека и моноклональные антитела против белка NS1 вируса Денге; в качестве конъюгата используют смесь золей золота, связанных с: антителами против IgG человека, видовым антигеном вируса Денге или смесью антигенов вируса Денге типов I-IV и моноклональными антителами против белка NS1 вируса Денге, а встроенные контроли содержат IgG человека и белок NS1 вируса Денге иммобилизованные на отдельных сегментах иммуночипа, а также свободный от специфических белков сегмент для оценки фоновых явлений.

Таким образом, заявляемый набор предназначен для выявления нескольких маркеров на разных стадиях инфекционного заболевания, вызванного одним возбудителем. Соотношение золей, связанных с отдельными видами детекторных антител, в конъюгате подбирают эмпирически.

Для иллюстрации изобретения представлены следующие графические фигуры. На фиг. 1 приведены основные элементы набора для дифференцированного выявления серологических маркеров со всех стадий лихорадки Денге и схема размещения на подложке (иммуночипе) тестовых и контрольных зон (реагентов захвата):

К- - зона контроля фоновых явлений (без реагентов захвата);

К1 - зона контроля работоспособности антивидовых детекторных антител (IgG человека);

К2 - зона контроля работоспособности детекторных антител к раннему белку NS1 вируса Денге (NS1);

Т1 - зона теста на антитела класса IgG против вируса Денге (смесь видовых антигенов вируса Денге I-IV типов);

Т2 - зона теста на антитела к класса IgM против вируса Денге (моноклональные антитела против IgM человека);

Т3 - зона теста на ранний белок NS1 вируса Денге (моноклональные антитела против белка NS1 вируса Денге).

На фиг. 2 приведены типичные примеры результатов мультиплексного анализа маркеров ЛД в сыворотке крови пациентов на разных стадиях заболевания, полученных с использованием предлагаемого набора (цифрами под иммуночипами обозначены периоды развития инфекции (недели с момента появления клинических симптомов).

Предлагаемый набор включает следующие основные элементы:

- плоскую подложку-иммуночип 1 для иммунологического анализа, выполненную в виде гребня, каждый зубец (иммуночип) 2 которого на своей поверхности содержит набор зон с нанесенными в виде пятен 3 реагентами захвата и положительными контролями и является аналитическим устройством; в качестве отрицательного контроля зона К- каждого зубца 2 подложки 1 оставлена свободной от специфических белков для оценки фоновых явлений;

- аналитическую многоячеечную емкость (ванну) 4 с изолированными ячейками 5, заполненными готовыми рабочими растворами и герметизированными пленкой;

- перфоратор (на чертежах не показан) для вскрытия ячеек 5 аналитической ванны 4;

Описание конкретного заявляемого набора.

Подложка 1 изготавливается из непористого синтетического материала (предпочтительно из синтетической бумаги) в виде плоского гребня, например, с пятью зубцами (иммуночипами) 2, на каждом из которых в определенном порядке нанесен набор (в виде пятен 3) реагентов захвата (Т1, Т2, Т3), включающий: видовой антиген выявляемого патогенна (Т1), моноклональные антитела против IgM человека (Т2) и моноклональные антитела против раннего белка возбудителя (Т3); а также встроенные контроли (К1, К2) расположенные на отдельных сегментах иммуночипа и включающие: сегмент К1 с нанесенными IgG человека (контроль работоспособности антивидовых детекторных антител), сегмент К2 с нанесенным ранним белком возбудителя (контроль работоспособности специфических детекторных антител), и свободный от специфических белков сегмент (К-) для оценки фоновых явлений. Видовой антиген на подложке может быть представлен нативными, синтетическими, рекомбинантными белками, их комбинацией или химерными конструкциями, содержащими наборы антигенов соответствующего возбудителя. Антитела захвата могут быть представлены моноклональными антителами и не должны конкурировать за сайты связывания (эпитопы) антигенов с детекторными антителами, а также реагировать с антивидовыми иммуноглобулинами в конъюгате.

Реагенты захвата и контроли на поверхности подложки наносятся в концентрации 5-20 мкг/мл (предпочтительно 10 нг/мл) аликвотами по 1,5-3 мкл (предпочтительно 2 мкл) в виде расположенных в определенном порядке отдельных точек (пятен) 3 с диаметром от 2 до 5 мм (предпочтительно 3 мм), что позволяет прямой визуальный учет результатов анализа.

