Результат интеллектуальной деятельности: Способ отбора дигаплоидных растений капусты белокочанной Brassica oleracea устойчивых к сосудистому бактериозу

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано для ускорения селекционного процесса.

Известны способы половой (Frontiers in Plant Science, 8, 2017, P. 1-16. doi:10.3389/fpls.2017.01255), (Euphytica, 204(1), 2015, P. 149-162. doi:10.1007/s 10681-015-1352-0) и соматической (Theoretical and Applied Genetics, 91(8). 1995, P. 1293-1300. doi:10.1007/bf00220944) гибридизации линий-доноров (источников) устойчивости В. carinata с диплоидными сортами и линиями В. oleracea с целью передачи генов устойчивости к сосудистому бактериозу (одному из наиболее вредоносных заболеваний капустных культур).

Половая гибридизация диплоидного В. oleracea с аллотетраплоидным В. carinata родственным видом проходит с большим трудом, для получения F₁-гибридов требуется применение технологии спасения зародышей. Полученные как половым, так и соматическим путем F₁-гибриды являются амфигаплоидами (2n=26, ВСС), и, как правило, стерильны, поэтому получение потомства от самоопыления таких растений невозможно, а проведение беккроссов осложнено.

Наиболее близким к изобретению по совокупности существенных признаков относится способ (Euphytica, 28(2), 1979, Р. 257-266. doi:10.1007/bft)0056583) гибридизации Brassica napus (2n=38) × Brassica oleracea (2n=18 и 2n=36) с целью передачи генов устойчивости к киле. Из 19 полученных межвидовых гибридов 3 являлись 28-хромосомными растениями, полученными в комбинации скрещивания В. napus × В.oleracea (2n=18), 15 растений с соматическим числом хромосом 37 между В. napus × В.oleracea (2n=36). Дальнейшее беккроссирование всех F₁-гибридов проводили диплоидными линиями капусты. Для основных исследований были выбраны 28-хромосомные F₁-гибриды и их 18-хромосомные ВС₁-потомства. Авторами было высказано предположение, что для дальнейшей работы могут быть использованы 37-хромосомные F₁-гибриды и их ВС₁-потомства, а их единственный недостаток - большое число хромосом, можно решить, получив растения с гаметным числом хромосом в культуре изолированных микроспор. Однако при этом у разработчиков данной технологии (Canadian Journal of Genetics and Cytology, 17(4), 1975, P. 655-666. doi:10.1139/g75-081, Canadian Journal of Botany, 55(10), 1977, P. 1383-1388. doi:10.1139/b77-l60) опыт завершился неудачей.

Заявляемое изобретение направлено на решение проблемы интрогрессии целевых генов (генов устойчивости к Xanthomonas campestris pv. campestris (Pammel) Dowson (Xcc) (возбудитель сосудистого бактериоза) и возбудителям других болезней) из амфидиплоидных видов Brassica в диплоидные.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в создании F₁-гибридов диплоидных Brassica oleracea с генетической устойчивостью к сосудистому бактериозу и другим болезням.

Для решения указанной проблемы и достижения заявленного результата Способ создания диплоидных линий капусты белокочанной Brassica oleracea устойчивых к сосудистому бактериозу, включающий межвидовую гибридизацию с последующим беккроссированием и отбором растений с целевым признаком, межвидовую гибридизацию проводят между амфидиплоидным видом горчицы эфиопской В. carinata и тетраплоидной капустой белокочанной В.oleracea, т.е. диплоидный вид-реципиент переводят на тетраплоидный уровень и используют в гибридизации с аллотетраплоидным (полиплоидным) видом-донором с целевыми генами при сопровождении технологией спасения зародышей получают отдаленные (межвидовые) F₁-гибриды, а затем путем беккроссирования F₁-гибридов тетраплоидными линиями капусты белокочанной В.oleracea популяцию ВС₁, после чего ВС₁ также беккроссируют тетраплоидными линиями капусты белокочанной и получают популяцию ВС₂, проводят отбор растений с целевым признаком, затем за счет гаплоидизации резистентных полиплоидных растений ВС₂ производят редукцию числа хромосом полиплоидных растений, отбирают растения-регенеранты с целевым геном/признаком и видовым числом хромосом исходного диплоидного вида-реципиента, получая диплоидные устойчивые к сосудистому бактериозу растения.

Предложенный способ поясняется схемой создания диплоидных растений В. oleracea устойчивых к сосудистому бактериозу,

где: КИМ - культура изолированных микроспор;

R - устойчивость;

Хсс - Xanthomonas campestris pv. campestris (Pammel) Dowson (возбудитель сосудистого бактериоза).

Сведения, подтверждающие возможность осуществления способа

Пример осуществления способа.

Получение F₁-гибридов.

Проводили реципрокные скрещивания тетраплоидной линии капусты белокочанной В.oleracea (СССС, 2n=36) и линии PI 199947 горчицы эфиопской В.carinata (ВВСС, 2n=34). В результате скрещивания были получены два межвидовых гибрида, В. oleracea × В.carinata и В. carinata × В.oleracea, с применением технологии спасения зародышей в культуре семяпочек/зародышей по методике (Euphytica, 18(3), 1969, Р. 425-429. doi:10.1007/bf00397792). F| имели промежуточную морфологию родителей, устойчивость к 1, 3, и 4-й расам Хсс (испытания проводили на искусственном инфекционном фоне согласно European Journal of Plant Pathology, 104(8), 1998, P. 821-827. doi:10.1023/a: 1008642829156), 2n=35 (препараты готовили из кончиков корней методом, описанном Molecular Cytogenetics, 7(1), 21, 2014, doi:10.1186/1755-8166-7-21). Для дальнейшей работы был выбран гибрид, где в качестве материнского компонента скрещивания была использована капуста белокочанная.

Получение популяций ВС₁.

Далее межвидовой гибрид беккроссировали тетраплоидной линией капусты белокочанной. В результате было получено 13 растений, 6 проявили устойчивость к 1, 3 и 4 расам Хсс, 2n=34…36. Для производства ВС₂ выделили два фертильных и одно стерильное, устойчивых растений с 2n=36.

Получение ВС₂

Растения ВС₁ беккроссировали тетраплоидными линиями капусты белокочанной и получили 42 растения, в реципрокных скрещиваниях - 15. Из ВС₂-популяции выбрали 5 устойчивых к трем расам, число хромосом у всех составляло 36.

Производство дигаплоидных растений из ВС₂

С использованием 5-и устойчивых к сосудистому бактериозу растений ВС₂ в культуре изолированных микроспор получены 61 растений-регенерантов, из них 5 устойчивых к 3-м расам Хсс. У отобранных на искусственном инфекционном фоне растений число хромосом варьировалось в пределах 2n=18…36 (Табл. 1).

Как видно из таблицы 1, число устойчивых к Хсс растений составляет 10% от общего числа полученных генотипов. Из 5-ти полученных в культуре изолированных микроспор растений только одно оказалось тетраплоидным, остальные с уровнем плоидности приближенным к диплоидному состоянию и одно с 2n=18, что полностью соответствует видовому числу хромосом В.oleracea.

Таким образом, с помощью производства дигаплоидов из тетраплоидных растений возможно получить 18-ти хромосомные растения капусты белокочанной.

Технико-экономические преимущества изобретения по сравнению с прототипом это сокращение временного промежутка интрогрессии генов устойчивости к сосудистому бактериозу из В. carinata в В.oleracea (4 года, по сравнению с классической гибридизацией диплоидными линиями - 7 лет).