Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ИНДУКЦИИ СУПЕРОВУЛЯЦИИ ПО КОМБИНИРОВАННОЙ СХЕМЕ В ТЕХНОЛОГИИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности скотоводству для разведения крупного рогатого скота методом трансплантации эмбрионов для дальнейшего геномного редактирования и селекции здорового поголовья.

Основу трансплантации эмбриона составляют шесть последовательных технологических процессов: подготовка доноров, реципиентов, получение эмбрионов, морфологическая оценка их качества, замораживание и пересадка реципиентам.

Первой ступенью в реализации метода трансплантации эмбрионов является отбор коров-доноров. Метод трансплантации подходит для ограниченного количества особей, которые могут стать улучшателями породы по одному или нескольким значимым признакам. На роль доноров выбирают породистых телок или коров, обладающих высокоценными качествами, чтобы получить от них значительное число телят, имеющих такие же свойства. Донорами могут служить животные, принадлежащие к любой желаемой ценной породе.

Коровы с нарушенным половым циклом, кистами яичников к использованию в качестве доноров непригодны.

В яичниках здоровых коров содержатся сотни тысяч незрелых половых клеток (ооцитов), но созревает в течение одного полового цикла, как правило, один фолликул. Поэтому оплодотворяется только одна яйцеклетка и рождается всего один теленок.

Под суперовуляцией понимается выделение множества яйцеклеток из яичников коровы в течение одного полового цикла, что является одним из важнейших этапов в технологии трансплантации эмбрионов. Для этих целей существуют определенные методы, которые позволяют максимально полно использовать биологический репродуктивный потенциал яичников коров. В основе этого метода лежит синхронный рост множества фолликулов, их созревание с последующей овуляцией.

Согласно известному способу, по Инструкции по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, гормональной обработки животного для суперовуляции у доноров, который включает в себя 8-10 - кратное введение препарата, содержащего фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ), каждые 12 часов в течение 4-5 дней (4-х или 5-ти дневная схема введения гонадотропных препаратов). Данный промежуток времени (4-5 дней) является достаточным для полного созревания множества фолликулов с образованием полноценных качественных яйцеклеток. Одним из главных недостатков этого метода, является короткий период инактивации ФГС, поэтому для устойчивого поддержания действенного уровня гормона в крови, необходимого для роста и созревания большого количества фолликулов необходимо многократно вводить в организм животного препараты, что обуславливает увеличение трудоемкости процесса. К тому же, такое многократное введение препарата обуславливает колебание концентрации вводимых гонадотропинов в сыворотке крови животного, что уменьшает шансы на получение высоких результатов суперовуляции.

Известен способ (патент BY 12490), где в качестве пролонгатора используют порошкообразный полимер поливинилового спирта (ПВС), который разводят в физиологическом растворе с температурой 50-60°С до концентрации 12% суспензии, которую охлаждают до 40-42°С и в количестве 5-7 мл смешивают с 50 мг натурального ФСГ. Полученный рабочий раствор однократно вводят подкожно коровам-донорам в область лопатки по 5-7 мл/голову. Все животные-доноры были обработаны натуральным гормональным препаратом российского производства торговой марки «ФСГ-супер» согласно его инструкции. Недостатком данного способа является низкая эффективность пролонгирующего действия поливинилового спирта на ФСГ, используемого в соответствии со способом-прототипом при индукции суперовуляции у коров-доноров в виде препарата торговой марки «ФСГ-супер». В результате чего недостаточно происходит синхронный рост, созревание и овуляция множества фолликулов, что приводит к низкому проценту качественных эмбрионов.

Согласно способу стимулирования пролонгации ФСГ для суперовуляции у коров-доноров (прототип - патент BY 12490), который включает однократное введение коровам-донорам в лютеиновую фазу полового цикла препарата «ФСГ-супер», содержащего гипофизарные гонадотропины фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ), в сочетании с пролонгатором, с последующим введением через 48 часов простогландина двухкратно с интервалом в 12 часов в дозах 500 и 250 мкг/голову по клопростенолу. Животных двукратно искусственно осеменяют спермой проверенного быка-производителя через 48 и 60 часов после первой инъекции простагландина F2α. Извлечение эмбрионов осуществляют на 7-й день полового цикла. Полученные эмбрионы подвергают подсчету, оценке их жизнеспособности и пригодности к эмбриопересадкам.

