ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛИОБЛАСТОМЫ

Область техники

Настоящее изобретение относится к способам выявления пациентов, имеющих глиобластому, которые получат пользу от лечения антагонистом VEGF (фактора роста эндотелия сосудов), например, антителом против VEGF.

Уровень техники

Глиомы составляют 81% всех злокачественных опухолей головного мозга и центральной нервной системы. В частности, на глиобластому (мультиформную глиобластому (МГБ); астроцитому IV степени согласно классификации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ)) приходится 60%-70% злокачественных глиом, и глиобластома остается наиболее агрессивным подтипом глиомы. Глиобластома возникает, главным образом, у взрослых (средний возраст на момент постановки диагноза: 64 года), и в США частота возникновения данной опухоли, согласно оценкам, составляет 3,05/100000. При общей выживаемости в течение 1 года и 5 лет, составляющем 29% и 3%, соответственно, прогноз при глиобластоме остается чрезвычайно неблагоприятным (Central Brain Tumor Registry of the United States (2005) (CBTRUS; http://www.cbtrus.org)).

Измерение уровней экспрессии биомаркеров может стать эффективным средством выявления пациентов, имеющих глиобластому, которые будут отвечать на конкретные варианты терапии, в том числе, например, на лечение антагонистами VEGF, такими как антитела против VEGF.

Существует потребность в эффективных средствах определения того, какие из пациентов, имеющих глиобластому, будут отвечать на определенное лечение, и во включении такого определения в эффективные схемы лечения пациентов вариантами терапии на основе антагониста VEGF, будь то применение при монотерапии или в комбинации с другими средствами.

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении предложены способы выявления пациентов, имеющих глиобластому, которые будут с большой вероятностью отвечать на лечение антагонистом VEGF (например, антителом против VEGF, например, бевацизумабом). Данных пациентов выявляют на основании уровня экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 ниже.

Согласно первому аспекту в настоящем изобретении предложены способы определения того, будет ли пациент, имеющий глиобластому, с большой вероятностью отвечать на лечение антагонистом VEGF, причем указанные способы включают: (а) обнаружение экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в биологическом образце, полученном от пациента, до введения указанному пациенту антагониста VEGF; (b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере одного гена, причем изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце, полученном от пациента, относительно эталонного уровня позволяет выявить пациента, который с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF; и (с) информирование пациента о том, что у него присутствует увеличенная вероятность реакции на лечение антагонистом VEGF.

Согласно второму аспекту в настоящем изобретении также предложены способы оптимизации эффективности противораковой терапии у пациента, имеющего глиобластому, причем указанные способы включают: (а) обнаружение экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в биологическом образце, полученном от пациента, до введения указанному пациенту антагониста VEGF; (b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере одного гена, причем изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце, полученном от пациента, относительно эталонного уровня позволяет выявить пациента, который с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF; и (с) предоставление указанному пациенту рекомендации о включении в противораковую терапию антагониста VEGF.

Согласно способам, описанным выше, пациент может принадлежать к популяции пациентов, имеющих глиобластому и проходящих анализ для определения восприимчивости к антагонисту VEGF, и эталонный уровень может представлять собой медианный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена в популяции пациентов. Согласно другим вариантам реализации данных способов эталонный уровень может представлять собой медианный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена у пациентов, имеющих глиобластому, которые, как было установлено, не отвечают на лечение антагонистом VEGF.

Согласно способам, описанным выше, изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце, полученном от пациента, может представлять собой увеличение или уменьшение относительно эталонного уровня.

Экспрессию по меньшей мере одного гена в биологическом образце, полученном от пациента, можно обнаружить посредством измерения, например, уровней мРНК и/или уровней белка в плазме.

Биологический образец может представлять собой, например, ткань опухоли, такую как биопсия ткани опухоли, или образец плазмы крови.

Данные способы согласно настоящему изобретению также могут включать обнаружение экспрессии по меньшей мере двух, трех, четырех или более генов в биологическом образце, полученном от пациента. Согласно некоторым вариантам реализации способы согласно настоящему изобретению также могут включать обнаружение экспрессии по меньшей мере четверти или по меньшей мере трети генов в биологическом образце, полученном от пациента.

Согласно способам, описанным выше, антагонист VEGF может представлять собой антитело против VEGF. Антитело против VEGF может представлять собой, например, антитело против VEGF, которое связывается с эпитопом А4.6.1, бевацизумаб, или антитело против VEGF, которое содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), причем указанная VH имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и указанная VL имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

Способы, описанные выше, также могут включать этап введения пациенту антагониста VEGF. Вводимый антагонист VEGF может представлять собой антитело против VEGF, например, антитело против VEGF, которое связывается с эпитопом А4.6.1, бевацизумаб, или антитело против VEGF, которое содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), причем VH имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и VL имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

Способы, описанные выше, дополнительно могут включать осуществление терапии с применением (i) средства, которое выбрано из группы, включающей противоопухолевое средство, химиотерапевтическое средство, средство, ингибирующее рост, и цитотоксическое средство, (ii) лучевой терапии или (iii) их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации способы, описанные выше, также могут включать введение пациенту химиотерапевтического средства, такого как темозоломид (ТМЗ).

Согласно способам, описанным выше, восприимчивость к лечению антагонистом VEGF может представлять собой, например, увеличение или продление общей выживаемости (ОВ). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения восприимчивость к лечению антагонистом VEGF может представлять собой, например, увеличение или продление выживаемости без прогрессирования заболевания (ВБПЗ).

Согласно способам, описанным выше, пациент, который, как было обнаружено с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF, может иметь, например, глиобластому пронейрального (ПН) типа (пронейрального подтипа).

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение включает способы выбора терапии для пациента, имеющего глиобластому, причем указанный способ включает: (а) обнаружение экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в биологическом образце, полученном от пациента, до какого-либо введения указанному пациенту антагониста VEGF; (b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере одного гена, причем изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце, полученном от пациента, относительно эталонного уровня позволяет выявить пациента, который с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF; и (с) выбор терапии, включающей антагонист VEGF, если было обнаружено, что пациент с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF, и необязательно предоставление указанному пациенту рекомендации относительно выбранной терапии, включающей антагонист VEGF.

Согласно данным способам эталонный уровень может представлять собой медианный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена в популяции пациентов, имеющих глиобластому. Согласно некоторым вариантам реализации данных способов эталонный уровень может представлять собой медианный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена у пациентов, имеющих глиобластому, которые, как было установлено, не отвечают на лечение антагонистом VEGF.

Согласно данным способам изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце, полученном от пациента, может представлять собой увеличение или уменьшение относительно эталонного уровня. Экспрессию по меньшей мере одного гена в биологическом образце, полученном от пациента, можно обнаружить посредством измерения, например, уровней мРНК и/или уровней белка в плазме. Биологический образец может представлять собой, например, ткань опухоли, такую как биопсия ткани опухоли, или образец плазмы крови.

Данные способы согласно настоящему изобретению также могут включать обнаружение экспрессии по меньшей мере двух, трех, четырех или более генов в биологическом образце, полученном от пациента. Согласно некоторым вариантам реализации данные способы также включают обнаружение экспрессии по меньшей мере четверти или по меньшей мере трети генов в биологическом образце, полученном от пациента.

Согласно данным способам терапия согласно этапу (с) может представлять собой средство, которое выбрано из группы, включающей противоопухолевое средство, химиотерапевтическое средство, средство, ингибирующее рост, и цитотоксическое средство, лучевую терапию или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данные способы также включают введение пациенту химиотерапевтического средства, такого как ТМЗ.

Данные способы также могут включать этап (d): введение пациенту эффективного количества антагониста VEGF, если было обнаружено, что указанный пациент с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF. Вводимый антагонист VEGF может представлять собой антитело против VEGF, например, антитело против VEGF, которое связывается с эпитопом А4.6.1, бевацизумаб, или антитело против VEGF, которое содержит VH и VL, причем VH имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и VL имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанные способы также включают введение эффективного количества по меньшей мере второго средства. Второе средство может быть, например, выбрано из группы, включающей: противоопухолевое средство, химиотерапевтическое средство, средство, ингибирующее рост, цитотоксическое средство и их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второе средство представляет собой ТМЗ.

Согласно данным способам восприимчивость к лечению антагонистом VEGF может представлять собой, например, увеличение или продление ОВ. Согласно некоторым вариантам реализации данных способов восприимчивость к лечению антагонистом VEGF может представлять собой, например, увеличение или продление ВБПЗ.

Согласно данным способам пациент, который, как было обнаружено с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF, может иметь, например, глиобластому ПН типа (ПН подтипа).

Согласно любому из способов первого, второго и третьего аспектов настоящего изобретения по меньшей мере один ген может быть выбран из группы, включающей NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2. Когда по меньшей мере один ген выбран из группы, включающей NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2, изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце, полученном от пациента, может представлять собой увеличение относительно эталонного уровня.

Согласно четвертому аспекту в настоящем изобретении предложены способы определения того, будет ли пациент, имеющий глиобластому с большой вероятностью отвечать на лечение антагонистом VEGF, причем указанные способы включают: (а) обнаружение экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в биологическом образце, полученном от пациента, до введения указанному пациенту антагониста VEGF, причем по меньшей мере один ген выбран из группы, включающей NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2; (b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере одного гена, причем увеличение уровня экспрессии NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и/или PFN2 в образце, полученном от пациента, относительно эталонного уровня позволяет выявить пациента, который с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF; и (с) информирование пациента о том, что у него присутствует увеличенная вероятность реакции на лечение антагонистом VEGF.

Согласно пятому аспекту в настоящем изобретении предложены способы оптимизации терапевтической эффективности противораковой терапии пациента, имеющего глиобластому, причем указанные способы включают: (а) обнаружение экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в биологическом образце, полученном от пациента, до введения указанному пациенту антагониста VEGF, причем по меньшей мере один ген выбран из группы, включающей NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2; (b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере одного гена, причем увеличение уровня экспрессии NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и/или PFN2 в образце, полученном от пациента, относительно эталонного уровня позволяет выявить пациента, который с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF; и (с) предоставление указанному пациенту рекомендации о включении в противораковую терапию антагониста VEGF.

Согласно шестому аспекту настоящее изобретение включает способы выбора терапии для пациента, имеющего глиобластому, причем указанный способ включает: (а) обнаружение экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в биологическом образце, полученном от пациента, до введения указанному пациенту антагониста VEGF, причем по меньшей мере один ген выбран из группы, включающей NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2; (b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере одного гена, причем увеличение уровня экспрессии NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и/или PFN2 в образце, полученном от пациента, относительно эталонного уровня позволяет выявить пациента, который с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF; и (с) выбор терапии, включающей антагонист VEGF, если было обнаружено, что пациент с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF, и необязательно предоставление пациенту рекомендации относительно выбранной терапии, включающей антагонист VEGF.

Согласно любому способу из четвертого, пятого и шестого аспектов настоящего изобретения пациент может принадлежать к популяции пациентов, имеющих глиобластому и проходящих анализ для определения восприимчивости к антагонисту VEGF, и эталонный уровень может представлять собой медианный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена в популяции пациентов. Согласно другим вариантам реализации данных способов эталонный уровень может представлять собой медианный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена у пациентов, имеющих глиобластому, которые, как было установлено, не отвечают на лечение антагонистом VEGF.

Согласно седьмому аспекту в настоящем изобретении предложены способы определения того, будет ли пациент, имеющий глиобластому с большой вероятностью отвечать на лечение антагонистом VEGF, причем указанные способы включают: (а) обнаружение экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в биологическом образце, полученном от пациента, до введения указанному пациенту антагониста VEGF; и (b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере одного гена, причем изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце, полученном от пациента, относительно эталонного уровня позволяет выявить пациента, который с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF. Согласно некоторым вариантам реализации способы согласно седьмому аспекту настоящего изобретения также могут включать информирование пациента о том, что у него присутствует увеличенная вероятность реакции на лечение антагонистом VEGF.

