Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДЛИТЕЛЬНОГО БЕСПЕРЕСАДОЧНОГО ХРАНЕНИЯ РАСТЕНИЙ ВИНОГРАДА В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

Изобретение относится к области биотехнологии растений и виноградарству и может быть использовано для длительного беспересадочного хранения ценных и редких сортов винограда в условиях in vitro, в исследованиях по физиологии винограда. Служит охране окружающей среды.

Методы культивирования in vitro позволяют создать биотехнологию поддержания и хранения генофонда при замедленном росте этих объектов. Насущной необходимостью является обеспечение коллекций материалом, находящимся под угрозой исчезновения.

При хранении коллекций in vitro в оптимальных условиях роста растений (t=20-23°С), возникает необходимость частого переноса микрорастений на свежую питательную среду, что повышает стоимость хранения образца и увеличивает риск его инфицирования различными микроорганизмами. Кроме того, частое пассирование микропобегов стимулирует активное деление клеток, что может способствовать возникновению сомаклональных вариантов. Для увеличения интервала между пассажами используют различные методы и приемы, основанные на замедлении роста пробирочных растений.

Известен способ, в котором замедление роста культур осуществляется снижением температуры культивирования. (Хранение коллекции винограда in vitro при пониженной температуре. Н.П. Дорошенко и др. Виноград и вино России, 1994, N 3, с. 24).

Недостатком способа является то, что для его осуществления необходимы холодильные камеры и большие затраты электроэнергии на их круглосуточную работу.

Известен способ депонирования растений винограда «Способ длительного сохранения in vitro растений винограда» (патент RU №2110172). Ограничение роста растений достигают за счет питательной среды, в состав которой вводят тонкоизмельченные семена винограда в таком количестве, что они являются естественными ингибиторами роста.

Недостаток этого способа заключается в том, что суммарное количество ингибиторов (абсцизовой и хлорогеновой кислот, фенолов, рутина, свободных ауксиов и цитохининов) колеблется в зависимости от сортовых особенностей, времени сбора и продолжительности срока хранения семян. Для уточнения концентраций добавляемых семян и увеличения сроков беспересадочного хранения растений необходимо предварительное проведение большого количества сложных анализов.

Известен способ длительного хранения in vitro растений осины (патент RU 2522823). Повышение сохранности микрорастений осины достигалось в условиях in vitro при хранении при +4°С, использовании оптимальных концентраций минеральных и органических компонентов питательной среды, и изменения режима освещения (длительность и интенсивность).

Предложен довольно сложный и затратный способ хранения, включающий пониженную положительную температуру, применение осмотиков, изменение режима освещенности. Показана 100,0% сохранность растений, но не приведены данные о состоянии растений после длительного хранения растений в течение одного года.

Для деконтаминации питательной среды применяют антибиотики из группы аминогликозидов с широким спектром действия. Их недостаток - высокая токсичность. Следовательно, надо подобрать оптимальную концентрацию, чтобы элиминировать бактерии, не повреждая растения. При проведении антибактериальной хемотерапии с применением антибиотиков отмечается замедление роста растений, что позволяет использовать антибиотики для «минимализации роста» при создании коллекции генофонда винограда in vitro.

Однако, все рассмотренные способы хранения in vitro растений, обладают сложным технологическим процессом, требуют значительных энергозатрат и не обеспечивают защиты от микоплазменной инфекции, что сокращает продолжительность беспересадочного хранения.

Задачей данного изобретения является, разработка способа длительного беспересадочного хранения in vitro редких и ценных сортов винограда при создании генетического банка стерильных культур, позволяющего продлить срок беспересадочного хранения, при снижении энергозатрат и упрощении технологического процесса за счет защиты от бактериальной инфекции и замедления ростовых процессов растений.

Поставленная цель достигается тем, что в способе длительного беспересадочного хранения растений винограда в культуре in vitro, включающем микрочеренкование пробирочных растений с 8÷10 междоузлиями на фрагменты длиной 10÷12 мм с глазком и листом, посадку и их культивирование осуществляют на твердой питательной среде Мурасиге и Скуга с добавлением в ее состав антибиотика гентамицин в концентрации 0,005÷0,9 мл/л.

