Результат интеллектуальной деятельности: Способ клонального микроразмножения кодонопсиса ланцетного (Codonopsis lanceolata (Siebold.&Zucc.) Benth. & Hook. Fil.)

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к способам размножения редких и исчезающих растений, и может быть использовано для массового получения качественного посадочного материала лекарственного и декоративного растения кодонопсиса ланцетного (Codonopsis lanceolata (Siebold.&Zucc.) Benth. & Hook. Fil.), трудно размножаемого генеративным и вегетативным способами. Полученные растения могут использоваться для реинтродукции кодонопсиса ланцетного в естественные места произрастания, в качестве ценного ресурса для медицинской промышленности, в ландшафтном дизайне.

Предлагаемое изобретение является новым, так как в патентной и научно-технической литературе не найдено решения с заявленной совокупностью отличительных признаков, то есть оно не известно из уровня техники, значит, соответствует критерию ʺновизнаʺ.

Codonopsis lanceolata широко используется в традиционной медицине, так как характеризуется широким спектром лекарственных свойств. Хотя в традиционной медицине имеется информация о применении многих видов Codonopsis, наиболее часто сообщалось о биологической активности С. pilosula Franch. и С. lanceolata, что подтвердило их ценность в качестве лекарственных растений [1, 2].

Известен семенной и вегетативный способы размножения данного растения. Семена кодонопсиса характеризуются низкой энергией прорастания из-за плотной семенной оболочки. В исследованиях В.К. Ghimire, С.М. Shin, С.Н. Li и др. [3] отмечено, что всхожесть семян С. Lanceolata в условиях in vivo составила около 49,5%, а в условиях in vitro может достигать 76,0%. Семенное размножение затруднено из-за медленного развития и низкой жизнеспособности сеянцев. В Китае кодонопсис ланцетный выращивают, используя стимуляцию роста корня, в условиях, имитирующих естественную среду произрастания растения [4]. В ООО «ССХП «Женьшень» Унечского района Брянской области создана крупная плантация С. Lanceolata, и отработана технология его возделывания. Вегетативное размножение кодонопсиса так же затруднено вследствие медленного развития саженцев, трудоемкости процесса производства и недостаточного количества получаемых растений.

Альтернативой семенному и вегетативному размножению является метод клонального микроразмножения через культуру меристем. Однако до настоящего времени так и не определен оптимальный состав питательной среды, обеспечивающий интенсивное формирование микропобегов кодонопсиса из изолированных меристем и регенерацию путем прямого органогенеза. Редкие растения, в частности Codonopsis lanceolata (кодонопсис ланцетный), представляют особый интерес для клонального микроразмножения. Вид С. lanceolata включен в "Красную книгу Сахалинской области". Имеет статус Е(2) - угрожаемый вид и охраняется в природном заповеднике "Курильский". Лимитирующими факторами являются малая численность островной популяции и нарушение среды обитания [5]. Имеются сообщения о культивировании клеток и тканей некоторых представителей рода Codonopsis in vitro. В работе В.К. Ghimire и др. [6] отмечается, что для получения микропобегов С. lanceolata чаще всего использовали адвентивное побегообразование и соматический эмбриогенез. Была показана возможность размножения С. lanceolata микроклубнями in vitro, которую целесообразно использовать для воспроизводства элитных клонов и сохранения гермоплазмы вида ввиду длительности культивирования (более 4 месяцев) [7]. Однако, молекулярные маркеры выявили значительную генетическую нестабильность в растениях кодонопсиса ланцетного, регенерированных из каллуса [8].

Изобретение представляет собой способ размножения растений Codonopsis lanceolata (Siebold.&Zucc.) Benth. & Hook. Fil. методом культуры in vitro, включающий вычленение пазушных меристем, стерилизацию, высаживание на питательные среды, получение микропобегов через прямой органогенез, минуя стадию каллусообразования, их последующее размножение и укоренение, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro. После адаптации к нестерильным условиям и доращивания получают стандартные саженцы кодонопсиса ланцетного с закрытой корневой системой. Преимущества предлагаемой нами технологии и использование заявленного способа позволяет получить более 170 тысяч саженцев в год от одного экспланта.

Ход работы

В ходе исследований разработана методика клонального микроразмножения Codonopsis lanceolata (Siebold.&Zucc.) Benth. & Hook. Fil..

В качестве первичных эксплантов использовали апикальные и пазушные меристемы побегов. Для предварительной стерилизации эксплантов использовали раствор фунгицида системного действия «Фундазол» в концентрации 2% (5-7 мин.) и 70%-ный этанол (С₂Н₆О) в течение 20 мин. Дальнейшую стерилизацию проводили с помощью хлорсодержащего (гипохлорит натрия) стерилизующего агента в 7% концентрации. Оптимальная экспозиция составила 7-10 мин.

Исходя из полученных данных сравнительного анализа влияния различных минеральных основ на морфометрические показатели микропобегов, в последующих экспериментах в качестве минеральной основы питательной среды использовали MS (Murashige and Skoog) [9]. На этой среде наблюдали наибольшую высоту (27,1±1,9 мм), максимальный коэффициент размножения (3,1±0,4) и лучшее развитие микропобегов, по сравнению с другими питательными средами (QL (Quoirin and Lepoivre) [10], WPM (Woody Plant Medium) [11] и B5 [12]) (фиг. 1-2). На фигуре 2 представлены микропобеги на различных по минеральному составу питательных средах: 1 - MS; 2 - QL; 3 - В5; 4 -WPM.