Согласно восьмому аспекту в настоящем изобретении также предложены способы оптимизации эффективности противораковой терапии пациента, имеющего глиобластому, причем указанные способы включают: (а) обнаружение экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в биологическом образце, полученном от пациента, до введения указанному пациенту антагониста VEGF; и (b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере одного гена, причем изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце, полученном от пациента, относительно эталонного уровня позволяет выявить пациента, который с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF. Согласно некоторым вариантам реализации способы согласно восьмому аспекту настоящего изобретения также могут включать предоставление указанному пациенту рекомендации о включении в противораковую терапию антагониста VEGF.

Согласно некоторым вариантам реализации любого из способов согласно седьмому и восьмому аспектам настоящего изобретения пациент может принадлежать к популяции пациентов, имеющих глиобластому и проходящих анализ для определения восприимчивости к антагонисту VEGF, и эталонный уровень может представлять собой медианный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена в популяции пациентов. Согласно другим вариантам реализации данных способов эталонный уровень может представлять собой медианный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена у пациентов, имеющих глиобластому, которые, как было установлено, не отвечают на лечение антагонистом VEGF.

Согласно некоторым вариантам реализации любого из способов согласно седьмому и восьмому аспектам настоящего изобретения изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце, полученном от пациента, может представлять собой увеличение или уменьшение относительно эталонного уровня.

Согласно некоторым вариантам реализации любого из способов согласно седьмому и восьмому аспектам настоящего изобретения экспрессию по меньшей мере одного гена в биологическом образце, полученном от пациента, можно обнаружить посредством измерения, например, уровней мРНК и/или уровней белка в плазме.

Согласно некоторым вариантам реализации любого из способов согласно седьмому и восьмому аспектам настоящего изобретения биологический образец может представлять собой, например, ткань опухоли, такую как биопсия ткани опухоли, или образец плазмы крови.

Способы согласно седьмому и восьмому аспектам настоящего изобретения также могут включать обнаружение экспрессии по меньшей мере двух, трех, четырех или более генов в биологическом образце, полученном от пациента. Согласно некоторым вариантам реализации способы согласно седьмому и восьмому аспектам настоящего изобретения также могут включать обнаружение экспрессии по меньшей мере четверти или по меньшей мере трети генов в биологическом образце, полученном от пациента.

Согласно некоторым вариантам реализации любого из способов согласно седьмому и восьмому аспектам настоящего изобретения антагонист VEGF может представлять собой антитело против VEGF. Антитело против VEGF может представлять собой, например, антитело против VEGF, которое связывается с эпитопом А4.6.1, бевацизумаб, или антитело против VEGF, которое содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), причем указанная VH имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и указанная VL имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

Способы согласно седьмому и восьмому аспектам настоящего изобретения также могут включать этап введения пациенту антагониста VEGF. Вводимый антагонист VEGF может представлять собой антитело против VEGF, например, антитело против VEGF, которое связывается с эпитопом А4.6.1, бевацизумаб, или антитело против VEGF, которое содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), причем VH имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и VL имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации любой из способов согласно седьмому и восьмому аспектам настоящего изобретения также может включать осуществление терапии с применением (i) средства, которое выбрано из группы, включающей противоопухолевое средство, химиотерапевтическое средство, средство, ингибирующее рост, и цитотоксическое средство, (ii) лучевой терапии или (iii) их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации способы, описанные выше, также могут включать введение пациенту химиотерапевтического средства, такого как темозоломид (ТМЗ).

Согласно некоторым вариантам реализации любого из способов согласно седьмому и восьмому аспектам настоящего изобретения восприимчивость к лечению антагонистом VEGF может представлять собой, например, увеличение или продление общей выживаемости (ОВ). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения восприимчивость к лечению антагонистом VEGF может представлять собой, например, увеличение или продление выживаемости без прогрессирования заболевания (ВБПЗ).

Согласно некоторым вариантам реализации любого из способов согласно седьмому и восьмому аспектам настоящего изобретения пациент, который, как было обнаружено с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF, может иметь, например, от глиобластому пронейрального (ПН) типа (пронейрального подтипа).

Согласно девятому аспекту в настоящем изобретении представлены способы выбора терапии для пациента, имеющего глиобластому, причем указанный способ включает: (а) обнаружение экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в биологическом образце, полученном от пациента, до какого-либо введения указанному пациенту антагониста VEGF; и (b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере одного гена, причем изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце, полученном от пациента, относительно эталонного уровня позволяет выявить пациента, который с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF. Согласно некоторым вариантам реализации способы согласно девятому аспекту настоящего изобретения также могут включать выбор терапии, включающей антагонист VEGF, если было обнаружено, что пациент с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF, и, необязательно, предоставление указанному пациенту рекомендации относительно выбранной терапии, включающей антагонист VEGF.

Согласно некоторым вариантам реализации способов согласно девятому аспекту настоящего изобретения эталонный уровень может представлять собой медианный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена в популяции пациентов, имеющих глиобластому. Согласно некоторым вариантам реализации способов согласно девятому аспекту настоящего изобретения эталонный уровень может представлять собой медианный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена у пациентов, имеющих глиобластому, которые, как было установлено, не отвечают на лечение антагонистом VEGF.

Согласно некоторым вариантам реализации способов согласно девятому аспекту настоящего изобретения изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце, полученном от пациента, может представлять собой увеличение или уменьшение относительно эталонного уровня. Экспрессию по меньшей мере одного гена в биологическом образце, полученном от пациента, можно обнаружить посредством измерения, например, уровней мРНК и/или уровней белка в плазме. Биологический образец может представлять собой, например, ткань опухоли, такую как биопсия ткани опухоли, или образец плазмы крови.

Способы согласно девятому аспекту настоящего изобретения также могут включать обнаружение экспрессии по меньшей мере двух, трех, четырех или более генов в биологическом образце, полученном от пациента. Согласно некоторым вариантам реализации данные способы также включают обнаружение экспрессии по меньшей мере четверти или по меньшей мере трети генов в биологическом образце, полученном от пациента.

Согласно некоторым вариантам реализации способов согласно девятому аспекту настоящего изобретения терапия согласно этапу (d) может представлять собой средство, которое выбрано из группы, включающей противоопухолевое средство, химиотерапевтическое средство, средство, ингибирующее рост, и цитотоксическое средство, лучевую терапию или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам реализации данные способы также включают введение пациенту химиотерапевтического средства, такого как ТМЗ.

Способы согласно девятому аспекту настоящего изобретения также могут включать этап (е): введения пациенту эффективного количества антагониста VEGF, если было обнаружено, что указанный пациент с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF. Вводимый антагонист VEGF может представлять собой антитело против VEGF, например, антитело против VEGF, которое связывается с эпитопом А4.6.1, бевацизумаб, или антитело против VEGF, которое содержит VH и VL, причем VH имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и VL имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации способов согласно девятому аспекту настоящего изобретения указанные способы также включают введение эффективного количества по меньшей мере второго средства. Второе средство может быть, например, выбрано из группы, включающей: противоопухолевое средство, химиотерапевтическое средство, средство, ингибирующее рост, цитотоксическое средство и их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второе средство представляет собой ТМЗ.

Согласно некоторым вариантам реализации способов согласно девятому аспекту настоящего изобретения восприимчивость к лечению антагонистом VEGF может представлять собой, например, увеличение или продление ОВ. Согласно некоторым вариантам реализации данных способов восприимчивость к лечению антагонистом VEGF может представлять собой, например, увеличение или продление ВБПЗ.

Согласно некоторым вариантам реализации способов согласно девятому аспекту настоящего изобретения пациент, который, как было обнаружено с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF, может иметь, например, глиобластому ПН типа (ПН подтипа).

Согласно любому способу из седьмого, восьмого и девятого аспектов настоящего изобретения по меньшей мере один ген может быть выбран из группы, включающей NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2. Когда по меньшей мере один ген выбран из группы, включающей NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2, изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце, полученном от пациента, может представлять собой увеличение относительно эталонного уровня.

Согласно десятому аспекту в настоящем изобретении предложены способы определения того, будет ли пациент, имеющий глиобластому с большой вероятностью отвечать на лечение антагонистом VEGF, причем указанные способы включают: (а) обнаружение экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в биологическом образце, полученном от пациента, до введения указанному пациенту антагониста VEGF, причем по меньшей мере один ген выбран из группы, включающей NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2; и (b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере одного гена, причем увеличение уровня экспрессии NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и/или PFN2 в образце, полученном от пациента, относительно эталонного уровня позволяет выявить пациента, который с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF.

Согласно одиннадцатому аспекту в настоящем изобретении предложены способы оптимизации терапевтической эффективности противораковой терапии пациента, имеющего глиобластому, причем указанные способы включают: (а) обнаружение экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в биологическом образце, полученном от пациента, до введения указанному пациенту антагониста VEGF, причем по меньшей мере один ген выбран из группы, включающей NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2; и (b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере одного гена, причем увеличение уровня экспрессии NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и/или PFN2 в образце, полученном от пациента, относительно эталонного уровня позволяет выявить пациента, который с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF.

Согласно двенадцатому аспекту настоящее изобретение включает способы выбора терапии для пациента, имеющего глиобластому, причем указанный способ включает: (а) обнаружение экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в биологическом образце, полученном от пациента, до введения указанному пациенту антагониста VEGF, причем по меньшей мере один ген выбран из группы, включающей NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2; и (b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере одного гена, причем увеличение уровня экспрессии NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и/или PFN2 в образце, полученном от пациента, относительно эталонного уровня позволяет выявить пациента, который с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF.

Согласно любому способу из десятого, одиннадцатого и двенадцатого аспектов настоящего изобретения пациент может принадлежать к популяции пациентов, имеющих глиобластому и проходящих анализ для определения восприимчивости к антагонисту VEGF, и эталонный уровень может представлять собой медианный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена в популяции пациентов. Согласно другим вариантам реализации данных способов эталонный уровень может представлять собой медианный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена у пациентов, имеющих глиобластому, которые, как было установлено, не отвечают на лечение антагонистом VEGF.

Согласно тринадцатому аспекту настоящее изобретение включает антагонист VEGF для применения при оптимизации терапевтической эффективности противораковой терапии пациента, имеющего глиобластому, причем до какого-либо введения антагониста VEGF у пациента экспрессируется отличный уровень (например, увеличенный уровень или уменьшенный уровень) по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3, относительно эталонного уровня экспрессии по меньшей мере одного гена. Согласно некоторым вариантам реализации тринадцатого аспекта настоящего изобретения антагонист VEGF будет введен пациенту, у которого по меньшей мере один из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3, экспрессируется на отличном уровне (например, увеличенном уровне или уменьшенном уровне) относительно эталонного уровня экспрессии по меньшей мере одного гена.

Согласно четырнадцатому аспекту настоящее изобретение включает антагонист VEGF для применения при лечении пациента, имеющего глиобластому, причем до введения антагониста VEGF у пациента экспрессируется отличный уровень (например, увеличенный уровень или уменьшенный уровень) по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3.

Согласно пятнадцатому аспекту настоящее изобретение включает антагонист VEGF для применения при оптимизации терапевтической эффективности противораковой терапии пациента, имеющего глиобластому, причем до какого-либо введения антагониста VEGF у пациента экспрессируется увеличенный уровень по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, включающей NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2, относительно эталонного уровня экспрессии по меньшей мере одного гена. Согласно некоторым вариантам реализации пятнадцатого аспекта антагонист VEGF будет введен пациенту, по меньшей мере один ген которого, выбранный из группы, включающей NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2, экспрессируется на увеличенном уровне относительно эталонного уровня экспрессии по меньшей мере одного гена.

