Способ изготовления вакцины, ассоциированной против эшерихиоза, стрептококкоза и псевдомоноза крупного рогатого скота

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности, к микробиологии и может быть использовано в научно-исследовательских и производственных учреждениях, занимающихся разработкой и конструированием вакцинных препаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известен аналоговый способ изготовления вакцины, ассоциированной против эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота (патент РФ на изобретение №2538158 от 30.12.2013, МКИ А61/К 39/116, 39/108), включающем раздельное получение антигенов с последующим их смешиванием, внесение адъюванта, согласно изобретению проводят отбор патологического материала от больного и павшего крупного рогатого скота из местного эпизоотического очага, затем из отобранного патологического материала приготавливают суспензию и далее делают посев на дифференциально-диагностические среды, после чего выделяют клетки чистых культур возбудителей эшерихиоза Escherichia coli, стрептококкоза Streptococcus pneumoniae и стафилококкоза Staphylococcus aureus, затем раздельно выращивают клетки чистых культур возбудителей эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза в мясо - пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, после этого раздельно инактивируют клетки чистых культур возбудителей эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза формалином до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации при температуре 37°С в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании, потом смешивают клетки чистых культур возбудителей эшерихиоза Escherichia coli, стрептококкоза Streptococcus pneumoniae и стафилококкоза Staphylococcus aureus в равных соотношениях, затем в смесь инактивированных клеток чистых культур вносят адъювант, качестве которого используют гидроокись алюминия в количестве 20% к объему, а перед фасовкой тщательно перемешивают конечный продукт.

Техническим результатом изобретения является получение безвредной, специфичной, высокоиммуногенной ассоциированной вакцины для защиты крупного рогатого скота против эшерихиоза, стрептококкоза и псевдомоноза, путем введения новых возбудителей, компонентов, исключая отрицательное и побочное влияние.

Способ изготовления вакцины, ассоциированной против эшерихиоза, стрептококкоза и псевмоноза крупного рогатого скота, включающий получение антигенов в виде суспензий приготовленных из проб патологического материала взятых от больного и павшего крупного рогатого скота из местного эпизоотического очага, посев на дифференциально-диагностические среды, выделение клеток чистых культур возбудителей эшерихиоза Escherichia coli, стрептококкоза Streptococcus, с раздельным их выращиванием в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, раздельную инактивацию клеток чистых культур возбудителей эшерихиоза Escherichia coli, стрептококкоза Streptococcus формалином до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации при температуре 37°С в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании, смешивание их в равных соотношениях, внесение в смесь инактивированных клеток чистых культур адъюванта, в качестве которого используют гидроокись алюминия в количестве 20% к объему, тщательное смешивание и повторное тщательное смешивание, перед фасовкой конечного продукта отличающийся тем, что дополнительно выделяют клетки чистой культуры возбудителей псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa и стрептококкоза Streptococcus gallolyicus, которые раздельно выращивают в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, проводят их раздельную инактивацию формалином до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации при температуре 37°С в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании и смешивают клетки чистых культур возбудителей эшерихиоза Escherichia coli, псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa и стрептококкоза Streptococcus gallolyicus в равных соотношениях.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в отличие от известных способов, проводят отбор патологического материала от больного и павшего крупного рогатого скота из местного эпизоотического при эшерихиозе, стрептококкозе и псевдомоноза, из которого приготавливают суспензию, выделяют клетки чистых культур возбудителей посевом на дифференциально-диагностические среды, раздельно выращивают клетки чистых культур возбудителей эшерихиоза Escherichia coli, стрептококкоза Streptococcus pneumoniae и псевдомоны Pseudomonas aeruginosa и получают концентрацию микробных клеток не менее 4-5 млрд в 1 см3, инактивируют формалином и смешивают инактивированные клетки чистых культур в равных соотношениях, что позволяет полностью подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность против эшерихиоза, стрептококкоза и псевдомоноза.

По данным патентной и научно - технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Что касается критерия «промышленная применимость», то компоненты входящие в состав вакцины известны и широко применяются в ветеринарной практике при изготовлении инактивированных вакцин: инструкция по изготовлению и контролю формолвакцины поливалентной гидроокисьалюминиевой против колибактериоза (эшерихиоза) поросят, телят и ягнят, утвержденная ГУВ МСХ СССР 26.04.1984 г.; ассоциированная вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и энтерококковой инфекции поросят ТУ 10.09-62-90, утверждено 01.08.90 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины утверждена Главным управлением ветеринарии 16.07.90 г. представлены все необходимые сведения о микроорганизмах.