Преимущество данного способа заключается в том, что в результате применения гентамицина, можно решить две проблемы: оздоровление от бактериальной инфекции и замедление ростовых процессов растений с целью их более продолжительного беспересадочного хранения при снижении энергозатрат и упрощении технологического процесса.

Анализ известных способов хранения микрорастений в коллекции in vitro, проведенный по научно-технической и патентной документации, показал, что применение антибиотиков для создания коллекции растений винограда неизвестно из уровня техники, следовательно, он соответствует такому условию патентоспособности изобретения, как новизна

Новым в предложенном способе является то, что микрочеренки пробирочных растений высаживают на твердую модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга с уменьшенным содержанием макросолей, витаминов и индолилуксусной кислоты, с добавлением в состав питательной среды антибиотика гентамицин широкого спектра действия, относящегося к группе аминогликозидов, в концентрации 0,005 - 0,9 мл/л.

Гентамицин быстро проникает сквозь клеточную мембрану микроорганизмов, успешно соединяется с субъединицей рибосом клеток микроорганизмов, что блокирует синтез белка, препятствуя образованию комплекса транспортной и информационной РНК, при этом происходит ошибочное считывание РНК и образование нефункциональных белков. Гентамицин обладает бактерицидным действием - в больших концентрациях снижает барьерные функции цитоплазматических мембран, вызывает гибель микроорганизмов и оказывает антисептическое влияние по отношению большинства грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе на мутированных микробов, приспособившихся к другим антибиотикам.

Способ осуществляется следующим образом.

Отбирают растения винограда, регенерированные из апикальных меристем размером 0,1÷0,2 мм и размноженные в культуре in vitro. Растения должны иметь 8÷10 междоузлий. Затем приступают к приготовлению твердой питательной среды Мурасиге и Скуга следующего состава, мг/л: макро-элементы-аммоний азотнокислый-NH₄NO₃-138, калий азотнокислый-KNO₃-950, -магний сернокислотный -MgSO₄7H₂O-185, калий фосфорнокислый однозамещенный-KH₂PO₄ -68, кальций хлористый 2-водный-CaCl₂ 2H₂O-296; микроэлементы-борная кислота-H₃BO₃-6.2, марганец сернокислый 4-водный -MnSO₄4H₂O-22.3; медь сернокислая 5-водная-CuSO₄ 5Н₂-0.025, кобальт хлористый 6-водный-CoCl₂ 6H₂O-0.025; цинк сернокислый 4-водный-ZnSO₄4H₂O-8.6, натрий молибденовокислый 2-водный-Na₂MoO₄ 2H₂O-0.25, калий иодистый-KJ-0.86, хелат железа: железо сернокислое 7-водное-FeSO₄ 7Н₂O-27.8, трилон-Б-Na₂ЭДТА-37.3; витамины-мезоинозит-50, тиамин HCl-0,2; ИУК-0,1-3 мг/л; рН среды перед автоклавированием 5,7-5,9.

Гентамицин добавляют в твердую питательную среду после автоклави-рования. В боксе после остывания до +55°С ее разливают в стерильные пробирки.

Микрочеренкование осуществляют в операционной комнате в ламинарном боксе «Фортран». Побеги, имеющие 8÷10 междоузлий, при помощи пинцета извлекают из пробирки, помещают на стерильную чашку Петри, разрезают на микрочеренки, имеющие глазок с листом. Длина микрочеренка 10÷12 мм, 2 мм над глазком остальные под глазком. Полученные микрочеренки высаживают на твердую питательную среду по одному в пробирку. Культивирование осуществляют в культуральной комнате при освещенности 2,0÷3,0 тыс.люксов, фотопериоде - 16 часов, температуре 25÷27±2°С, влажности воздуха 70÷75%.

Проведена серия опытов на различных сортах винограда при добавлении в состав питательной среды антибиотика гентамицин.

Результаты влияния на сорт Феркаль антибиотика гентамицин в концентрациях 0,1;0,3 и 0,5 мл/л в составе питательной среды на этапе микрочеренкования приведены в Табл. 1.

Во-первых, следует отметить, что гентамицин способствовал улучшению приживаемости микрочеренков и регенерации растений. Приживаемость и сохранение растений при введении его в состав питательной среды превышала эти показатели растений в контрольном варианте в 2÷3 раза.