Известен способ продления действия однократной инъекции ФСГ с использованием в качестве пролонгаторов карбокси-метил-целлюлозы и поливинилпирролидона, 3,2%-го раствора желатина (Smith L.E., Sitton G.D., Vincent С.K. Limited inqection of follicle stimulating hormone for multiple births in beef cattle. // J. Anim. Sci., 1973, 37, 523-527). Известен пролонгатор пролонгон, позволяющий при однократной инъекции ФСГ вызывать суперовуляцию у 75% животных при числе овуляций от 9,9 до 10,7 (при использовании различных препаратов ФСГ) и выходе качественных эмбрионов от 2,9 до 3,5 на донора. При этом был отмечен более высокий уровень приживляемости эмбрионов, полученных от коров, обработанных ФСГ с пролонгоном. (Довгопол В.Ф., Осташко Ф.И., Исаченко И.И. Совершенствование нехирургического метода трансплантации эмбрионов. // Зоотехния, 1992, 2, 14-17). Однако вышеуказанные пролонгаторы не обеспечивают оптимального времени эффективного действия фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), необходимого для вызывания множественного роста фолликулов, либо обеспечивают высокое число овуляций, но при этом количество полученных пригодных эмбрионов ниже на 50% от среднестатистического, либо вызывают поликистоз яичников, который может привести к вынужденной выбраковке животного.

Задачей изобретения является создание суперовуляции у коров-доноров с пролонгированием действия гипофизарных гонадотропинов, позволяющего повысить количество синхронно созревших фолликулов с последующей их овуляцией и выходом качественных зрелых яйцеклеток, пригодных для оплодотворения, а после их оплодотворения - к повышению количества получаемых качественных эмбрионов. Количество и качество полученных эмбрионов - главный показатель эффективности проведения индукции суперовуляции у коров-доноров эмбрионов.

В связи с этим в технологии трансплантации эмбрионов возникает целесообразность в разработке и внедрении способа индукции суперовуляции по комбинированной схеме. Благодаря разработанной схеме увеличивается время нахождения экзогенного гонадотропина в организме и обеспечивающих равномерное его высвобождение, приводящее к поддержанию необходимого уровня этого гормона в крови, что дает возможность максимально использовать биологический репродуктивный потенциал яичников коров, синхронизируя рост множества фолликулов и их созревание с последующей овуляцией.

Техническим результатом изобретения является повышение количества качественных эмбрионов, полученных от коров-доноров в результате проведения суперовуляци.

Предложенный способ стимуляции суперовуляции состоит из двух этапов:

1. Подготовительный этап (который в свою очередь состоит из двух блоков):

- Контроль уровня кормления и полноты рациона животного донора.

- Соблюдение ежедневного часового моциона, либо проведения ректогенитального массажа.

2. Основной этап. Схема с использованием гормональных препаратов с фолликул стимулирующей активностью.

Препараты вводят животному - донору по схеме, представленной в таблице 1.

Сурфагон. Лекарственный препарат в 1 мл в качестве действующего вещества содержит сурфагона 5 или 10 мкг, вспомогательные вещества: 9 мг хлорида натрия, 0,5 мг нипагина, а также воду для инъекций до 1 мл.

Сурфагон является синтетическим аналогом гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ) - люлиберина. Конкурентно связывается с рецепторами клеток передней доли гипофиза, вызывая, как и другие аналоги ГнРГ, кратковременное повышение уровня половых гормонов в крови. Повышенное содержание гонадотропинов в крови сохраняется в течение 3-4 часов после введения, затем содержание быстро падает. Период полураспада сурфагона такой же, как и у природного люлиберина. В течение этого времени пептид распадается на аминокислоты и выводится из организма.

Овулин (Global-Vet) Гормональное лекарственное средство в 1 флаконе в качестве действующего вещества содержит хорионический гонадотропин человеческий (hCG) - 1000 ЕД/флакон, а в качестве вспомогательного компонента маннитол - 0,002 г/флакон.

Гонадотропин, входящий в состав Овулина, оказывает гонадотропное, преимущественно лютеинизирующее действие.

Эстрофан. В 1 мл препарата в качестве действующего вещества содержится клопростенол -250 мкг и вспомогательные компоненты: лимонная кислота - 9,55 мг, хлоркрезол - 1 мг, гидроокись натрия - 5 мг и вода для инъекций до 1 мл.