Согласно шестнадцатому аспекту настоящее изобретение включает антагонист VEGF для применения при лечении пациента, имеющего глиобластому, причем до введения антагониста VEGF у пациента экспрессируется увеличенный уровень по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, включающей NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2. Согласно другому аспекту в настоящем изобретении представлен набор для определения того, получит ли пациент пользу от лечения антагонистом VEGF, причем указанный набор включает: (а) полипептиды или полинуклеотиды, способные к определению уровня экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1); и (b) инструкции по применению полипептидов или полинуклеотидов для определения уровня экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3, причем изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена относительно эталонного уровня свидетельствует, что пациент получит пользу от лечения антагонистом VEGF.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет собой карту интенсивности, на которой приведены результаты независимого анализа образцов, полученных в исследовании AvaGlio, с разделением на кластеры в количестве k=3 (разделение на кластеры на основе медоида РАМ, Partitioning around medoids) согласно экспрессии расширенных 108 генов-классификаторов. Образцы, отнесенные к группе с отрицательной шириной силуэта, обозначали как «неклассифицированные». В строках аннотации указаны сигнатуры генов. В столбцах аннотации указано отнесение образцов к кластерам/подтипам экспрессии гена согласно РАМ.

Фигура 2 представляет собой кривую выживаемости Каплан-Мейера для пациентов, которых отнесли к Пронейральному (ПН) подтипу с применением независимого анализа (РАМ), в двух группах лечения AvaGlio (группа лечения бевацизумабом: пунктирная линия; группа лечения плацебо: сплошная линия). Количество пациентов, подверженных риску, указано под графиком для групп лечения бевацизумабом (верхняя строка) и плацебо (нижняя строка).

На фигуре 3 представлены сжатые центроиды, полученные с применением алгоритма PAMR (величина порога = 4). Показатели относительно генов представлены для не-ПН и ПН центроидов. Линии, направленные влево и вправо, отмечают отрицательные и положительные показатели генов, соответственно. Длина линии указывает на магнитуду веса гена, вносимого каждым в центроидом.

Фигура 4 представляет собой кривую выживаемости Каплан-Мейера для пациентов, которых отнесли к Пронейральному (ПН) подтипу с применением классификации на основании сжатого центроида (PAMR), в двух группах лечения AvaGlio (группа лечения бевацизумабом: пунктирная линия; группа лечения плацебо: сплошная линия). Количество пациентов, подверженных риску, указано под графиком для групп лечения бевацизумабом (верхняя строка) и плацебо (нижняя строка).

Фигура 5 представляет собой коробчатую диаграмму, на которой продемонстрированы результаты распределения непрерывного Пронейрального показателя среди подтипов, определенных в ходе независимого анализа (РАМ). Пронейральный показатель рассчитывали в виде среднего z-показателя среди следующих десяти генов для каждого пациента: NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2.

Фигура 6А представляет собой кривую выживаемости Каплан-Мейера для пациентов в двух группах лечения AvaGlio (группа лечения бевацизумабом: пунктирная линия; группа лечения плацебо: сплошная линия), которых отнесли к подгруппе «с высоким уровнем биомаркера» на основании разделения непрерывного Пронейрального показателя по медиане. Количество пациентов, подверженных риску, указано под графиком для групп лечения бевацизумабом (верхняя строка) и плацебо (нижняя строка).

Фигура 6В представляет собой кривую выживаемости Каплан-Мейера для пациентов в двух группах лечения AvaGlio (группа лечения бевацизумабом: пунктирная линия; группа лечения плацебо: сплошная линия), которых отнесли к подгруппе «с низким уровнем биомаркера» на основании разделения непрерывного Пронейрального показателя по медиане. Количество пациентов, подверженных риску, указано под графиком для групп лечения бевацизумабом (верхняя строка) и плацебо (нижняя строка).

Подробное описание вариантов реализации настоящего изобретения

I. Введение

В настоящем изобретении предложены способы и композиции для мониторинга и/или выявления пациентов, имеющих глиобластому, которые являются чувствительными или восприимчивыми к лечению антагонистами VEGF, например, антителом против VEGF. В основе настоящего изобретения лежит обнаружение того, что определение уровней экспрессии по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3, до лечения антагонистом VEGF (таким как антитело против VEGF) является пригодным для выявления пациентов, чувствительных или восприимчивых к лечению антагонистом VEGF, например, антителом против VEGF. Затем для указанных пациентов можно необязательно выбрать терапию антагонистом VEGF и, в дальнейшем, указанным пациентам можно необязательно вводить терапию антагонистом VEGF.

II. Определения

«Антиангиогенное средство» или «ингибитор ангиогенеза» означает низкомолекулярное вещество, полинуклеотид, полипептид, выделенный белок, рекомбинантный белок, антитело или конъюгаты или слитые белки на основе указанных средств, напрямую или опосредованно ингибирующие ангиогенез, васкулогенез или нежелательную проницаемость сосудов. Следует учитывать, что антиангиогенное средство включает средства, которые связываются и блокируют ангиогенную активность ангиогенного фактора или его рецептора. Например, антиангиогенное средство представляет собой антитело или другой антагонист ангиогенного средства, определенный где-либо в настоящей заявке или известный в данной области техники, например, но не ограничиваясь ими, антитела против VEGF-A или против рецептора VEGF-А (например, рецептора KDR или рецептора Flt-1), «ловушку для VEGF» («VEGF-trap»), ингибиторы рецептора фактора роста тромбоцитов, такие как Gleevec™ (иматиниб мезилат). Антиангиогенные средства также включают природные ингибиторы ангиогенеза, например, ангиостатин, эндостатин и т.д. См., например, публикации Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53: 217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22: 3172-3179 (2003) (например, Таблицу 3, в которой представлены данные об антиангиогенной терапии при злокачественной меланоме); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5: 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22: 6549-6556 (2003) (например, Таблицу 2, в которой представлены данные об известных антиангиогенных факторах); и Sato. Int. J. Clin. Oncol., 8: 200-206 (2003) (например, Таблицу 1, в которой представлены данные об антиангиогенных средствах, применявшихся в клинических исследованиях).

Термин «антитело» в настоящей заявке используется в наиболее широком смысле и охватывает различные структуры антитела, включая, но не ограничиваясь ими, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), а также фрагменты антител при условии, что такие фрагменты демонстрируют желаемую антиген-связывающую активность.

Термин «VEGF» или «VEGF-А» используют для обозначения фактора роста эндотелия сосудов человека (vascular endothelial growth factor) длиной 165 аминокислот и родственных факторов роста эндотелия сосудов человека длиной 121, 145, 189 и 206 аминокислот, как описано, например, в публикациях Leung et al. Science, 246: 1306 (1989) и Houck et al. Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991), вместе с существующими в природе аллельными и процессированными формами данного фактора. VEGF-А является членом семейства генов, включающего VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F и PlGF . VEGF-A, главным образом, связывается с двумя высокоаффинными рецепторными тирозинкиназами, VEGFR-1 (Flt-1) и VEGFR-2 (Flk-1/KDR), причем последняя является основным передатчиком митогенных сигналов VEGF-А в эндотелиальных клетках сосудов. Кроме того, было обнаружено, что нейропилин-1 может выступать в качестве рецептора гепарин-связывающих изоформ VEGF-А и может оказывать влияние на развитие сосудов. Термин «VEGF» или «VEGF-А» также означает VEGF видов, отличных от человека, таких как мышь, крыса или примат. Иногда VEGF от конкретных видов обозначают терминами, такими как чVEGF для VEGF человека или mVEGF для VEGF мыши. Как правило, VEGF означает VEGF человека. Термин «VEGF» также используют для обозначения усеченных форм или фрагментов полипептида, содержащего аминокислоты с 8 по 109 или с 1 по 109 фактора роста эндотелия сосудов человека длиной 165 аминокислот. Ссылка на любую из таких форм VEGF может быть указана в настоящей заявке, например, как «VEGF (8-109)», «VEGF (1-109)» или «VEGF165». Положения аминокислот «усеченного» нативного VEGF пронумерованы, как указано в последовательности нативного VEGF. Например, положение аминокислоты 17 (метионин) в усеченном нативном VEGF представляет собой также положение 17 (метионин) в нативном VEGF. Усеченный нативный VEGF обладает аффинностью связывания с рецепторами KDR и Flt-1, сравнимой с нативным VEGF.

«Антитело против VEGF» представляет собой антитело, которое связывается с VEGF с достаточной аффинностью и специфичностью. Выбранное антитело в норме будет обладать аффинностью связывания с VEGF, например, антитело может связываться с чVEGF со значением Kd от 100 нМ до 1 пМ. Аффинность антител можно определить, например, в ходе анализа методом поверхностного плазмонного резонанса (такого как анализ BIAcore, как описано в публикации заявки РСТ №WO 2005/012359); твердофазного иммуноферментного анализа (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA); и конкурентных анализов (например, РИА - радиоиммунного анализа). Согласно некоторым вариантам реализации антитело против VEGF согласно настоящему изобретению можно применять в качестве терапевтического средства для нацеливания и препятствования заболеваниям или состояниям, в которые вовлечена активность VEGF. Также можно проводить другие анализы антитела для определения биологической активности, например, для оценки эффективности данного антитела в качестве терапевтического средства. Такие анализы известны в данной области техники и зависят от антигена-мишени, а также от предполагаемого применения антитела. Примеры включают ингибиторный анализ на клетках HUVEC; анализы ингибирования роста опухолевых клеток (как описано, например, в заявке WO 89/06692); анализы антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) и комплемент-опосредованной цитотоксичности (complement-mediated cytotoxicity, CDC) (патент США №5,500,362); а также анализы агонистической активности или гемопоэза (см. заявку WO 95/27062). Антитело против VEGF, как правило, не будет связываться с другими гомологами VEGF, такими как VEGF-B или VEGF-C, а также с другими факторами роста, такими как PlGF , PDGF или bFGF.

«Антитело серии В20» согласно настоящему изобретению представляет собой антитело против VEGF, полученное из последовательности антитела В20 или являющееся антителом, происходящим из В20, согласно любой из фиг. 27-29 публикации РСТ №WO 2005/012359, полное описание которой явным образом включено в настоящую заявку посредством ссылки. См. также публикацию РСТ №WO 2005/044853 и заявку на патент США 60/991,302, содержание которых явным образом включено в настоящую заявку посредством ссылки. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитело серии В20 связывается с функциональным эпитопом на VEGF человека, который содержит остатки F17, М18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, Е103 и С104.

«Антитело серии G6» согласно настоящему изобретению представляет собой антитело против VEGF, полученное из последовательности антитела G6 или являющееся антителом, происходящим из G6, согласно любой из фиг. 7, 24-26 и 34-35 публикации РСТ №WO 2005/012359, полное описание которой явным образом включено в настоящую заявку посредством ссылки. См. также публикацию РСТ №WO 2005/044853, полное описание которой явным образом включено в настоящую заявку посредством ссылки. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитело серии G6 связывается с функциональным эпитопом VEGF человека, который содержит остатки F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 и Q89.

Антитело против VEGF «бевацизумаб (BV или Bev)», также известное как «rhuMAb VEGF» или «Avastin®», представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против VEGF, полученное согласно публикации Presta et al., Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997). Данное антитело содержит мутантные каркасные области IgG1 человека и антиген-связывающие области, определяющие комплементарность, моноклонального антитела А.4.6.1 мыши против чVEGF , которое блокирует связывание VEGF человека с рецепторами VEGF. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, включая большинство каркасных областей, получено из IgG1 человека, и приблизительно 7% последовательности получено из антитела мыши А4.6.1. Молекулярная масса бевацизумаба составляет приблизительно 149000 дальтон, и данное антитело является гликозилированным. Другие антитела против VEGF включают антитела, описанные в патенте США №6,884,879 и заявке WO 2005/044853.