Скорость роста растений при применении гентамицина снижалась, и ухудшались их ростовые характеристики. Эти отрицательные явления наиболее существенно проявились при концентрациях 0,3÷0,5 мл/л. При концентрации 0,1 мл/л, несмотря на замедление роста, происходило удовлетворительное развитие как ризогенной зоны, так и побега, растения имели здоровый вид.

Результаты влияния на сорт Феркаль антибиотика гентамицин в концентрациях 0,05; 0,1; 0,2 и 0,3 мл/л в составе питательной среды на этапе микрочеренкования приведены в Табл. 2.

Также подтвердилось положительное влияние гентамицина на оздоровление от микозов, что способствовало повышению приживаемости микрочеренков и развитию их в растения. Через 45 дней культивирования приживаемость в контрольном варианте составила 40,5%, а при введении в состав питательной среды гентамицина 95,0÷97,6%. Как и в первом опыте проявилось токсическое влияние антибиотика на образование и рост корней, рост побегов и образование, и рост листьев. Менее всего пострадали от гентамицина растения при минимальной концентрации 0,05 мл/л. При продолжительном культивировании они незначительно отличались по размерным характеристикам от контрольных растений, но имели более здоровый, жизнеспособный вид.

Динамика состояния растений аборигенных сортов винограда при хранении в коллекции in vitro на питательной среде с гентамицином приведены в Табл. 3.

Как видно из приведенных данных продолжительность хранения растений сорта Красностоп золотовский без пересадок составила 4÷11 месяцев. В начале хранения увеличивалась высота растений, происходило образование новых листьев, а затем происходило постепенное их усыхание, усыхание побегов, снижение коэффициента жизнеспособности и гибель растений. Однако отдельные растения сохраняли жизнеспособность длительное время. Лучшие показатели отмечены у растений при хранении их в течение 4÷6 месяцев, коэффициент жизнеспособности в это время равнялся 2,5÷2,8 баллов. После 7-ми месяцев жизнеспособность снижалась до 1,3÷1,8 баллов. После 10÷11 месяцев оставались жизнеспособными единичные экземпляры.

При депонировании сорта Цимлянский черный (клон 1-3-13-2-3) выявлена возможность беспересадочного хранения растений в течение 10÷14 месяцев при удовлетворительном коэффициенте жизнеспособности. При этом сохраняется достаточное количество растений и зеленых листьев, благодаря чему можно провести регенерацию растений и их дальнейшее микроразмножение.

Для растений сорта Сыпун черный характерен интенсивный рост. В течение первых 3÷4 месяцев хранения наблюдается торможение роста, высокая жизнеспособность растений. После 8-ми месяцев культивирования происходит интенсивный рост растений, высыхание питательной среды и, как следствие, высыхание растений. Но, тем не менее, отдельные экземпляры сохраняются в жизнеспособном состоянии более одного года.

При продолжительности хранения растений сорт Каберне Совиньон в течение 15 месяцев на питательной среде с гентамицином сохранилось единичные растения: 2 в варианте с содержанием гентамицина 0,005 мл/л и 1 растение в варианте с концентрацией 0, 01.мл/л.

Продолжительность хранения растений сорта Золотинка на питательной среде с гентамицином составила 13 месяцев. В контроле (без ГМ) сохранилось 1 растение, при концентрации ГМ 0,03 мл/л - 6 растений, при концентрации 0,05 мл/ л - 9 растений.

Последействие длительного хранения растений на питательной среде с различными концентрациями гентамицина на примере сорта Каберне Совиньон представлено в Табл. 4.

Установлено, что продолжительное культивирование на питательной среде с гентамицином не оказывает отрицательного влияния на последующую регенерацию растений и интенсивность у них ростовых процессов. При этом выявлена возможность хранения растений без пересадок в течение 8-12 месяцев. Несмотря на ослабление растений в процессе хранения, пожелтение листьев, их увядание установлено, что они сохранили жизнеспособность и обеспечили при пересадке хорошую регенерационную способность. Помимо этого, отмечено улучшение показателей развития растений в вариантах с антибиотиком. На 75-й день культивирования растения в вариантах с гентамицином превосходили контрольные растения по длине корней и ризогенной зоны, по высоте растений и облиственности.