Клопростенол. Синтетический гормон простагландин ПГF2а. Он оказывает лютеолитическое действие на желтое тело яичников, снимает тормозящее действие прогестерона на гипоталамо-гипофизарный комплекс способствует росту фолликулов в яичниках и, как следствие этого, увеличению уровня эстрогенов в крови, проявлению половой охоты и последующей овуляции созревших фолликулов.

Эстрофан. Для индукции и синхронизации половой охоты препарат вводят коровам и телкам в дозе 2 мл дважды с интервалом 10 суток.

Прогестерон. Препарат обладает биологическим и лечебным действием естественного гормона желтого тела: уменьшает возбудимость и сокращение мускулатуры матки, создает необходимые условия для оплодотворения, снижает чувствительность матки к окситоцину, стимулирует функциональную деятельность молочной железы.

Тетравит выпускают в виде прозрачного, маслянистого раствора для инъекций светло-желтого цвета. В 1 мл раствора содержатся следующие витамины: F (5 мг), Е (20 мг), D3 (25000 ME), А (50000 ME).

Научно-хозяйственный опыт проводили на коровах черно-пестрой породы. Оценку эффективности программы суперовуляции проводили по количеству подготовленных животных по данной методике, в процентном соотношении ко всем животным которым провели искусственное осеменение, и полученным от них полноценных эмбрионов.

Для проведения индукции суперовуляции животных, технику по трансплантации эмбрионов было выдано техническое задание в письменном виде с включением информации о номерах коров и датах введения препаратов. Было обработано 3 аналогичные коровы-донора с однотипным кормлением и условиями содержания. Эффективность способа определяли путем подсчета количества эмбрионов, пригодных к эмбриотрансплантации. Результаты опыта приведены в таблице 2.

Коровам-донорам эмбрионов черно-пестрой породы под номерами №1, 2, 3, в возрасте 5 лет провели индукцию суперовуляции в соответствии с патентуемым способом.

Работу по введению лекарственных препаратов проводили согласно схемы 1. В первый день внутримышечно в область крупа ввели Сурфагон 10 мл. На седьмой день вводили Эстрофан 3 мл + Тетравит 10 мл. На десятый день вводили Овулин 5 мл, после чего провели искусственное осеменение. Использовали замороженную сперму высокого качества с высоким процентом нормальных, подвижных спермиев. На седьмой день после осеменения коровы-донора вводили прогестерон 2 мл, после чего проводили извлечение эмбрионов.

У первой коровы-донора было получено 18 зародышей, из которых 14 штук были качественными и пригодными для трансплантации или криоконсервации.

У второй коровы-донора было получено 15 зародышей, из которых 11 штук были качественными и пригодными для трансплантации или криоконсервации.

У третьей коровы-донора было получено 20 зародышей, из которых 16 штук были качественными и пригодными для трансплантации или криоконсервации.

Таким образом, применение предложенного способа позволяют корове или телке, выделить более 10 жизнеспособных яйцеклеток за один половой период.

Возможностью осуществления данного изобретения является введение в первый день - Сурфагон 10 мл. На седьмой день - Эстрофан 3 мл + Тетравит 10 мл. На десятый день - Овулин 5 мл, после чего провели искусственное осеменение. На седьмой день после осеменения коровы-донора - прогестерон 2 мл, после чего извлечение эмбрионов.

Источники информации

1. Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. - М. - Госагропром СССР. - 1987.

2. Авторское свидетельство №19990346, кл. A61D 19/04.

3. Условия применения биотехнологических методов искусственного осеменения племенных коров и телок.- М.: ФГБНУ «Росинформагротех», 2017. - 24 с.

4. Приказ Минсельхоза России от 18 марта 2016 г. №102. «Об утверждении условий применения биотехнологических методов искусственного осеменения племенных коров и телок».

5. Патент BY 12490 С1 2009.10.30

6. ГОСТ 28424-2014 Средства воспроизводства «Эмбрионы крупного рогатого скота» Т/У Москва. - Стандартинформ. - 2015.

7. Довгопол В.Ф., Осташко Ф.И., Исаченко И.И. Совершенствование нехирургического метода трансплантации эмбрионов. // Зоотехния, 1992, 2, 14-17.

8. Smith L.E., Sitton G.D., Vincent С.K. Limited inqection of follicle stimulating hormone for multiple births in beef cattle. // J. Anim. Sci., 1973, 37, 523-527.