«Эпитоп А4.6.1» означает эпитоп, который распознается антителом против VEGF бевацизумабом (AVASTIN®) (см. публикацию Muller et al. Structure. 6: 1153-1167, 1998). Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения антитела против VEGF включают, но не ограничены ими, моноклональное антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело против VEGF А4.6.1, наработанное гибридомой АТСС НВ 10709; рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против VEGF, полученное согласно Presta et al. (Cancer Res. 57: 4593-4599, 1997).

«Функциональный эпитоп» согласно настоящему изобретению означает аминокислотные остатки антигена, которые вносят свой энергетический вклад в связывание с антителом. Мутация в любом из энергетически значимых остатков данного антигена (например, мутация в VEGF дикого типа на аланин или гомологичная мутация) будет предотвращать связывание антитела так, что в результате этого соотношение относительных аффинностей (IC50 мутантного VEGF/IC50 VEGF дикого типа) данного антитела будет составлять более чем 5 (см. пример 2 в заявке WO 2005/012359). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанное соотношение относительных аффинностей определяют посредством анализа ELISA со связыванием в растворе, проводимого методом фагового дисплея. Вкратце, 96-луночные планшеты Maxisorp (NUNC) сенсибилизируют в течение ночи при температуре 4°C Fab-фрагментом исследуемого антитела в концентрации 2 мкг/мл в ФБР (фосфатный буферный раствор) и блокируют ФБР, 0,5% БСА (бычий сывороточный альбумин) и 0,05% Tween 20 (ФБТ, фосфатный буфер - Твин) в течение 2 часов при комнатной температуре. Серийные разведения аланиновых точечных мутантов чVEGF , экспонированных на фаге (вариант с остатками 8-109), или чVEGF дикого типа (8-109) в ФБТ инкубируют на планшетах с нанесенным Fab в течение 15 мин. при комнатной температуре, а затем планшеты промывают ФБР, 0,05% Tween 20 (ФБРТ). Связанный фаг обнаруживают с применением моноклонального антитела против М13, конъюгированного с пероксидазой хрена (Amersham Pharmacia) и разведенного в соотношении 1:5000 в ФБТ, а затем визуализируют с применением субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, Md) приблизительно в течение 5 мин., после чего реакцию гасят 1,0 М H3PO4, и регистрируют спектры на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Отношение величин IC50 (IC50, ала/IС50, дикого типа) представляет собой кратность снижения аффинности связывания (относительной аффинности связывания).

Антитело против VEGF ранибизумаб или антитело LUCENTIS®, или rhuFab V2 представляют собой гуманизированный фрагмент Fab против VEGF человека с созревшей аффинностью. Ранибизумаб получают стандартными способами рекомбинантной технологии в векторе экспрессии Escherichia coli и ферментации в бактериях. Ранибизумаб является негликозилированным, и молекулярная масса данного антитела составляет ~48000 дальтон. См. заявки WO 98/45331 и US 2003/0190317.

«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое было обнаружено и отделено и/или очищено от компонентов природного окружения. Загрязняющими компонентами природного окружения антитела являются вещества, препятствующие диагностической или терапевтической эффективности антитела, которые могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанное антитело может быть очищено (1) на более чем 95% по массе антитела, что определяют, например, методом Лоури, и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более чем на 99% по массе антитела, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков в N-концевой или внутренней части аминокислотной последовательности с применением секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности, которую можно подтвердить методом электрофореза в ДСН-ПААГ (полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) в редуцирующих или нередуцирующих условиях с окрашиванием кумасси голубым или серебром. «Выделенное антитело» включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, если отсутствует по меньшей мере один компонент природного окружения антитела. Однако обычно выделенное антитело может быть получено с применением по меньшей мере одного этапа очистки.

«Нативные антитела» обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой приблизительно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями различных изотипов иммуноглобулина является различным. Каждая тяжелая и легкая цепь также содержат регулярно расположенные дисульфидные мостики внутри цепи. Каждая тяжелая цепь содержит на одном конце вариабельный домен (V_H), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен (V_L) на одном конце и константный домен на другом конце; константный домен легкой цепи выравнен с первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи выравнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Полагают, что определенные остатки аминокислот образуют поверхность контакта между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей.

«Вариабельная область» или «вариабельный домен» антитела означает аминоконцевые домены тяжелой или легкой цепи антитела. Вариабельный домен тяжелой цепи можно обозначить «VH». Вариабельный домен легкой цепи можно обозначить «VL». Данные домены являются, как правило, наиболее вариабельными частями антитела и содержат антиген-связывающие сайты.

Термин «вариабельный» означает тот факт, что последовательность определенных частей вариабельных доменов сильно различается среди антител и используется для связывания и специфичности каждого конкретного антитела с его конкретным антигеном. Однако вариабельность на протяжении вариабельных доменов антител распределена неравномерно. Вариабельность сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными областями (hypervariable region, HVR), в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные части вариабельных доменов называются каркасными областями (framework region, FR). Каждый из вариабельных доменов природных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR-области, главным образом, принимающие конфигурацию бета-слоя, соединенные тремя HVR, которые образуют петли, соединяющие и в некоторых случаях образующие часть структуры бета-слоя. В каждой цепи HVR удерживаются вместе в непосредственной близости с помощью FR-областей и совместно с HVR другой цепи участвуют в образовании антиген-связывающего сайта антител (см. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, однако обладают различными эффекторными функциями, такими как участие антитела в антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности.

«Легкие цепи» антител (иммуноглобулинов) любого вида позвоночных на основании аминокислотных последовательностей константных доменов можно отнести к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ).

В зависимости от аминокислотной последовательности константных доменов тяжелых цепей иммуноглобулины можно отнести к различным классам. Существуют пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называют α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Субъединичные структуры и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны и описаны в общем виде, например, в публикации Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000). Антитело может представлять собой часть большей слитой молекулы, образованной в результате ковалентного или нековалентного связывания антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами.

Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «целое антитело» используются в настоящей заявке взаимозаменяемо для обозначения антитела в его по существу интактной форме, а не в виде фрагментов антитела, как определено ниже. Данные термины, в частности, относятся к антителу с тяжелыми цепями, которые содержат Fc-область.

«Фрагменты антител» содержат часть интактного антитела, предпочтительно содержащую его антиген-связывающую область. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv-фрагменты; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечного антитела; и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.

Расщепление антител папаином позволяет получить два идентичных антиген-связывающих фрагмента, называемых «Fab-фрагментами» (fragment antigen binding, антиген-связывающий фрагмент), каждый из которых содержит единственный антиген-связывающий сайт, и остаточный «Fc-фрагмент» (fragment crystallizable, кристаллизующийся фрагмент), название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином позволяет получить F(аb’)₂-фрагмент, который содержит два антиген-связывающих сайта и все еще способен образовывать поперечные сшивки с антигеном

«Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антиген-связывающий сайт. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения двухцепочечная разновидность Fv состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой и одной легкой цепей с прочной нековалентной связью. В одноцепочечной разновидности Fv (scFV) вариабельный домен одной тяжелой и одной легкой цепей можно ковалентно связать посредством гибкого пептидного линкера, так что легкую и тяжелую цепи можно соединить в «димерную» структуру, аналогичную структуре в двухцепочечной разновидности Fv. Именно в этой конфигурации три HVR каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антиген-связывающего сайта на поверхности димера VH-VL. В совокупности шесть HVR придают антителу антиген-связывающую специфичность. Однако даже отдельный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три HVR, специфичных в отношении антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с меньшей аффинностью, чем полный сайт связывания.

Fab-фрагмент содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, а также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце СН1-домена тяжелой цепи, включая один или несколько цистеинов шарнирной области антитела. Fab'-SH служит в настоящей заявке для обозначения Fab', в котором остаток (остатки) цистеина константных доменов несут свободную тиольную группу. Фрагменты антител F(ab')₂ исходно получали в виде пар Fab'-фрагментов, между которыми находятся шарнирные цистеины. Также известны другие химические сшивки фрагментов антител.

«Одноцепочечные Fv-» или «scFv-» фрагменты антитела содержат VH- и VL-домены антитела, причем данные домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид scFv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет scFv сформировать требуемую структуру для связывания антигена. Обзор scFv см. в публикации Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York: 1994), pp 269-315.

Термин «диатела» означает фрагменты антител с двумя антиген-связывающими сайтами, причем указанные фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в той же самой полипептидной цепи (VH-VL). При использовании линкера, который является слишком коротким, чтобы обеспечить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и формировать два антиген-связывающих сайта. Диатела могут являться бивалентными или биспецифичными. Диатела более полно описаны, например, в патентах и публикациях ЕР 404097; WO 1993/01161; Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9: 129-134; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993). Триатела и тетратела также описаны в публикации Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9: 129-134.

Термин «моноклональное антитело» в настоящей заявке означает антитело, полученное из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных мутаций, например, возникающих в природе мутаций, которые могут присутствовать в минимальных количествах. Таким образом, модификатор «моноклональные» указывает на характер антител, как не являющихся смесью отдельных антител. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения такое моноклональное антитело, как правило, включает антитело, содержащее полипептидную последовательность, которая связывает мишень, причем указанная полипептидная последовательность, связывающая мишень, была получена посредством процесса, который включает отбор одной полипептидной последовательности, связывающей мишень, из множества полипептидных последовательностей. Например, процесс отбора может представлять собой отбор уникального клона из множества клонов, таких как совокупность гибридомных клонов, фаговых клонов или клонов рекомбинантных ДНК. Следует понимать, что отобранную последовательность, связывающую мишень, можно дополнительно изменять, например, для улучшения аффинности в отношении мишени, для гуманизации последовательности, связывающей мишень, для повышения продукции данной последовательности в клеточной культуре, для снижения иммуногенности данной последовательности in vivo, для создания полиспецифичного антитела и т.д., и что антитело, содержащее измененную последовательность, связывающую мишень, также представляет собой моноклональное антитело согласно настоящему изобретению. В отличие от препаратов поликлонального антитела, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклонального антитела направлено против одной детерминанты в антигене. В дополнение к специфичности преимуществом препаратов моноклональных антител является то, что такие препараты, как правило, не содержат примесей других иммуноглобулинов.

Модификатор «моноклональный» указывает на признак антитела, заключающийся в том, что такое антитело получают из по существу гомогенной популяции антител, и не подразумевает того, что антитело должно быть получено каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения в соответствии с настоящим изобретением, можно получать разнообразными способами, в том числе, например, способом на основе гибридом (например, см. публикации Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975); Hongo et al., Hybridoma 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), способом на основе рекомбинантных ДНК (см., например, патент США №4816567), посредством технологий фагового дисплея (см., например, публикации Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol, 340 (5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004) и способами продукции антител человека или антител, подобных антителам человека, у животных, которые содержат все локусы иммуноглобулина человека или их часть или гены, кодирующие последовательности иммуноглобулина человека (см., например, заявки и публикации WO1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7: 33 (1993); патенты США №5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016; публикации Marks et al., Bio. Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); и Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).

Моноклональные антитела согласно настоящей заявке, в частности, включают «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепей идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученных из конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как оставшаяся часть цепи или цепей является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных из других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител при условии, что такие фрагменты демонстрируют желаемую биологическую активность (патент США №4816567; и публикация Morrison et al., PNAS USA 81: 6851-6855 (1984)). Химерные антитела включают антитела PRIMATIZED®, в которых антиген-связывающая область антитела получена из антитела, образованного, например, в результате иммунизации обезьяны макака антигеном, представляющим интерес.

