Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения каллусной культуры чайного растения (Camellia sinensis. L.)

Область применения.

Изобретение относится к области биотехнологии и физиологии растений, в частности, к способу получения каллусной культуры чайного растения, что может быть использовано в фармацевтической, пищевой, косметологической промышленности, а также для фундаментальных исследований в области физиологии растений и биотехнологии.

Уровень техники.

Чайное растение обладает специализированным обменом, направленным на биосинтез фенольных соединений, в том числе фенилпропаноидов, которые представлены фенольными кислотами (Lorenzo J. М., Munekata P. Е. S. Phenolic compounds of green tea: Health benefits and technological application in food //Asian Pacific journal of tropical biomedicine. 2016. T. 6. №8. C. 709-719).

Показано, что они обладают высокой биологической активностью, включая антиоксидантную, антимикробную, противовирусную, антиканцерогенную и кардиопротекторную, что вызывает интерес для их применения (Borges A., Ferreira С, Saavedra M.J., Simoes М. Antibacterial activity and mode of action of ferulic and gallic acids against pathogenic bacteria //Microbial Drug Resistance. 2013. T. 19. №4. C. 256-265).

Перспективным источником для получения биологически активных веществ являются клеточные культуры, выращиваемые в условиях in vitro. Однако их содержание ниже по сравнению с интактным растением (Загоскина Н.В., Дубравина Г.А., Запрометов М.Н. Особенности формирования хлоропластов и накопление фенольных соединений в фотомиксотрофных каллусных культурах чайного растения // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 537-543).

В связи с этим, перед исследователями встает задача получения более высокопродуктивных культур in vitro, что может быть выполнено с помощью различных подходов, включая, экзогенное воздействие регуляторов роста, элиситоров или предшественников биосинтеза биологически активных соединений.

Известен способ получения гетеротрофных культур чая (Camellia sinensis L.) с повышенным накоплением фенольных соединений. Каллусы выращивают на модифицированной питательной среде Хеллера (глюкоза 25 г/л), содержащей гормоноподобные соединения (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) или 1-нафтилуксусная кислота) в различных концентрациях (Николаева Т.Н., Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. Образование фенольных соединений в каллусных культурах чайного растения под действием 2,4-Д и НУК //Физиология растений. 2009. Т. 56. №1. С. 53-58).

Основным недостатком этого способа является низкий рост культуры и незначительное повышение количества фенольных соединений.

Еще одним способом были получены суспензионные культуры из каллуса чая (Camellia sinensis L.) с повышенным содержанием фенольных соединений на основе добавления во время стационарной фазы роста клеток в питательную среду Мурасиге-Скуга регуляторов роста (индолил уксусная кислота - 5 мг/л, 2,4-Д - 5 мг/л, бензиламинопурин - 2 мг/л, кинетин - 2 мг/л) в разных комбинациях и предшественников биосинтеза фенольных соединений - L-тирозина, L-фенилаланина (концентрация 20 мМ) и шикимовой кислоты (концентрация 10-30 мМ) (Muthaiya M.J., Nagella P., Thiruvengadam M., Mandal A.A. Enhancement of the productivity of tea (Camellia sinensis) secondary metabolites in cell suspension cultures using pathway inducers //Journal of Crop Science and Biotechnology. 2013. T. 16. №2. C. 143-149).

Недостатками данного способа являются использование достаточно высоких концентраций экзогенных веществ и небольшой конечный выход полифенолов.

Известен также способ регуляции биосинтеза полифенолов в каллусной культуре Ephedra alata Decne, выращиваемой в течение 60 дней на питательной среде Мурасиге-Скуга (30 г/л сахароза, 2,4-Д - 1 мг/л, кинетин - 1 мг/л) в присутствии разных концентраций L-фенилаланина или элиситора - гидролизата казеина в условиях 16-ти часового фотопериода при 25°С (Hegazi G.A.E., El-Lamey Т.М. In vitro production of some phenolic compounds from Ephedra alata Decne //J Appl Environ Biol Sci. 2011. Т. 1. №8. C. 158-16).

Недостатком этого способа является относительно длительное культивирование каллусов.

Способ получения высокопродуктивных клеточных культур, наиболее близкий к заявленному изобретению, изложен в работе Palacio L., Cantero J.J., R., Goleniowski M. Phenolic compound production by Larrea divaricata Cav. plant cell cultures and effect of precursor feeding //Process biochemistry. 2011. T. 46. №1. C. 418-422 - прототип.