Аналитическая ванна 4 выполнена из инертной пластмассы и имеет 12 рядов, каждый из которых состоит из пяти изолированных ячеек 5. Каждый ряд ячеек 5 заполнен определенным готовым к применению рабочим раствором и герметизирован пленкой. Каждая ванна предназначена для выполнения пяти анализов.

В качестве конъюгата в наборе используется смесь золей золота, связанных с детекторными молекулами: антител к иммуноглобулинам класса G человека, видовым антигеном возбудителя и моноклональными антителами к раннему белку возбудителя. Соотношение золей, связанных с отдельными видами детекторных антител, в конъюгате подбирают эмпирически.

Перечень содержимого ячеек ванны отражено в таблице 1.

В качестве проявляющей системы применяется состав "физического проявителя", включающий: 0,2% - метола; 0,2% - серебра азотнокислого; 0,5% - лимонной кислоты в бидистиллированной воде.

Принцип проявления заключается в каталитическом осаждении серебра из проявителя на поверхности частиц золота из конъюгата, связанных на поверхности подложки. Раствор проявителя нестабилен, поэтому в наборе проявитель используется в виде двух компонентов: сухого - таблетированной смеси лимонной кислоты и метола в соотношении 5:2 и жидкого - 0,4% азотнокислого серебра в бидистиллированной воде. Таблетки сухой смеси помещаются в ячейки 5 девятого ряда ванны 4. В ходе анализа в эти ячейки добавляют по 200 мкл бидистиллированной воды для растворения таблеток, а непосредственно перед проявлением - по 200 мкл раствора азотнокислого серебра. Раствор перемешивают многократным погружением матрицы в ячейку. Время проявления - 8 мин. Для усиления и стабилизации окраски проявленных пятен в ячейке ряда 11 используется раствор, содержащий 1% тиомочевины и 1% гидроокиси натрия в дистиллированной воде. Принцип усиления и стабилизации заключается в переводе осажденного серебра в химически устойчивый сульфид серебра, имеющий интенсивную черную окраску.

Дополнительно набор комплектуется:

- перфоратором,

- флаконом с бидистиллированной водой для растворения таблеток проявителя,

- непрозрачным флаконом с жидким компонентом проявителя - 0,4% раствор AgNO₃ в бидистиллированной воде,

- листом черной бумаги, использующимся в качестве темного фона для позиционирования иммуночипа при учете и документировании результатов.

Описание процесса использования заявляемого набора.

Перед выполнением анализа ячейки 5 вскрывают перфоратором. В первый ряд ячеек вносят исследуемые образцы сыворотки крови (15 мкл) и погружают зубцы 2 подложки 1. Затем, через определенные интервалы времени подложку 1 передвигают и погружают в ячейки 5 следующего ряда ванны 4 и, после выемки из последнего ряда ячеек 5 визуально учитывают результат по наличию или отсутствию темных пятен в местах нанесения антигенов. Для одиночных анализов используют отдельные зубцы 2, которые ножницами отделяют от гребенки подложки 1. Анализ осуществляют при температуре выше 20°С.

Далее приведены пример 1 конкретного применения набора.

Пример 1. Сравнение эффективности дифференцированного выявления маркеров лихорадки денге в сыворотке крови с использованием наборов для иммунохроматографического и дот-иммуноанализа.

В пробных экспериментах используют:

Сыворотки крови пациентов на разных стадиях заболевания: 1-я, 2-я, 3-я, 4-я недели с момента появления клинических симптомов, и сыворотка переболевшего (>5 недель).

Иммуночипы 2 с нанесенными по схеме, приведенной на фиг. 1, реагентами захвата и контролями:

Т1 - смесь видовых антигенов вирусов Денге типов I-IV;

Т2 - моноклональные антитела против IgM человека;

Т3 - моноклональные антитела против раннего белка NS1 вируса Денге;

K1 - IgG из сыворотки крови человека - контроль работоспособности детекторных антител против IgG человека;

К2 - ранний белок NS1 вируса Денге - контроль работоспособности детекторных антител против бела NS1;

Один из сегментов (К-) иммуночипов 2 оставлен свободным от специфических белков для оценки фоновых явлений.