«Гуманизированные» формы антител, отличных от антител человека (например, антител мыши), представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, отличного от иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гуманизированное антитело представляет собой иммуноглобулин человека (реципиентное антитело), в котором остатки HVR реципиента заменяют остатками HVR видов, отличных от человека (донорное антитело), таких как мышь, крыса, кролик или нечеловекообразный примат, обладающими желаемой специфичностью, аффинностью и/или активностью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками, отличными от остатков человека. Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не представлены в реципиентном антителе или в донорном антителе. Такие модификации можно осуществить для дополнительного улучшения характеристик антител. Как правило, гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного и, как правило, из двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют петлям иммуноглобулина, отличного от иммуноглобулина человека, и все или по существу все FR представляют собой последовательности FR иммуноглобулина человека. Также гуманизированное антитело необязательно содержит по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, константной области иммуноглобулина человека. Более подробную информацию см., например, в публикациях Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). См. также, например, публикации Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994); и патенты США №№6,982,321 и 7,087,409.

«Антитело человека» представляет собой антитело, которое содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого человеком, и/или которое получают с применением любых методик получения антител человека, описанных в настоящей заявке. Данное определение антитела человека, в частности, исключает гуманизированное антитело, содержащее антиген-связывающие остатки, отличные от остатков человека. Антитела человека можно получить с применением различных методик, известных в данной области техники, включая библиотеки фагового дисплея. См. публикации Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 (1991). Также для получения моноклональных антител человека доступны способы, описанные в публикациях Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol. 147 (1): 86-95 (1991). См. также публикацию van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-374 (2001). Антитела человека можно получить посредством введения антигена трансгенному животному, которое было модифицировано для образования таких антител в ответ на антигенный стимул, но эндогенные локусы которого были заблокированы, например, иммунизированным ксеномышам (см., например, патенты США №№6,075,181 и 6,150,584 относительно технологии XENOMOUSE™). См. также, например, публикацию Li et al., PNAS USA 103: 3557-3562 (2006) относительно антител человека, полученных посредством технологии гибридомы В-клеток человека.

Термин «гипервариабельная область», «HVR» или «HV» в настоящей заявке означает области вариабельного домена антитела, последовательность которых является гипервариабельной и/или которые формируют структурно оформленные петли. Как правило, антитела содержат шесть HVR; три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (LI, L2, L3). В природных антителах Н3 и L3 демонстрируют наибольшее разнообразие из шести гипервариабельных областей; предполагают, что Н3, в частности, играет исключительную роль в придании тонкой специфичности антителам. См., например, публикации Xu et al., Immunity 13: 37-45 (2000); Johnson and Wu in Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). Действительно, существующие в природе антитела верблюдовых, состоящие только из тяжелой цепи, являются функциональными и стабильными при отсутствии легкой цепи. См., например, публикации Hamers-Casterman et al, Nature 363: 446-448 (1993) и Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

Используют ряд определений HVR, и все они включены в настоящую заявку. HVR, которые представляют собой области, определяющие комплементарность (complementary determining region, CDR), согласно Кэботу определяют на основе вариабельности последовательности, и данное определение используют чаще всего (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Вместо этого Чотия ссылается на местоположение структурных петель (Chothia and Lesk J. Mol. Biol 196: 901-917 (1987)). HVR согласно AbM представляют собой компромисс между CDR согласно Кэботу и структурными петлями согласно Чотия, и данное определение используют в программном обеспечении для моделирования антител Oxford Molecular's AbM. «Контактные» HVR определяют на основе анализа доступных кристаллических структур комплексов. Остатки каждой из этих гипервариабельных областей отмечены ниже

HVR могут содержать «расширенные HVR», как указано ниже: 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 или 89-96 (L3) в VL, и 26-35 (H1), 50-65 или 49-65 (Н2), и 93-102, 94-102 или 95-102 (Н3) в VH. Остатки вариабельного домена пронумерованы согласно публикации Kabat et al., ссылка выше, для каждого из данных определений расширенных HVR.

«Каркасные» остатки или остатки «FR» являются остатками вариабельного домена, которые отличаются от остатков HVR, как определено в настоящей заявке.

Выражение «нумерация остатка вариабельного домена согласно Кэботу» или «нумерация положения аминокислоты согласно Кэботу» и его вариации относится к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи, из собрания данных по антителам в публикации Kabat et al., выше. При использовании данной системы нумерации действительная линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество аминокислот или дополнительные аминокислоты, что соответствует укорочению FR или HVR вариабельного домена или вставке в них. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать вставку одной аминокислоты (остаток 52а согласно Кэботу) после остатка 52 Н2 и вставленные остатки (например, остатки 82а, 82b и 82с и т.п. согласно Кэботу) после остатка 82 тяжелой цепи FR. Нумерацию остатков согласно Кэботу можно определить для данного антитела посредством выравнивания областей гомологии последовательности антитела со «стандартной» последовательностью, пронумерованной согласно Кэботу.

Антитело с «созревшей аффинностью» представляет собой антитело с одним или несколькими изменениями в одной или нескольких HVR, которые приводят к увеличению аффинности антитела в отношении антигена по сравнению с родительским антителом, которое не содержит данного изменения или изменений. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитело с созревшей аффинностью характеризуется наномолярными или даже пикомолярными значениями аффинности в отношении антигена-мишени. Антитела с созревшей аффинностью получают посредством способов, известных в данной области техники. В публикации Marks et al. Bio/Technology 10: 779-783 (1992) описано аффинное созревание при перестановке VH- и VL-доменов. Случайный мутагенез остатков в HVR и/или каркасных остатков описан, например, в публикациях Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 (7): 3310-9 (1995); и Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992).

«Антагонисты» в настоящей заявке означают соединения или средства, ингибирующие или уменьшающие биологическую активность молекулы, с которой связываются. Антагонисты включают антитела, синтетические пептиды или пептиды с нативной последовательностью, иммуноадгезины и низкомолекулярные антагонисты, которые связываются с VEGF, необязательно конъюгированные или слитые с другой молекулой. «Блокирующее» антитело или антитело-«антагонист» представляет собой антитело, ингибирующее или уменьшающее биологическую активность антигена, с которым оно связывается.

«Антагонист VEGF» означает молекулу, способную к нейтрализации, блокированию, ингибированию, подавлению, уменьшению или препятствованию активностям VEGF посредством связывания с VEGF или с одним или несколькими рецепторами VEGF или с нуклеиновой кислотой, кодирующей VEGF или рецепторы VEGF. Антагонист VEGF предпочтительно связывается с VEGF или рецептором VEGF. Антагонисты VEGF включают антитела против VEGF и антиген-связывающие фрагменты данных антител, полипептиды, которые связываются с VEGF и рецепторами VEGF и блокируют взаимодействие лиганд-рецептор (например, иммуноадгезины, пептид-ассоциированные антитела), антитела против рецептора VEGF и антагонисты рецептора VEGF, такие как низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ VEGFR, аптамеры, которые связываются с VEGF, а также нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в жестких условиях с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими VEGF или рецептор VEGF (например, РНКи). Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения антагонист VEGF связывается с VEGF и ингибирует индуцированную VEGF пролиферацию эндотелиальных клеток in vitro. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения антагонист VEGF связывается с VEGF или рецептором VEGF с большей аффинностью, чем с молекулой, отличной от VEGF, или с рецептором, отличным от рецептора VEGF. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения антагонист VEGF связывается с VEGF или рецептором VEGF с Kd, составляющей от 1 мкМ до 1 пМ. Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения антагонист VEGF связывается с VEGF или рецептором VEGF с Kd, составляющей от 500 нМ до 1 пМ.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения антагонист VEGF выбирают из полипептида, например, антитела, пептид-ассоциированного антитела, иммуноадгезина, малой молекулы или аптамера. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения антитело представляет собой антитело против VEGF, такое как антитело AVASTIN^®, или антитело против рецептора VEGF, такое как антитело против VEGFR2 или против VEGFR3. Другие примеры антагонистов VEGF включают: VEGF-Trap, Mucagen, РТК787, SU11248, AG-013736, Bay 439006 (сорафениб), ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW-786034, RWJ-417975/CT6758 и KRN-633.

Термин «противоопухолевая композиция» или «противораковая композиция», или «противораковое средство» означает композицию, пригодную для лечения рака, содержащую по меньшей мере одно активное терапевтическое средство, например, «противораковое средство». Примеры терапевтических средств (противораковых средств) включают, но не ограничены ими, например, химиотерапевтические средства, средства, ингибирующие рост, цитотоксические средства, средства, применяемые в лучевой терапии, антиангиогенные средства, апоптотические средства, антитубулиновые средства и другие средства для лечения рака, такие как антитела против HER-2, антитела против CD20, антагонист рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (например, ингибитор тирозинкиназы), ингибитор HER1/EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva™), ингибиторы фактора роста тромбоцитов (например, Gleevec™ (иматиниб мезилат)), ингибитор СОХ-2 (например, целекоксиб), интерфероны, цитокины, антагонисты (например, нейтрализующие антитела), которые связываются с одной или несколькими из следующих мишеней: ErbВ2, ErbВ3, ErbB4, PDGFR бета, BlyS, APRIL, ВСМА, VEGF или рецептором (рецепторами) VEGF, TRAIL/Apo2, и другие биологические активные средства и средства-продукты органического синтеза и т.д. Комбинации указанных средств также включены в настоящее изобретение.

«Химиотерапевтическое средство» представляет собой химическое соединение, пригодное для лечения рака. Примеры химиотерапевтических средств включают химическое соединение, пригодное для лечения рака. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как, например, темозоломид (ТМЗ), имидазотетразиновое производное алкилирующего средства дакарбазина. Дополнительные примеры химиотерапевтических средств включают, например, паклитаксел или топотекан, или пегилированный липосомальный доксорубицин (ПЛД). Другие примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид CYTOXAN®; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, в том числе альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; ацетогинины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин; бриостатин; каллистатин; СС-1065 (в том числе синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (в том числе синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкриастатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамина оксида гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднемустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как эндииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин гамма1I и калихеамицин омегаI1 (см., например, публикацию Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, в том числе динемицин А; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатин и аналогичные хромофоры хромопротеиновых эндииновых антибиотиков, аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин ADRTAMYCIN® (в том числе морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринов, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидинов, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функцию коры надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфомитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин Т-2, верракурин A, роридин AА и ангвидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-С»); циклофосфамид; тиотепу; таксоиды, например, паклитаксел TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), сконструированный на основе альбумина препарат наночастиц паклитаксела без кремофора ABRAXANE® (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, III.) и доцетаксел TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин GEMZAR®; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин, винорелбин NAVELBINE®; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; иринотекан (Camptosar, СРТ-11) (включая схему лечения иринотеканом с 5-FU и лейковорином); ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; комбрестатин; лейковорин (LV); оксалиплатин, включая схему лечения оксалиплатином (FOLFOX); лапатиниб (Tykerb®); ингибиторы ПК C альфа, Raf, H-Ras, EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva®)) и VEGF-A, которые уменьшают пролиферацию клеток, а также фармацевтические приемлемые соли, кислоты или производные любого из перечисленных соединений.

Термин «цитотоксическое средство» в настоящей заявке означает вещество, которое ингибирует или предотвращает функцию клеток и/или вызывает разрушение клеток. Данный термин включает радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические средства, например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин C, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие средства, ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты, антибиотики и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты, и различные противоопухолевые или противораковые средства, описанные ниже. Ниже описаны другие цитотоксические средства. Уничтожающее опухолевые клетки средство вызывает разрушение опухолевых клеток.

