Результат интеллектуальной деятельности: Бактериальный штамм Pseudomonas asplenii 11RW для защиты растений от болезней

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к штамму Pseudomonas asplenii 11RW для защиты сельскохозяйственных культур от болезней. Штамм обладает антагонистической, фитогормональной, фосфатмобилизующей и ростстимулирующей активностью.

Современное ведение сельского хозяйства в настоящее время не представляется возможным без применения агрохимикатов, а использование биологического потенциала микроорганизмов, проявляющие свойства PGPR (от англ. Plant Growth Promoting Rhizobacteria - ризобактерии, способствующие росту растений), позволяет создавать высокоэффективные препараты, отвечающие текущим сельскохозяйственным нуждам. Поэтому разработка новых микробиологических препаратов и удобрений является актуальной проблемой с/х микробиологии.

Известен биопрепарат Фитоспорин для защиты растений от болезней, включающий живую биомассу бактерий Bacillus subtilis, которая содержит биомассу штамма бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 [Патент RU 2099947].

В настоящее время основными продуцентами для создания микробиологических препаратов для сельского хозяйства являются виды Pseudomonas fluorescens (Планриз), Pseudomonas aureofaciens (Псевдобактерин), Pseudomonas brassicacearum (Экогрин, Полибакт), поэтому использование новых мало изученных штаммов может способствовать созданию более уникальных продуктов.

Известен штамм Pseudomonas sp. ЦМПМ В-348, используемый для получения препарата при защите злаковых от возбудителя обыкновенной корневой гнили Helminthosporium sativum [Авторское свидетельство СССР 1464468]. Однако этот штамм неэффективен для подавления корневой гнили злаков, вызываемой комплексом грибов Fusarium spp. и Helminthosporium sativum.

Известны штаммы Pseudomonas putida, подавляющие рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum [Патент США 4714614] и Pseudomonas putida ВКМ В-1743 Д, подавляющие рост грибов рода Fusarium [Патент RU 1805849]. Недостатками известных штаммов является узкий спектр антагонистического действия.

Наиболее близкими к заявляемому является штаммы Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 и Pseudomonas putida ИБ 17 [Патенты RU №2203945, №2213774], обладающие способностью оказывать антагонистическое действие на возбудителей заболеваний пшеницы твердой головней и корневыми гнилями. Недостатком штаммов является их сравнительно невысокая антагонистическая активность и неспособность к синтезу ростстимулирующих веществ, т.е. отсутствие комплексного воздействия на растения.

Технической задачей изобретения является выделение нового природного штамма и разработка нового микробиологического препарата для сельского хозяйства с широким спектром антагонистического действия против возбудителей грибных заболеваний и обладающего ростстимулирующей активностью.

Поставленная задача достигается выявлением и использованием штамма Pseudomonas asplenii 11RW, выделенного из ризосферной почвы озимой пшеницы, отобранной с поля в Краснодарском крае.

Штамм депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика с регистрационным номером ВКПМ В-13395. Родовое и видовое название культуры - Pseudomonas asplenii, название штамма - 11RW.

1. Культурально-морфологические особенности штамма с указанием среды: Колонии на ГМФ-агаре 3-5 мм в диаметре, круглые, глянцевые, выпуклые, с ровным краем. На средах ГМФ и R2A синтезирует желто-зеленый пигмент, флуоресцирующий в УФ и диффундирующий в среду. Клетки: прямые короткие одиночные палочки, грамотрицательные.

2. Область применения штамма: Защита сельскохозяйственных культур от болезней.

3. Продукт, синтезируемый штаммом: Антимикробные метаболиты, ИУК.

4. Активность (продуктивность) штамма, другие производственные показатели: Штамм обладает антагонистической, фосфатмобилизующей и ростстимулирующей активностью.

5. Способ определения активности штамма с указанием метода:

- Антагонистическую активность определяли методом «лунок» на двухслойном агаре с введением суспензии грибных и бактериальных фитопатогенов;

- Фосфатмобилизующую активность определяли на среде Пиковской, содержащей ортофосфат кальция;

- Продукцию ИУК определяли колориметрическим методом с использованием реактива Сальковского;

- Ростстимулирующую активность определяли по влиянию штамма на энергию прорастания, всхожесть, развитие и накопление сырой/сухой биомассы растений

6. Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: периодический пересев (один раз в шесть месяцев) в пробирки со скошенной средой ГМФ-агар (готовая питательная среда) или R2A, содержащей (г/л): дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 0,5, гидролизат казеина - 0,5, глюкоза - 0,5, крахмал - 0,5, К₂НРО₄ - 0,3, MgSO₄ - 0,024, пируват натрия - 0,3, агар - 18, рН=6,5-6,9. Культуру инкубируют в течение 2-х суток в термостате при температуре (28±2)°С, после чего хранят в холодильнике при температуре (4±2)°С.