Аналитическую ванну 4 с 12 рядами ячеек 5, заполненными растворами:

- ряд 1 - раствор для разведения образцов - ТСБ-Т (0,1 М Трис-HCl с 0,15 М NaCl и 0,1% твин-20, рН 7,2-7,4) с 0,05% (в/о) казеина, рН 8,0;

- ряды 2, 3, 5 и 6 - раствор для отмывок - ТСБ-Т;

- ряд 4 - конъюгат - смесь золей золота (20 нм), связанных с детекторными молекулами: антителами к иммуноглобулинам класса G человека, смесью видовых антигенов вирусов Денге типов I-TV и моноклональными антителами к раннему белку NP1 вируса Денге.

- ряды 7, 8, 10 и 12 - бидистиллированная вода.

- ряд 11 - раствор усилителя и стабилизатора окраски - 1% тиомочевины и 1% NaOH в дистиллированной воде.

- в ячейки ряда 9 вносят по 1 таблетке (4 мг) сухой смеси проявителя -лимонная кислота и метол в соотношении 5:2, соответственно.

Заполненные ванны герметизируют пленкой. Перед выполнением анализа герметизирующее покрытие вскрывают перфоратором. Выполнение анализа:

Мультиплексный дот-иммуноанализ образцов сывороток крови для выявления маркеров лихорадки денге проводят с использованием предлагаемого набора. Все операции выполняются при температуре не ниже 20°С. В ячейки первого ряда пипеткой вносят по 15 мкл исследуемых сывороток, перемешивают, помещают в них иммуночипы и инкубируют 20 мин. В ячейки девятого ряда добавляют 200 мкл бидистиллированной воды из флакона. Затем иммуночипы переносят из ячейки в ячейку следующих рядов с инкубациями: 4 ряд - 20 мин; 2, 3 и 5-8 ряды - 2 мин, 9 ряд - 8 мин, 10-12 ряды - 1 мин. Перед внесением иммуночипов в ячейки девятого ряда в них добавляют по 200 мкл 0,4%-го раствора азотнокислого серебра из флакона. После выемки из последней ячейки визуально учитывают результаты анализа. Результат считают положительным, если в месте нанесения соответствующего реагента захвата визуально определяется четко различимое темное пятно, все контроли работоспособности системы имеют интенсивную темную окраску, а зона К - не имеет окраски или слабо окрашена.

Иммунохроматографический анализ проводят с использованием набора «Dengue NS1Ag + Ab Combo system» (Standard Diagnostics Inc., Корея). Выполнение иммуноанализа и учет результатов проводят в соответствии с инструкциями производителя. Результаты, полученные с использованием предлагаемого набора, в сравнении с данными иммунохроматографического анализа приведены в таблице 2.

Примечания:

+ отчетливо определяемое пятно в месте нанесения антигена (положительный результат). Число крестов обозначает интенсивность окраски тестовой зоны.

- слабо заметное пятно в месте нанесения антигена или чистый фон подложки (отрицательный результат).

Вид матриц после анализа 5 сывороток от пациентов различными сроками заболевания лихорадкой Денге приведен на фиг. 2.

Предлагаемый набор содержит полный комплект компонентов, автономен и может использоваться не только в клинических лабораториях, но и во внелабораторных условиях для выполнения, как серийных, так и индивидуальных анализов. Чувствительность мультиплексного анализа с использованием предлагаемого набора не уступает чувствительности серийно выпускаемых коммерческих диагностических наборов (см. пример 1). Определение всех маркеров позволяет осуществлять диагностику на всех стадиях заболевания, в том числе ранних (до выработки специфических антител). Предлагаемый набор позволяет за счет определения в одном анализе сразу 3 маркеров значительно сократить время и расходы на обследование пациента, а также количество забираемого у пациента образца.

Таким образом, достижение технического результата заявляемого изобретения, а именно: обеспечение возможности диагностики заболевания на всех стадиях инфекционного процесса за счет одновременного дифференцированного выявления в образцах специфических антигенов и антител классов IgM и IgG подтверждается описанием изобретения и примером 1 конкретного применения указанного набора.

Источники патентной и научно-технической информации

1. https://www.euroimmun.com/startseite.html

2. http://www.biograd.ru/content/иммунокомб®-dengue-igm-igg-биспот

3. https://www.alere.com/en/home/product-details/sd-bioline-dengue-duo-nsl-ag---ab-combo.html

4. Патент РФ №2296995, МПК G01N 33/53.

5. Патент РФ №2495434, МПК G01N 33/53.

6. Poltavchenko et all. «А Kit for Multiplexed Detection of Antibodies to Agents of Hemotransmissible Infections». OnLine Journal of Biological Sciences 2016, 16 (3): 137.144 (DOI: 10.3844/ojbsci.2016.137.144).