Он состоит в получении суспензионных культур через каллус из листьев растения Larrea divaricata Cav. - продуцента лигнана (нордигидрогваяретовая кислота) и фенилпропаноидов (n-кумаровая кислота, феруловая кислота, синаповый спирт). Клеточную культуру выращивают в жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга с 9 мкМ 2,4-Д и 5 мкМ бензиладенина на роторном шейкере при 25°С в условиях светового/темнового (16/8) фотопериода с использованием холодного белого флуоресцентного света в течение 15 дней.

В этом способе для увеличения продукции фенольных соединений при субкультивировании суспензии в питательную среду того же состава вносят этанольные растворы как L-фенилаланина, так и других соединений, и далее выращивают в условиях, описанных выше.

Согласно данным прототипа максимальное накопление биомассы клеток у необработанных культур происходит на 9-тый день роста. Воздействие L-фенилаланина в концентрации 3 мМ приводит к ингибированию роста клеток растений. При этом количество n-кумаровой кислоты максимально увеличивается на 4-ый день культивирования и постепенно снижается к концу пассажа. Синаповый спирт имеет ту же тенденцию накопления.

Недостатками способа-прототипа являются кратковременное повышение содержания фенилпропаноидов на определенном этапе роста культуры и невысокий выход биомассы клеток. Кроме этого, использование источников флуоресцентного света при выращивании клеточной культуры удорожает целевой продукт.

Задача изобретения.

Задача настоящего изобретения - получение каллусной культуры чайного растения (Camellia sinensis L.) с высокой способностью накопления фенилпропаноидов при стабильной ростовой активности.

Решение задачи.

Данная задача решается новым способом получения культуры чая (Camellia sinensis L.), включающий выращивание каллусов на питательной среде, содержащей макро- и микросоли, витамины, аденин, дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), агар, при 26°С, перенос их в жидкую питательную среду того же состава и воздействие L-фенилаланина в концентрации 3 мМ, причем, неизмельченный каллус помещают в жидкую питательную среду Хеллера, содержащую макро- и микросоли по Хеллеру, витамины по Уайту, мезо-инозит - 20 мг/л, Са-пантотенат - 0,1 мг/л, аденин - 5 мг/л, 2,4-Д - 5 мг/л, глюкозу - 25 г/л, выращивают при относительной влажности воздуха 70%, на качалке с частотой 90 об./мин. в условиях темноты 14 дней, а в качестве растворителя для L-фенилаланина используют воду.

Положительный эффект предлагаемого изобретения состоит в том, что перенос каллусов чая в жидкую питательную среду способствует поступлению в клетки L-фенилаланина, что приводит к повышению биосинтеза фенилпропаноидов, обладающих широким спектром биологической активности. При выращивании культуры чая в темновых условиях происходит более интенсивный (146,5%) и стабильный рост каллусов в течение пассажа.

Новизна изобретения.

Новизной настоящего изобретения является совокупность признаков прямого переноса неизмельченного каллуса в жидкую питательную среду Хеллера, содержащую макро- и микросоли по Хеллеру, витамины по Уайту, мезо-инозит - 20 мг/л, Са-пантотенат - 0,1 мг/л, аденин - 5 мг/л, 2,4-Д - 5 мг/л, глюкозу - 25 г/л, агар 7%, и выращивание его в темновых условиях.

Изобретение иллюстрируется следующим образом:

Пример 1. Каллусную культуру стебля чайного растения (Camellia sinensis L.), грузинская популяция; штамм ИФР, №54) выращивают 42 дня в условиях факторостата при 26°С, относительной влажности воздуха 70%, в темноте на агаризованной питательной среде Хеллера, содержащей макро- и микросоли по Хеллеру, витамины по Уайту, мезо-инозит - 20 мг/л, Са-пантотенат - 0,1 мг/л, аденин - 5 мг/л, 2,4-Д - 5 мг/л, глюкоза - 25 г/л, агар 7%. Для эксперимента каллусы переносят в колбы с 20 мл жидкой питательной среды того же состава и добавляют через стерильный мембранный фильтр (0.22 мкм, Millex) водный раствор L-фенилаланина в концентрации 3 мМ. Для контрольного варианта используют питательную среду без L-фенилаланина. Культуру выращивают на качалке с частотой 90 об/мин. в указанных условиях. Цикл субкультивирования составляет 14 дней. Отбор проб для определения прироста и содержания фенилпропаноидов осуществляют на 3, 7, 9, 14 дни выращивания.