«Средство, ингибирующее рост» в настоящей заявке означает соединение или композицию, которые ингибируют рост и/или пролиферацию клетки (например, клетки, экспрессирующей Robo4) in vitro или in vivo. Таким образом, средство, ингибирующее рост, может представлять собой средство, которое значительно уменьшает процент клеток, экспрессирующих Robo4, в S-фазе. Примеры средств, ингибирующих рост, включают средства, блокирующие прохождение клеточного цикла (в точке, отличной от S-фазы), такие как средства, вызывающие Gl-арест и арест в М-фазе. Классические блокаторы М-фазы включают алкалоиды барвинка (винкристин и винбластин), таксаны и ингибиторы топоизомеразы II, такие как антрациклиновый антибиотик доксорубицин ((8S-цис)-10-[(3-амино-2,3,6-тридеокси-α-L-ликсо-гексопиранозил)окси)-8-гликолоил-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-1-метокси-5,12-нафтаценедион), эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Те средства, которые осуществляют арест G1, влияют также на арест S-фазы, например ДНК-алкилирующие средства, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлорэтамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и Ara-С. Дополнительную информацию можно найти в руководстве The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., в Главе 1 под названием "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), особенно на стр. 13. Таксаны (паклитаксел и доцетаксел) представляют собой противораковые лекарственные средства, оба из которых получают из тиса. Доцетаксел (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), полученный из тиса европейского, представляет собой полусинтетический аналог паклитаксела (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Паклитаксел и доцетаксел стимулируют сборку микротрубочек из димеров тубулина и стабилизируют микротрубочки посредством предотвращения деполимеризации, что приводит к ингибированию митоза в клетках.

Термины «биомаркер» и «маркер» используются в настоящей заявке взаимозаменяемо для обозначения молекулярного маркера на основе ДНК, РНК, белка, углевода или гликолипида, экспрессию или наличие которого в образце, полученном от субъекта или пациента, можно обнаружить стандартными способами (или способами, раскрытыми в настоящей заявке) и который является пригодным для мониторинга восприимчивости или чувствительности субъекта-млекопитающего к антагонисту VEGF. Такие биомаркеры включают, но не ограничены ими, гены, представленные в Таблицах 1, 2 и 3. Экспрессия такого биомаркера, которую можно обнаружить, может являться большей или меньшей в образце, полученном от пациента, чувствительного или восприимчивого к антагонисту VEGF, по сравнению с эталонным уровнем (включая, например, медианный уровень экспрессии биомаркера в образце, полученном от группы/популяции пациентов, например, пациентов, имеющих глиобластому и проходящих анализ для определения восприимчивости к антагонисту VEGF; медианный уровень экспрессии биомаркера в образце, полученном от группы/популяции пациентов, например, пациентов, имеющих глиобластому, которые, как было установлено, не отвечают на лечение антагонистом VEGF; уровень в образце, ранее полученном от индивидуума в предшествующее время; или уровень в образце, полученном от пациента, который получал предшествующее лечение антагонистом VEGF (таким как антитело против VEGF) в условиях первичной опухоли, и у которого в настоящий момент могут наблюдаться метастазы). Индивидуумов, уровень экспрессии у которых является большим или меньшим, чем эталонный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена, такого как гены, представленные в Таблицах 1, 2 и 3, можно определить как субъектов/пациентов, которые будут с большой вероятностью отвечать на лечение антагонистом VEGF. Например, таких субъектов/пациентов, у которых наблюдаются уровни экспрессии гена вплоть до 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% или 5% по сравнению (т.е. выше или ниже) с эталонным уровнем (например, медианным уровнем, указанным выше), можно определить как субъектов/пациентов (например, пациентов, имеющих глиобластому), которые будут с большой вероятностью отвечать на лечение антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF.

Термин «уровень экспрессии» в общем виде означает количество полинуклеотида или аминокислотного продукта, или белка в биологическом образце. «Экспрессия», как правило, означает процесс, посредством которого закодированная в генах информация преобразуется в структуры, присутствующие и действующие в клетке. Вследствие этого согласно настоящему изобретению «экспрессия» гена может означать транскрипцию в полинуклеотид, трансляцию в белок или даже посттрансляционную модификацию белка. Фрагменты транскрибированного полинуклеотида, транслированного белка или посттрансляционно модифицированного белка также следует рассматривать как экспрессированные независимо от того, происходят ли такие фрагменты из транскрипта, полученного посредством альтернативного сплайсинга, или из деградированного транскрипта, либо в результате посттрансляционного процессинга белка, например, посредством протеолиза. «Экспрессированные гены» включают таковые, которые транскрибируются в полинуклеотид в виде мРНК, а затем транслируются в белок, а также таковые, которые транскрибируются в РНК, но не транслируются в белок (например, транспортные и рибосомальные РНК).

Термины «образец» и «биологический образец» используются взаимозаменяемо и означают любой биологический образец, полученный от индивидуума, включая биологические жидкости, ткань организма (например, ткань опухоли), клетки или другие источники. Биологические жидкости представляют собой, например, лимфу, сыворотку, свежую цельную кровь, мононуклеарные клетки периферической крови, замороженную цельную кровь, плазму (в том числе свежую или замороженную), мочу, слюну, семенную жидкость, синовиальную жидкость и спинномозговую жидкость. Образцы также включают ткань легких, ткань почек, ткань толстой кишки, ткань головного мозга, мышечную ткань, синовиальную ткань, кожу, фолликулы волос, костный мозг и ткань опухоли. Способы получения биопсии ткани и биологических жидкостей от млекопитающих хорошо известны в данной области техники.

В настоящей заявке термин «лечение» (и его грамматические варианты, такие как «лечить») означает клиническое вмешательство с целью изменения природного течения заболевания индивидуума, лечение которого проводят; лечение может осуществляться для профилактики или в ходе течения клинической патологии. Желаемые эффекты лечения включают, но не ограничены ими, предотвращение возникновения или повторного проявления заболевания, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, увеличение общей выживаемости (ОВ), увеличение выживаемости без прогрессирования заболевания (ВБПЗ), уменьшение степени прогрессирования заболевания, облегчение или временное облегчение состояния заболевания и ремиссию или улучшение прогноза.

Фраза «информирование пациента» или «предоставление рекомендации пациенту» в отношении лечения в настоящей заявке означает использование информации или полученных данных, касающихся уровня или наличия по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3, в образце, полученном от пациента, для определения пациента как получающего лечение соответствующей терапией или получающего лечение не соответствующей терапией. Согласно некоторому варианту реализации настоящего изобретения терапия может включать антагонист VEGF (например, антитело против VEGF, например, бевацизумаб). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения рекомендация может включать выявление пациента, для которого требуется корректировка эффективного количества антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, например, бевацизумаба), которое будет введено. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предоставление рекомендации относительно лечения включает рекомендацию относительно того, что количество антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, например, бевацизумаба), которое будет введено, необходимо откорректировать. Фраза «информирование пациента» или «предоставление рекомендации» в отношении лечения в настоящей заявке также может означать использование информации или полученных данных для предложения или выбора терапии, включающей антагонист VEGF (например, антитело против VEGF, например, бевацизумаб), для пациента, определенного или выбранного в качестве пациента, который будет более или менее вероятно отвечать на терапию, включающую антагонист VEGF. Информация или данные, используемые или полученные, могут находиться в любой форме, письменной, устной или электронной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения использование информации или полученных данных включает коммуникацию, предоставление, сообщение, хранение, пересылку, перенос, снабжение, передачу, распределение информации или комбинации данных процессов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения коммуникацию, предоставление, сообщение, хранение, пересылку, перенос, снабжение, передачу, распределение информации или комбинации данных процессов осуществляют посредством компьютерного устройства, блока анализатора или их комбинации. Согласно следующим вариантам реализации настоящего изобретения коммуникацию, предоставление, сообщение, хранение, пересылку, перенос, снабжение, передачу, распределение информации или комбинации данных процессов осуществляют сотрудники лаборатории или медицинские работники. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения информация или данные включают сравнение уровня по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3, с эталонным уровнем. Согласно некоторым вариантам реализации информация или данные включают указание на то, что по меньшей мере один из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3, присутствует или отсутствует в образце. Согласно некоторым вариантам реализации информация или данные включают указание на то, что пациент получает лечение соответствующей терапией или получает лечение не соответствующей терапией, включающей антагонист VEGF (например, антитело против VEGF, например, бевацизумаб).

Фраза «выявление пациента» или «позволяет выявить пациента» в настоящей заявке означает использование информации или полученных данных относительно уровня или наличия по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3, в образце, полученном от пациента, для выявления или выбора пациента как такого, который более вероятно получит пользу или менее вероятно получит пользу от терапии, включающей антагонист VEGF (например, антитело против VEGF, например, бевацизумаб). Информация или данные, используемые или полученные, могут находиться в любой форме, письменной, устной или электронной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения использование информации или полученных данных включает коммуникацию, предоставление, сообщение, хранение, пересылку, перенос, снабжение, передачу, распределение информации или комбинации данных процессов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения коммуникацию, предоставление, сообщение, хранение, пересылку, перенос, снабжение, передачу, распределение информации или комбинации данных процессов осуществляют посредством компьютерного устройства, блока анализатора или их комбинации. Согласно следующим вариантам реализации настоящего изобретения коммуникацию, предоставление, сообщение, хранение, пересылку, перенос, снабжение, передачу, распределение информации или комбинации данных процессов осуществляют сотрудники лаборатории или медицинские работники. Согласно некоторым вариантам реализации информация или данные включают сравнение уровня по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3, с эталонным уровнем. Согласно некоторым вариантам реализации информация или данные включают указание на то, что по меньшей мере один из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3, присутствует или отсутствует в образце. Согласно некоторым вариантам реализации информация или данные включают указание на то, что пациент более вероятно или менее вероятно будет отвечать на терапию, включающую антагонист VEGF (например, антитело против VEGF, например, бевацизумаб).

Фраза «выбор терапии» в настоящей заявке означает использование информации или полученных данных относительно уровня или наличия по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3, в образце, полученном от пациента, для выявления или выбора терапии для пациента. Согласно некоторому варианту реализации настоящего изобретения терапия может включать антагонист VEGF (например, антитело против VEGF, например, бевацизумаб). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фраза «выбор терапии» включает выявление пациента, для которого требуется корректировка эффективного количества антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, например, бевацизумаба), которое будет введено.

Под «монотерапией» подразумевают схему лечения, которая включает только одно терапевтическое средство для лечения рака или опухоли в течение периода лечения. Монотерапия с применением антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, например, бевацизумаба) означает, что антагонист VEGF вводят при отсутствии дополнительной противораковой терапии в течение периода лечения.

Термин «эффективное количество» означает количество лекарственного препарата, эффективное для лечения заболевания или нарушения, такого как глиобластома, у субъекта или пациента, такого как млекопитающее, например, человек. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарственного препарата может уменьшить количество раковых клеток; уменьшить размер опухоли; ингибировать (т.е. замедлить до некоторой степени и предпочтительно остановить) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (т.е. замедлить до некоторой степени и предпочтительно остановить) метастазирование опухоли; ингибировать, до некоторой степени, рост опухоли; и/или облегчить до некоторой степени один или несколько симптомов, связанных с нарушением. В зависимости от степени, в которой лекарственный препарат может предотвратить рост и/или уничтожить существующие раковые клетки, такой препарат может являться цитостатическим и/или цитотоксическим. В случае противораковой терапии эффективность in vivo можно измерить, например, посредством оценки длительности выживаемости, длительности выживаемости без прогрессирования заболевания (ВБПЗ), общей выживаемости (ОВ), частоты ответа (RR, response rate), длительности ответа и/или качества жизни.