Методы выделения чистой культуры возбудителя эшерихиоза и характеристика описаны в «Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных», утвержденных 27.07.2000 г. №13-7-2/2117, Департаментом ветеринарии МСХ РФ, описана характеристика эшерихий в справочнике «Определитель зоопатогенных микроорганизмов» под редакцией профессора Сидорова М.А., Москва- Колос, 1995, стр. 196-201, а также в «Практикуме по ветеринарной микробиологии и иммунологии» авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И., М.: «Колос», 2001, на стр. 219-222.

Методы выделения и характеристика стрептококков представлены в «Методических указаниях по лабораторной диагностике стрептококкоза животных», утвержденных 25.09.1990 г., Главным управлением ветеринарии с государственной инспекцией при Государственной комиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам, а также в справочнике «Определитель зоопатогенных микроорганизмов» под редакцией профессора Сидорова М.А., Москва. - Колос, 1995, стр. 90-95; в справочнике «Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных» авторы: Скородумов Д.И., Субботин В.В., Сидоров М.А., Костенко Т.С., М.: «ИзограФъ», 2005, на стр. 249-257.

Методы выделения и характеристика микроорганизмов рода Pseudomonas описаны в «Практикуме по ветеринарной микробиологии и иммунологии» авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И., М.: «Колос», 2001, на стр. 259-261; в справочнике «Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных» авторы: Скородумов Д.И., Субботин В.В., Сидоров М.А., Костенко Т.С., М.: «ИзограФъ», 2005, на стр. 522-525.

Пример конкретного осуществления способа изготовления вакцины.

Для изготовления вакцины ассоциированной против эшерихиоза, стрептококкоза и псевдомоноза крупного рогатого скота проводят отбор пораженных органов от больных и павших животных в период заболевания их эшерихиозом, стрептококкозом и псевдомонозом, из которых приготавливают суспензию и проводят лабораторные исследования с целью выделения чистых культур возбудителей.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя эшерихиоза готовят мазки - отпечатки из пораженных органов павших нутрий, путем прикосновения обезжиренным стеклом к свежему разрезу пораженной ткани и последующей фиксацией над пламенем спиртовки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают толстые палочки с закругленными концами красного цвета, расположенные одиночно, что характерно для E.coli.

Для определения культуральных свойств возбудителя эшерихиоза Е. coli делают посевы выделенной культуры из патологического материала в мясо - пептонный бульон (МПБ), на среду Эндо, на мясо - пептонный агар (МПА) и инкубируют в термостате при 37°С в течение 16-24 часов. На чашках Петри с МПА выростают влажные колонии с ровными краями и гладкой поверхностью серого цвета. В пробирках с МПБ наблюдали равномерное помутнение питательной среды с небольшим осадком, разбивающимся при встряхивании. В чашках Петри, на среде Эндо наблюдают рост колоний малиново-красного цвета с розовым ободкам диаметром 2-3 мм, характерные для Е. coli.

При определении биохимической активности чистых баккультур проводят посевы на дифференциально - диагностические среды с различным набором компонентов. Для Е. coli характерно расщепление глюкозы и лактозы с образованием кислоты и газа, выделение индола, отсутствие уреазы.

Патогенность чистых выделенных культур определяют путем внутрибрюшинного заражения белых мышей массой 14-18 г. Через 2-4 суток наблюдения все зараженные лабораторные животные погибают при 100% сохранности в контроле. Для подтверждения специфичности гибели мышей из паренхиматозных органов павших мышей приготавливают мазки - отпечатки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании под иммерсионной системой микроскопа в препаратах видны толстые палочки с закругленными концами красного цвета, расположенные одиночно, характерные для Е. coli. Серологическую типизацию кишечной палочки проводят в реакции агглютинации с набором типоспецифических сывороток по общепринятой методике в пробирках.

В реакции агглютинации исследуемая культура кишечной палочки реагирует с колисывороткой и виден хлопьевидный осадок (положительный результат) при отрицательном контроле.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя стрептококкоза готовят мазки - отпечатки из пораженных органов павших нутрий, путем прикосновения обезжиренным стеклом к свежему разрезу пораженной ткани и последующей фиксацией над пламенем спиртовки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопии препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают мелкие кокки в виде цепочек, окрашенные в фиолетовый цвет, характерные для рода Streptococcus. Для определения культуральных свойств возбудителя делают посевы выделенной культуры из патматериала в мясо-пептонный бульон с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 10% инактивированной сыворотки лошади (МПБ), в чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА) с добавлением с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 5% дефибринированной крови кролика. Через 18-20 часов инкубирования в термостате при температуре 37°С наблюдают в МПБ рост в виде диффузного помутнения среды. В чашках Петри с кровяным МПА наблюдают рост мелких росинчатых, слегка мутноватых с ровными краями колоний, окруженных зеленоватой зоной гемолиза, что характерно для Streptococcus galloliticus.