7. Способ, условия и состав сред для размножения штамма:

- Поверхностное культивирование штамма проводят на среде ГМФ-агар (готовая питательная среда) или R2A, содержащей (г/л): дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 0,5, гидролизат казеина - 0,5, глюкоза - 0,5, крахмал - 0,5, К₂НРО₄ - 0,3, MgSO4 - 0,024, пируват натрия - 0,3, агар - 18, рН=6,0-6,5. Культуру инкубируют в течение 2-х суток в термостате при температуре (28±2)°С;

- Глубинное культивирование штамма проводят при температуре (28±2)°С и скорости перемешивания 220 об/мин на среде, содержащей (г/л): меласса - 30, кукурузный экстракт - 2,5, K₂HPO₄×3H₂O - 7, KH₂PO₄ - 3, MgSO₄×7H₂O - 0,1, (NH₄)₂SO₄ - 1,5, цитрат натрия × 5,5H₂O - 0,5, вода водопроводная - до 1000 мл, рН=7,2.

8. Оптимальные условия и состав среды для ферментации:

Культивирование штамма проводят при температуре (28±2)°С, скорости перемешивания 220 об/мин, аэрации 1 л воздуха/1 л среды/мин на среде, содержащей (г/л): меласса - 30, кукурузный экстракт - 2,5, K₂HPO₄×3H₂O - 7, KH₂PO₄ - 3, MgSO₄×7H₂O - 0,1, (NH₄)₂SO₄ - 1,5, цитрат натрия ×5,5H₂O - 0,5, вода водопроводная - до 1000 мл, рН=7,2.

Пример 1: Изучение фунгицидной активности

Фунгицидная активность исследуемой культуры проверялась на 48 штаммах фитопатогенных грибов различной таксономической принадлежности. Предварительно разливали по чашкам Петри стерильный 2%-ный картофельно-сахарозный агар (20 мл) (см. табл. 1). Для анализа готовили суспензию спор и мицелия гриба. Для этого 1/8 часть агара, засеянного грибом, переносили в стерильную чашку Петри, добавляли 10 мл стерильной воды и смывали конидии и мицелий стерильным шпателем. После чего добавляли 20 мкл полученной суспензии в 4,98 мл остуженной до 45°С среды 1,2% КСА, тщательно перемешивали и разливали вторым слоем. Через 1 час в агаре стерильным пробойником делали «лунки», в которые вносили по 100 мкл анализируемых бактериальных суспензий. Посевы культивировали 4-14 суток (в зависимости от скорости роста грибов) при температуре 20°С, после чего регистрировали наличие или отсутствие зон угнетения роста фитопатогенов. Результаты анализа фунгицидной активности штаммов указаны в таблице 2.

Фунгицидная активность исследуемых бактерий проверялась на 48 штаммах фитопатогенных грибов различной таксономической принадлежности (p Alternaria, Fusarium, Cercospora, Phytophthora, Bipolaris, Pyricularia и др.). Результаты анализа выявляют мощное фунгицидное действие штамма Pseudomonas asplenii 11RW: данная бактерия активно ингибирует рост 48 проанализированных тест-объектов при высокой нагрузке фитопатогенного фона.

Штамм Pseudomonas brassicacearum S-1, использованный в исследовании в качестве сравнения, проявляет антифунгальный эффект против 21 грибов, и стоит отметить, что степень подавления роста фитопатогенов эталонного штамма гораздо уступает действию 11RW. Ввиду высокой эффективности против возбудителей различных заболеваний штамм Pseudomonas asplenii 11RW выступает в качестве перспективного агента для создания микробиологического препарата с фунгицидным действием.

Препарат на основе Pseudomonas asplenii 11RW был проанализирован в широком полевом опыте на яблоне сорта Ренет Симиренко позднего срока созревания, (высоковосприимчивый к парше). Высота деревьев: 2,5-3,0 м. Возраст сада: 18 лет.

В опыте размещались варианты: контроль и 2 микробиологических фунгицида: Pseudomonas asplenii 11RW, БФТИМ КС-2. Величина одного варианта - 4 га. Контроль -отдельный участок двух рядов площадью 225 м². Место проведения опыта: Российская Федерация, центральная подзона прикубанской зоны садоводства Краснодарского края, ОАО «Агроном» Динского района. Биологическая эффективность биопрепаратов против парши (Venturia inaequalis) на яблоне сорта Ренет Симиренко (Краснодарский край, Динской район) приведена в таблице 3. Расход препаратов и рабочей жидкости: 4 л/га, 1200 л/га.

Учеты проводили перед применением биопрепаратов, на 6-е и 10-е сутки после обработки, а также при съеме урожая.