«Эффективный ответ» пациента, или «восприимчивость» или «чувствительность» пациента к лечению антагонистом VEGF (например, антителом против VEGF, например, бевацизумабом) означает клиническую или терапевтическую пользу, которую получит пациент, подверженный риску глиобластомы или имеющий глиобластому, благодаря или в результате лечения антагонистом VEGF. Такая польза включает клеточные или биологические ответы, полный ответ, частичный ответ, стабилизацию заболевания (без прогрессирования или рецидивов) или ответ пациента с более поздним рецидивом благодаря или в результате лечения антагонистом. Например, эффективный ответ может представлять собой уменьшение размера опухоли, увеличение выживаемости без прогрессирования заболевания (ВБПЗ) и/или увеличение общей выживаемости (ОВ) у пациента, который, как было установлено в ходе диагностики, экспрессирует больший или меньший уровень одного или нескольких биомаркеров, представленных в Таблице 1, 2 или 3, по сравнению с эталонным уровнем (включая, например, медианный уровень экспрессии биомаркера в образце, полученном от группы/популяции пациентов, проходящих анализ для определения восприимчивости к антагонисту VEGF; медианный уровень экспрессии биомаркера в образце, полученном от группы/популяции пациентов, имеющих глиобластому, которые, как было установлено, не отвечают на лечение антагонистом VEGF; уровень в образце, ранее полученном от индивидуума в предшествующее время; или уровень в образце, полученном от пациента, который ранее получал лечение антагонистом VEGF (например, антителом против VEGF, например, бевацизумабом) в условиях первичной опухоли, и у которого в настоящий момент могут наблюдаться метастазы). Экспрессия генетического биомаркера или биомаркеров позволяет эффективно прогнозировать или прогнозировать с высокой чувствительностью такой эффективный ответ.

«Выживание» означает субъекта, остающегося живым, и включает выживание без прогрессирования заболевания (ВБПЗ) и общее выживание (ОВ). Выживание можно оценить методом Каплан-Мейера, и любые различия в выживаемости рассчитывают с применением стратифицированного логарифмического рангового критерия.

«Общее выживание» или «ОВ» означает субъекта, остающегося живым в течение определенного периода времени, такого как приблизительно 1 год, приблизительно 2 года, приблизительно 3 года, приблизительно 4 года, приблизительно 5 лет, приблизительно 10 лет и т.д., от начала лечения или от первичного диагноза. В исследованиях, лежащих в основе настоящего изобретения, событие, которое использовали для анализа выживаемости, представляло собой смерть по любой причине.

«Выживание без прогрессирования заболевания» или «ВБПЗ» означает время от начала лечения (или рандомизации) до первого прогрессирования заболевания или смерти. Например, ВБПЗ составляет время, в течение которого субъект остается живым без рецидивов рака, например, в течение определенного периода времени, такого как приблизительно 1 месяц, приблизительно 2 месяца, приблизительно 3 месяца, приблизительно 4 месяца, приблизительно 5 месяцев, приблизительно 6 месяцев, приблизительно 7 месяцев, приблизительно 8 месяцев, приблизительно 9 месяцев, приблизительно 1 год, приблизительно 2 года, приблизительно 3 года и т.д., от начала лечения или от первичного диагноза. Согласно одному аспекту настоящего изобретения ВБПЗ можно оценить с помощью критерия ответа МакДональда, как описано в публикации MacDonald etal. (J. Clin. Oncol. 1990; 8: 1277-80, 1990).

«Частота общего ответа» или «частота объективных ответов» (ЧОО) означает процент лиц, у которых наблюдается уменьшение размера или количества рака (например, глиобластомы) в течение минимального количества времени, и ЧОО можно представить в виде суммы частоты полных и неполных ответов.

Под «удлинением выживаемости» или «увеличением вероятности выживаемости» подразумевают увеличение ВБПЗ и/или ОВ субъекта, получившего лечение (например, субъекта, получившего лечение антагонистом VEGF (например, антителом против VEGF, например, бевацизумабом)), или популяции субъектов, получивших лечение, по сравнению с субъектом, не получившим лечение (например, субъектом, не получившим лечение антителом против VEGF), или популяцией субъектов, не получивших лечение, соответственно, или по сравнению с контрольным протоколом лечения, таким как лечение только химиотерапевтическим средством, таким как средства, которые применяют в стандарте лечения глиобластомы, таким как, например, темозоломид (ТМЗ), вместе с лучевой терапии или без нее. Мониторинг выживаемости проводят в течение по меньшей мере приблизительно одного месяца, приблизительно двух месяцев, приблизительно четырех месяцев, приблизительно шести месяцев, приблизительно девяти месяцев или в течение по меньшей мере приблизительно 1 года, или по меньшей мере приблизительно 2 лет, или по меньшей мере приблизительно 3 лет, или по меньшей мере приблизительно 4 лет, или по меньшей мере приблизительно 5 лет, или по меньшей мере приблизительно 10 лет и т.д., после начала лечения или после первичного диагноза.

Отношение рисков (ОР) представляет собой статистическое определение частоты событий. Для целей настоящего изобретения отношение рисков определяют как представление вероятности события в исследуемой группе, разделенной на вероятность события в контрольной группе в любой конкретный момент времени. «Отношение рисков» в анализе выживаемости без прогрессирования заболевания представляет собой краткую характеристику различия между двумя кривыми выживаемости без прогрессирования заболевания, представляющее уменьшение риска смерти при лечении по сравнению с контролем, в течение периода наблюдения.

«Пациент» или «субъект» в настоящей заявке означает любое животное (в том числе, например, млекопитающее, такое как собака, кошка, лошадь, кролик, животное, содержащееся в зоопарке, корова, свинья, овца, нечеловекообразный примат и человек), такое как человек, удовлетворяющее критериям для лечения, которое испытывает или испытывало один или несколько признаков, симптомов или других свидетельств заболевания или нарушения, такого как глиобластома (МГБ). В понятие пациента включены любые пациенты, участвующие в клинических исследованиях, не демонстрирующие какого-либо признака заболевания, или пациенты, участвующие в эпидемиологических исследованиях, или пациенты, когда-либо выступавшие в качестве контроля. Пациент мог ранее получать лечение антагонистом VEGF (например, антителом против VEGF, например, бевацизумабом) или другим лекарственным препаратом, или мог не получать такого лечения. Пациент мог ранее не получать дополнительный лекарственный препарат или лекарственные препараты, которые применяют, когда начинают лечение согласно настоящей заявке, т.е. пациент мог ранее не получать лечение, например, терапией, отличной от терапии антагонистом VEGF (например, антителом против VEGF, например, бевацизумабом), на «исходном уровне» (т.е. в установленной точке времени до введения первой дозы антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, например, бевацизумаба) в способе лечения согласно настоящей заявке, такой как день скрининга субъекта перед началом лечения). Такие «наивные», или ранее не получавшие лечение пациенты или субъекты, как правило, рассматриваются в качестве кандидатов для лечения таким дополнительным лекарственным препаратом (препаратами).

Термины «рак» и «раковый» относятся к физиологическому состоянию у млекопитающих или описывают такое физиологическое состояние, которое, как правило, характеризуется неконтролируемым ростом клеток. В данное определение включены доброкачественные и злокачественные варианты рака, а также латентные опухоли или микрометастазы. Примеры рака включают, но не ограничены ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких вариантов рака включают, но не ограничены ими, глиобластому (МГБ), в том числе, например, пронейральную МГБ, нейральную МГБ, классическую МГБ и мезенхимальную МГБ. МГБ может являться впервые диагностированной, диагностированной или вторичной. Другие варианты рака включают, например, рак молочной железы, плоскоклеточный рак, рак легких (в том числе мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких и плоскоклеточную карциному легких), рак брюшной полости, гепатоклеточный рак, гастрический рак или рак желудка (в том числе рак желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, рак яичников, рак шейки матки, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак толстой кишки, рак толстой и прямой кишок, карциному эндометрия или матки, карциному слюнных желез, рак почек или ренальный рак, рак печени, рак предстательной железы, рак наружных женских половых органов, рак щитовидной железы, карциному печени и различные типы рака головы и шеи, а также В-клеточную лимфому (в том числе неходжкинскую лимфому (НХЛ) низкой степени злокачественности/фолликулярную неходжкинскую лимфому (НХЛ); мелкоклеточную лимфоцитарную (МЛ) НХЛ; НХЛ средней степени злокачественности/фолликулярную НХЛ; диффузную НХЛ средней степени злокачественности; иммунобластную НХЛ высокой степени злокачественности; лимфобластную НХЛ высокой степени злокачественности; мелкоклеточную НХЛ с нерассеченными ядрами высокой степени злокачественности; НХЛ с массивной лимфаденопатией; мантийноклеточную лимфому; лимфому, вызванную СПИДом; и макроглобулинемию Вальденстрема); хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ); острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ); волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз; и посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение (ПТЛН), а также аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозами, отеком (таким как отек, связанный с опухолями головного мозга), и синдром Мейгса.

«Опухоль» в настоящей заявке означает рост и пролиферацию всех опухолевых клеток, будь то доброкачественные или злокачественные клетки, и все предраковые и раковые клетки и ткани. Термины «рак», «раковый», «нарушение пролиферации клеток», «нарушение пролиферации» и «опухоль» не являются взаимоисключающими, как указано в настоящей заявке.

Термин «фармацевтический состав» означает стерильный препарат, который находится в такой форме, которая позволяет биологической активности лекарственного препарата быть эффективной, и который не содержит дополнительных компонентов, являющихся неприемлемо токсичными по отношению к субъекту, которому будет введен указанный состав.

«Фармацевтически приемлемый носитель» означает компонент в фармацевтическом составе, отличный от активного компонента, который не является токсичным по отношению к субъекту. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничен ими, буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант.

«Набор» представляет собой любое изделие (например, упаковку или контейнер), содержащее по меньшей мере один реактив, например, лекарственный препарат, для лечения пациента, имеющего глиобластому, или зонд для специфического обнаружения гена-биомаркера или белка-биомаркера согласно настоящему изобретению. Изделие предпочтительно рекламируют, распространяют или продают в качестве единицы для осуществления способов согласно настоящему изобретению.

В настоящей заявке термин «ковариата» означает определенные переменные или информацию, касающуюся пациента. Клинические конечные точки часто рассматривают в регрессионных моделях, в которых конечные точки представляют зависимые переменные, а биомаркеры представляют основные или целевые независимые переменные (регрессоры). Если дополнительные переменные из совокупности клинических данных учитываются, их обозначают как (клинические) ковариаты.

Термин «клиническая ковариата» в настоящей заявке описывает всю клиническую информацию относительно пациента, которая, в целом, доступна на исходном уровне. Данные клинические ковариаты включают демографические данные, такие как пол, возраст и т.д., другую анамнестическую информацию, сопутствующие заболевания, сопутствующие варианты терапии, результаты физического осмотра, полученные общие лабораторные показатели, известные свойства ангоиогенных нарушений, определение стадии клинического заболевания, время и результат предшествующего лечения, историю болезни, а также всю аналогичную информацию, которая может быть связана с клиническим ответом на лечение.

В настоящей заявке термин «сырой анализ» или «нескорректированный анализ» означает регрессионные анализы, в которых, помимо рассматриваемых биомаркеров, не используются какие-либо дополнительные клинические ковариаты в регрессионной модели ни в качестве независимых факторов, ни в качестве стратифицирующей ковариаты.