Для дифференциации стрептококков от стафилококков используют каталазную пробу. При постановке каталазной пробы на предметное стекло наносят каплю свежеприготовленного 3%-ного раствора перекиси водорода. Бактериологической петлей снимают одну колонию исследуемой культуры и растирают ее в капле перекиси водорода. Стафилококки, в отличие от стрептококков, образуют каталазу и вызывают пенообразование. Для предварительной идентификации стрептококков и энтерококков баккультуру высевают в пробирки с 10%, 40% желчи, с 6,5% хлористого натрия, с углеводами (раффинозой, сорбитом, маннитом), учитывают рост в жидкой среде и гемолиз на МПА с кровью.

В результате в пробирках с желчью наблюдают диффузный рост баккультры, отмечают ферментацию маннита. На МПА с кровью наблюдают неполный гемолиз эритроцитов с образованием вокруг колоний зеленоватой зоны, что характерно для стрептококков группы D.

Для установления серогрупповой принадлежности стрептококков используют стрептококковые групповые преципитирующие сыворотки. Серо-групповую принадлежность стрептококков определяют в реакции преципитации (РП) в капиллярах. Патогенность подтверждают биопробой на молодых белых мышках.

Выращивание чистой культуры возбудителя проводят в мясопептонном бульоне. Для заражения берут 1-2 см³ культуру Streptococcus galloliticus и засевают 80-100 мл жидкой питательной среды и выращивают при 37°С в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту мутности и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 4-5 млрд. в 1 см³.

Для определения хморфологии и тинкториальных свойств возбудителя псевдомоноза готовят мазки-отпечатки из пораженных органов павших животных, окрашивают их по методу Грама. При микроскопии препаратов под иммерсионной системой микроскопа видны прямые или изогнутые палочки размером 1,5-3,0 мкм, располагающиеся одиночно, парами, в виде цепочек, окрашенные в розовый цвет, характерные для Ps. aeruginosa.

Для определения культуральных свойств возбудителя псевдомоноза делают посевы выделенной культуры из патматериала в мясо - пептонный бульон, в чашки Петри с мясо - пептонным агаром (МПА), кровяной МПА и селективную среду, содержащую цетилтриметил аммония бромид, на которой другие псевдомонады не растут.

Через 24 часа инкубирования в термостате при температуре 37°С наблюдают поверхностную серебристо-белую пленку в МПБ, характерный признак и помутнение среды. В чашках Петри с кровяным МПА наблюдают рост сероватых, полупрозрачных колоний, окруженных зеленоватой зоной гемолиза, что характерно для Pseudomonas aeruginosa.

Выделенные таким образом чистые культуры возбудителей колибактериоза Е. coli, стрептококкоза Streptococcus galloliticus и псевдомоноза Ps. aeruginosa используют для получения вакцины.

Выращивание чистых культур возбудителей проводят раздельно в мясо - пептонном бульоне. Для заражения берут 5 см³ свежей чистой культуры возбудителей колибактериоза Е. coli, стрептококкоза Streptococcus galloliticus и псевдомоноза Ps. aeruginosa на 1000 см³ мясо - пептонной питательной среды с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации и выращивают при 37°С в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту мутности и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 4-5 млрд. в 1 см³. Инактивацию полученного баксырья проводят внесением формалина 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании.

Таким образом, использование для изготовления вакцины ассоциированной против эшерихиоза, стрептококкоза и псевдомоноза чистых культур возбудителей Е. coli, Str. galloliticus и Ps. aeruginosa, выделенных из местного эпизоотического очага, позволяет получать специфичную, высокоиммуногенную ассоциированную вакцину для защиты от этих трех опасных инфекционных болезней эшерихиоза, стрептококкоза и псевдомоноза крупного рогатого скота. Раздельное выращивание возбудителей позволяет получать концентрацию Е. coli, Str. galloliticus и Ps. aeruginosa не менее 4 млрд. в 1 см³ в течение 12-14 часов инкубирования. Использование формалина для инактивации в 0,1-0,4% ной конечной концентрации позволяет в течение 48-96 часов при температуре 37°С подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность в течение 12 месяцев хранения. Вакцина, полученная заявляемым способом, прошла апробацию. Кроликам вводили однократно в дозе 1 см³ полученную ассоциированную вакцину, и через 12-15 суток у привитых животных обеспечивается формирование напряженного иммунитета против эшерихиоза, стрептококкоза и псевдомоноза крупного рогатого скота, продолжительностью не менее 9 месяцев (срок наблюдения). После однократного введения животным внутримышечно не вызывает у них поствакцинальных осложнений.

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.