В качестве регулятора роста растений использовали 6-ВАР (6-бензиламинопурин) в концентрации 0,5-1,5 мг/л. Были выявлены наиболее оптимальные концентрации 6-ВАР (фиг. 3). Таким образом, оптимальной средой для культивирования является среда с добавлением 0,5 мг/л 6-ВАР, на которой отмечаются наиболее высокие морфометрические показатели: высота микропобегов (26,9±2,4 мм), число микропобегов (1,9±0,1 шт.), коэффициент размножения (3,7±0,3).

При культивировании на питательных средах, сочетающих ауксины и цитокинины, для многих видов растений было установлено увеличение регенерационного потенциала [9], поэтому дополнительно были испытаны среды, содержащие регуляторы роста как цитокининовой природы - 6-ВАР (0,5; 1; 1,5 мг/л), так и ауксиновой природы - IAA (индолил-3-уксусная кислота) в концентрации 0,05 мг/л (фиг. 4-6). Оптимальной средой для культивирования является среда с добавлением 6-ВАР в концентрации 0,5 мг/л и IAA (0,05 мг/л). На этой среде были отмечены максимальные морфометрические показатели: коэффициент размножения (4,3±0,3); высота микропобега (29,5±0,5 мм); число микропобегов (2,9±0,1 шт.)

Укореняют побеги на агаризированной среде 1/2 MS, содержащей 20 мг/л сахарозы. На данном этапе были испытаны два регулятора роста: IAA и IBA (индолил-масляная кислота) в концентрации 0,5-1 мг/л. Наилучшие результаты были достигнуты на среде с добавлением IAA; разница между сравниваемыми концентрациями (0,5 и 1 мг/л) оказалась недостоверной (фиг. 7).

В условиях лаборатории микропобеги Codonopsis lanceolata выращивают при искусственном освещении (3000 лк) и фотопериоде 16/8 ч., температуре 23-25°С и влажности 70%.

Затем растения-регенеранты высаживают на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1, предварительно простерилизованной при 85-90°С в течение 1-2 ч.

Различные стадии клонального микроразмножения кодонопсиса ланцетного показаны на фиг. 8-9.

Источники информации

1. Ториков В.Е., Мешков И.И. Особенности выращивания и элементный состав корней кодонопсиса ланцетного {Codonopsis lanceolata) // Дальневосточный аграрный вестник. - 2017. -№2(42). - С.41-45.

2. Не J.Y., Ma N., Zhu S., Komatsu К., Li Z.Y., Fu W.M. The genus Codonopsis (Campanulaceae): a review of phytochemistry, bioactivity and quality control // Journal of Natural Medicines. - 2015. - Vol.69. - P. 1-21.

3. Ghimire B.K., Shin С.М., Li C.H., Ching I.M., Lee D.W., Kim H.Y., Kim N.Y., Lim J.D., Kim J.K., Kim M.J., Cho D.H., Lee S.J., Yu C.Y. Effect of Gibberlin and light on germination of seeds of Codonopsis lanceolata Benth. // Korean Journal of Medicinal Crop Science. - 2006. - Vol.14. - P. 303-306.

4. Пат.101444166 А КНР. Easy and quick propagating method for lance asiabell root / Feng Hailong; заявитель и патентообладатель Feng Hailong. - №200810189833, заявл. 30.12.2008; опубл. 03.06.2009.

5. Баркалов. В.Ю. (составитель) Красная книга Сахалинской области: Растения. - Южно-Сахалинск: Сахалинское книжное издательство, 2005. - 348 с.

6. Ghimire В.К., Shin С.М., Li С.Н., Kim N.Y., Chung I.М., Lim J.D., Kim J K., Kim M.J., Cho D.H., Yu C.Y. High frequency plant regeneration from leaf, petiole and internode explants of Codonopsis lanceolata Benth. // Korean Journal of Medicinal Crop Science. - 2007. - Vol.15.- P. 73-81.

7. Kim J.A., Moon H.K., Choi Y.E. Microtuber formation from in vitro Codonopsis lanceolata plantlets by sugar // Journal of Plant Biotechnology. - 2013. - Vol.40. - P. 147-155.

8. Slupski W., Tubek В., Matkowski A. Micropropagation of Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. by axillary shoot multiplication // Acta biologica Cracoviensia. Series: Botanica. - 2011. - Vol. 53/2. - P. 87-93.

9. Murashige Т., Skoog F. Arevised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol.15. - №43. - P. 473-497.

10. Quoirin M., Lepoivre P. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp.// ActaHortic. - 1977. - Vol.78. - P. 437-442.

11. McCown, B.H. and Lloyd, G. Woody Plant Medium (WPM) - a mineral nutrient formulation for microculture of woody plant species // HortScience. - 1981. - Vol.16. - P. 453-453.

12. Gamborg O.L., Evelegh D.E. Culture methods and detection of glucanases in cultures of wheat and barley // Can. J. Biochem. - 1968. - Vol. 46. - №5. - P. 417-421.