Пример 2. Эксперимент проводят аналогично примеру 1, с разницей в том, что каллусную культуру стебля чайного растения (Camellia sinensis L.), выращивают на агаризованной питательной среде Хеллера 35 дней, что уменьшает длительность пассажа.

Для определения веса сырой массы каллусы отделяют от среды культивирования фильтрованием на бумажных фильтрах, промывают дистиллированной водой для удаления остатков среды и взвешивают. Прирост рассчитывают, как отношение Х_max/Х₀, где X - масса соответственно в конце и начале цикла субкультивирования, выраженное в процентах.

Содержание воды в каллусах определяют после их высушивания до постоянной массы при 70°С и считают по стандартной методике.

50 мг сырой массы каллусных культур экстрагируют 96% этанолом (соотношение биомасса/экстрагент 1:3) при 45°С в течение 45 минут. После центрифугирования гомогената (16000 об./мин, 20 мин., микроцентрифуга Eppendorf), надосадочную жидкость отделяют и используют для определения содержания фенилпропаноидов. Количество фенилпропаноидов определяют методом прямого спектрофотометрирования (спектрофотометр СФ-26, Россия) при длине волны 330 нм. Калибровочную кривую строят по кофейной кислоте.

Исследования проводят в трех биологических и двух аналитических повторностях. Все результаты статистически обрабатывают в программе Excel. В таблицах представлены средние значения и их стандартные ошибки.

Перечень графических материалов:

Таблица 1. Ростовые параметры культур, выращиваемых в условиях in vitro, при воздействии L-фенилаланина (табл. а, б).

Таблица 2. Содержание воды в каллусах чайного растения при воздействии L-фенилаланина.

Таблица 3. Содержание фенилпропаноидов в культурах, выращиваемых в условиях in vitro, при воздействии L-фенилаланина (табл. а, б, в).

Результаты изобретения.

Как следует из представленных данных (таблица 1, а) прирост каллусной культуры чая в темноте к 14 дню культивирования составляет 135,2%, что является ее характерной особенностью. После действия L-фенилаланина ростовая активность клеток повышается, начиная с 7 дня, и достигает своего максимума к концу пассажа (146,5%).

В отличие от данных способа-прототипа, отображающих выраженное ингибирование роста суспензионных клеток на свету (таблица 1, б), в наших исследованиях выявлена положительная динамика прироста.

Таким образом, действие L-фенилаланина приводит к повышению ростовой активности клеток растений при культивировании в темновых условиях.

Еще одним показателем при оценке роста культур in vitro является определение содержания в них воды. Как следует их представленных в таблице 2 данных, оводненность растительных клеток чая при действии L-фенилаланина практически не изменяется и остается на уровне контроля в течение пассажа. Все это свидетельствует о стабильном росте культуры на среде с этим предшественником.

Как следует из представленных в таблице 3 данных, эндогенный уровень фенилпропаноидов в каллусной культуре чая (Camellia sinensis L.) выше (табл. 3а), чем в суспензионных клетках ларреи (Larrea divaricata Cav.) прототипа (табл. 3б и 3в).

В настоящем изобретении в опытном варианте воздействие L-фенилаланина приводит к увеличению количества фенилпропаноидов в 4-5 раз по сравнению с контролем, что отмечается на протяжении всего цикла выращивания.

В известном способе в присутствии действующего вещества наблюдается лишь кратковременное увеличение количества фенилпропаноидов с максимальным накоплением на 4-ый день культивирования, тогда как в настоящем изобретении отмечается стабильная тенденция к биосинтезу фенилпропаноидов на протяжении всего цикла выращивания (14 дней).

Таким образом, совокупность отличительных признаков работает на достижение положительного эффекта, позволяя достигнуть поставленной задачи настоящего изобретения, а именно, получения каллусной культуры чайного растения (Camellia sinensis L.) с высокой способностью накопления фенилпропаноидов.

В результате изобретения показана возможность достаточно быстрого получения культуры чая со стабильными ростовыми параметрами и устойчивым синтезом фенилпропаноидов, обладающих высокой биологической активностью. Данный способ позволяет получать вещества вторичного метаболизма с антиоксидантными свойствами из биотехнологически чистого растительного сырья и вне зависимости от сезонного периода.