На опытном участке парша развивалась по типу тардивной эпифитотии. Распространение и интенсивность развития болезни в вариантах были одинаковыми.

Учет на 6-е и 10-е сутки после обработки показал, что после применения препарата на основе Pseudomonas asplenii 11RW количество пораженных листьев и интенсивность их поражения не изменились, как и в варианте применения биофунгицида БФТИМ КС-2. В контроле в этот период было зафиксировано нарастание инфекционного фона: увеличение количества пораженных листьев в 1,3 раза, количества пораженных плодов - в 1,2 раза. Таким образом, препарат на основе Pseudomonas asplenii 11RW успешно блокировал инфекцию парши на листьях и плодах, не уступив по эффективности биофунгициду БФТИМ КС-2.

Пример 2: Изучение бактерицидной активности

Бактерицидная активность проверялась на штаммах фитопатогенных бактерий родов Pseudomonas, Pectobacterium и Xanthomonas Предварительно разливали по чашкам Петри 2%-ный картофельно-сахарозный агар (20 мл) (см. табл. 1). Для анализа готовили суспензию фитопатогенов (культивирование на жидком бульоне Хоттингера в шейкере-инкубаторе при постоянном перемешивании 220 об./мин и температуре 30°С в течение 24 ч). После чего добавляли 1 мл полученной суспензии в 4 мл остуженной до 45°С среды 1,2% КСА, тщательно перемешивали и разливали вторым слоем. Через 1 час в агаре стерильным пробойником делали «лунки», в которые вносили по 100 мкл анализируемых образцов штаммов. Посевы культивировали 1 сутки при температуре 30°С, после чего регистрировали наличие или отсутствие зон угнетения роста фитопатогенов.

Результаты опыта показывают, что штамм Pseudomonas asplenii 11RW, обладающий высокой фунгицидной активностью, обладает также и бактерицидным действием: так, было обнаружено подавление роста фитопатогенных бактерий (см.таблица 4).

Пример 3: Изучение ростстимулирующей активности

Ростстимулирующее действие анализировали на семенах кресс-салата сорта «Данский». (см. таблицу 5). Семена замачивали на 30 минут в 10 мл рабочего раствора, контрольный вариант замачивали в 10 мл стерильной воды. Семена проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной 6 мл стерильной воды, в течение 5 суток, после чего у проростков измеряли длину корня и сравнивали с контрольным значением.

Отмечено, что сниженные концентрации жизнеспособных клеток штамма 11RW в рабочей жидкости оказывают стимулирующее действие на длину корневой системы кресс-салата, наибольший эффект показан при использовании суспензии с титром 10⁵ КОЕ/мл, при этом длина главного корня увеличивалась в среднем на 37,8% по сравнению с негативным контролем. Эталонный штамм Pseudomonas brassicacearum S-l не оказывал подобного ростстимулирующего действия, максимальный эффект был показан при использовании суспензии с титром 10⁴ КОЕ/мл (длина корня увеличивалась в среднем на 15,6% по сравнению с контролем).

Ростстимулирующее действие штамма Pseudomonas donghuensis 11RW было также показано в условиях микровегетационного эксперимента на семенах кукурузы сорта «Симпатия» (см. таблицы 6). Семена обрабатывали бактериальными суспензиями с титром не менее 1⋅10⁹ КОЕ/мл (расход суспензий - 1 л/т, расход рабочей жидкости - 10 л/т), контрольный вариант обрабатывали стерильной дистиллированной водой. Семена высевали в горшки, заполненные торфогрунтом, по 8 семян на вегетационный сосуд, повторность 4-кратная. Семена выращивали при температуре 24°С и 16/8-часовом периоде освещения в течение 41 суток, в течение которых фиксировали всхожесть, динамику изменения роста растений, длину корневой системы, сухую и сырую биомассу.

Обработка семян бактериальной суспензией Pseudomonas asplenii 11RW оказало положительное влияние на всхожесть, рост и развитие растений, обеспечив прибавку роста надземной части, так и биомассы растений.

Проведенные исследования подтверждают получении высокоэффективного препарата на основе Pseudomonas asplenii 11RW, обладающего высокой биологической активностью против возбудителей плесневения семян, фузариозной плесени и гнили, пятнистостей различной этиологии, корнееда, бактериозов и других вредоносных заболеваний сельскохозяйственных культур.

Также помимо высокой антагонистической активности и других свойств, характеризующих штамм как PGPR-бактерию, дополнительным конкурентоспособным преимуществом является технологичность продуцента и высокая скорость роста при периодическом культивировании.

Таким образом, все проанализированные аспекты создают предпосылки для создания высокоэффективного биофунгицида для сельского хозяйства на основе штамма-продуцента Pseudomonas asplenii 11RW.