В настоящей заявке термин «скорректированные на ковариаты» означает регрессионные анализы, в которых в регрессионной модели, помимо рассматриваемых биомаркеров, используются дополнительные клинические ковариаты в качестве независимых факторов или в качестве стратифицирующей ковариаты.

В настоящей заявке термин «одномерный» означает регрессионные модели или графические подходы, в которых только один из биомаркеров-мишеней является частью модели в качестве независимой переменной. Данные одномерные модели можно рассматривать с дополнительными клиническими ковариатами и без них.

В настоящей заявке термин «многомерный» означает регрессионные модели или графические подходы, в которых более одного биомаркера-мишени являются частью модели в качестве независимых переменных. Данные многомерные модели можно рассматривать с дополнительными клиническими ковариатами и без них.

III. Способы выявления пациентов, восприимчивых к антагонистам VEGF

В настоящем изобретении предложены способы выявления и/или мониторинга пациентов, которые будут с большой вероятностью отвечать на терапию антагонистом VEGF (например, антителом против VEGF, например, бевацизумабом). Данные способы пригодны, среди прочего, для увеличения вероятности того, что введение пациенту антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, например, бевацизумаба) будет эффективным. Данные способы включают обнаружение экспрессии одного или нескольких генетических биомаркеров в биологическом образце, полученном от пациента, причем экспрессия одного или нескольких таких биомаркеров свидетельствует о том, является ли пациент чувствительным или восприимчивым к антагонистам VEGF, таким как антитела против VEGF.

Более конкретно, определение уровня экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 ниже (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов) представленных в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1) в образце, полученном от пациента, является пригодным для мониторинга того, является ли пациент восприимчивым или чувствительным к антагонисту VEGF, такому как антитело против VEGF. Для любого из данных способов, описанных в настоящей заявке, можно, например, определить уровни экспрессии любой комбинации из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 генов, выбранных из генов, представленных в Таблице 3. В качестве альтернативы, для любого из данных способов, описанных в настоящей заявке, можно определить уровень экспрессии всех 10 генов (NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2), представленных в Таблице 3.

В одном примере определение уровня экспрессии по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 генов, представленных в Таблице 3, и по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленных в Таблице 2, в образце, полученном от пациента, является пригодным для мониторинга того, является ли пациент восприимчивым или чувствительным к антагонисту VEGF, такому как антитело против VEGF, такое как бевацизумаб. В одном примере определение уровня экспрессии по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 генов, представленных в Таблице 3, и по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1, в образце, полученном от пациента, является пригодным для мониторинга того, является ли пациент восприимчивым или чувствительным к антагонисту VEGF, такому как антитело против VEGF, такое как бевацизумаб. В одном примере определение уровня экспрессии всех 108 генов, представленных в Таблице 1, в образце, полученном от пациента, является пригодным для мониторинга того, является ли пациент восприимчивым или чувствительным к антагонисту VEGF, такому как антитело против VEGF, такое как бевацизумаб.

В некоторых случаях для любого из данных способов, описанных в настоящей заявке, можно определить суммарный уровень экспрессии по меньшей мере 10 генов (например, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более генов) в сумме. В других случаях для любого из способов, описанных в настоящей заявке, можно определить суммарный уровень экспрессии 65 или более генов (например, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или 105 или более генов).

Раскрытые в настоящем изобретении способы и анализы обеспечивают удобные, эффективные и потенциально экономически выгодные способы получения данных и информации, пригодной для оценки соответствующих или эффективных вариантов терапии для лечения пациентов. Например, от пациента может быть получен образец ткани (например, биопсия опухоли или образец крови) до и/или после лечения антагонистом VEGF, и данный образец можно проанализировать посредством различных анализов in vitro для определения того, являются ли клетки пациента чувствительными к антагонисту VEGF, такому как антитело против VEGF, такое как бевацизумаб.

В настоящем изобретении также предложены способы мониторинга чувствительности или восприимчивости пациента к антагонисту VEGF (например, антителу против VEGF, например, бевацизумабу). Данные способы можно осуществить во множестве форматов анализа, в том числе в анализах, обнаруживающих генетическую экспрессию или экспрессию белка (таких как ПЦР и иммуноферментные анализы), и в биохимических анализах, обнаруживающих соответствующую активность. Определение экспрессии или наличия таких биомаркеров в образцах, полученных от пациента, является прогностическим для определения того, является ли пациент чувствительным к биологическим эффектам антагониста VEGF, такого как антитело против VEGF, такое как бевацизумаб. Изобретение, представленное в настоящей заявке, заключается в том, что различие или изменение (т.е. увеличение или уменьшение) экспрессии 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1, в образце, полученном от пациента, имеющего глиобластому, относительно эталонного уровня (включая, например, медианный уровень экспрессии биомаркера в образце, полученном от группы/популяции пациентов, проходящих анализ для определения восприимчивости к антагонисту VEGF, или медианный уровень экспрессии биомаркера в образце, полученном от группы/популяции пациентов, имеющих глиобластому, которые, как было установлено, не отвечают на лечение антагонистом VEGF), коррелирует с лечением такого пациента антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF, такое как бевацизумаб.

В примере 5 показано, что увеличенные уровни экспрессии по меньшей мере одного из NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов) по сравнению с эталонными уровнями по меньшей мере одного биомаркера, оценку которого провели, позволяют выявить пациента, который с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF, такое как бевацизумаб. Уровни экспрессии по меньшей мере одного из NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов), определенные в комбинации с одним или несколькими генами, представленными в Таблице 1, 2 или 3, по сравнению с эталонными уровнями по меньшей мере одного биомаркера, оценку которого провели, могут также необязательно быть пригодными для выявления пациента, который с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF, такое как бевацизумаб. Как правило, различие или изменение (т.е. уменьшение или увеличение) по меньшей мере приблизительно в 1,5 раз, в 1,6 раз, в 1,8 раз, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 6 раз, в 7 раз, в 8 раз, в 9 раз или в 10 раз экспрессии по меньшей мере одного из генов по сравнению с эталонными уровнями (например, медианным уровнем или уровнями экспрессии биомаркера или биомаркеров в образце, полученном от группы/популяции пациентов, имеющих глиобластому и проходящих анализ для определения восприимчивости к антагонисту VEGF, или медианным уровнем или уровнями экспрессии биомаркера или биомаркеров в образце, полученном от группы/популяции пациентов, имеющих глиобластому, которые, как было установлено, не отвечают на лечение антагонистом VEGF), или различие или изменение (т.е. уменьшение или увеличение) среднего логарифмического соотношения, составляющее по меньшей мере приблизительно -2, -3, -4, -5 или -6 стандартных отклонений, от среднего измеренного уровня или уровней экспрессии гена или генов свидетельствует, что данный пациент будет отвечать на лечение антагонистом VEGF или является чувствительным к лечению антагонистом VEGF.

Согласно способам настоящего изобретения вероятность того, что конкретный индивидуум (например, пациент) с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF, можно определить посредством обнаружения уровня экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), и сравнения уровня экспрессии указанного гена с эталонным уровнем экспрессии. Например, как указано выше, эталонный уровень экспрессии может представлять собой медианный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена в группе/популяции пациентов, имеющих глиобластому и проходящих анализ для определения восприимчивости к антагонисту VEGF (например, антителу против VEGF, например, бевацизумабу). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эталонный уровень экспрессии представляет собой медианный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена у пациентов, имеющих глиобластому, которые, как было установлено, не отвечают на лечение антагонистом VEGF (например, антителом против VEGF, например, бевацизумабом). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эталонный уровень экспрессии представляет собой уровень экспрессии по меньшей мере одного гена в образце, ранее полученном от индивидуума в предшествующее время. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения индивидуумы представляют собой пациентов, получавших предшествующее лечение антагонистом VEGF в условиях первичной опухоли. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения индивидуумы представляют собой пациентов, у которых наблюдаются метастазы. Индивидуумов, которые характеризуются уровнем экспрессии, большим или меньшим, чем эталонный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена-биомаркера, описанного в настоящей заявке, определяют как субъектов/пациентов, которые будут с большой вероятностью отвечать на лечение антагонистом VEGF. Субъектов/пациентов, которые демонстрируют уровни экспрессии гена, составляющие, например, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% или 5% по сравнению (т.е. выше или ниже) с медианным уровнем, определяют как пациентов, которые будут с большой вероятностью отвечать на лечение антагонистом VEGF (например, антителом против VEGF, например, бевацизумабом). Субъектов/пациентов можно проинформировать, что указанные субъекты характеризуются увеличенной вероятностью являться восприимчивыми к лечению антагонистом VEGF, и/или предоставить рекомендации, что в противораковую терапию следует включить антагонист VEGF. Уровень экспрессии гена можно определить с применением по меньшей мере одного из генов-биомаркеров, описанных в настоящей заявке, или любой линейной комбинации генов-биомаркеров, описанных в настоящей заявке (например, среднее, средневзвешенное или медиана), с применением способов, известных в данной области техники и описанных, например, в руководстве Sokal R.R. and Rholf, F.J. (1995) "Biometry: the principles and practice of statistics in biological research," W.H. Freeman and Co. New York, NY.

Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ определения того, будет ли пациент, имеющий глиобластому, отвечать на лечение антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF (например, бевацизумаб), включающий оценку в качестве биомаркера экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в образце, полученном от пациента, (i) до введения пациенту любого антагониста VEGF, или (ii) до и после такого лечения. Изменение (т.е. увеличение или уменьшение) экспрессии по меньшей мере одного из генов относительно эталонного уровня (см. выше) свидетельствует, что данный пациент будет с большой вероятностью отвечать на лечение антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF (например, бевацизумаб). Пациента можно также проинформировать, что у него присутствует увеличенная вероятность восприимчивости к лечению антагонистом VEGF, и/или предоставить рекомендацию, что в противораковую терапию следует включить антагонист VEGF.

Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ оптимизации терапевтической эффективности противораковой терапии пациента, имеющего глиобластому, включающий определение в качестве биомаркера экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в образце, полученном от пациента, (i) до введения пациенту любого антагониста VEGF, или (ii) до и после такого лечения. Изменение (т.е. увеличение или уменьшение) экспрессии по меньшей мере одного из генов относительно эталонного уровня (см. выше) свидетельствует, что данный пациент будет с большой вероятностью отвечать на лечение антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF (например, бевацизумаб). Пациента можно также проинформировать, что у него присутствует увеличенная вероятность восприимчивости к лечению антагонистом VEGF, и/или предоставить рекомендацию, что в противораковую терапию следует включить антагонист VEGF.

Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ выбора терапии для пациента, имеющего глиобластому, включающий определение в качестве биомаркера экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в образце, полученном от пациента, (i) до введения пациенту любого антагониста VEGF, или (ii) до и после такого лечения. Изменение (т.е. увеличение или уменьшение) экспрессии по меньшей мере одного из генов относительно эталонного уровня (см. выше) свидетельствует, что данный пациент будет с большой вероятностью отвечать на лечение антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF (например, бевацизумаб). Терапию, включающую антагонист VEGF (например, антитело против VEGF, например, бевацизумаб), можно выбрать, если было обнаружено, что пациент с большой вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом VEGF, и пациенту можно предоставить рекомендации выбранной терапии, включающей антагонист VEGF.

Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ мониторинга чувствительности или восприимчивости пациента к антагонисту VEGF, такому как антитело против VEGF. Данный способ включает оценку экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в образце, полученном от пациента, и прогнозирование чувствительности или восприимчивости пациента к антагонисту VEGF, такому как антитело против VEGF (например, бевацизумаб), причем изменение (т.е. увеличение или уменьшение) экспрессии по меньшей мере одного гена из представленных в Таблице 1, 2 или 3 коррелирует с чувствительностью или восприимчивостью пациента к эффективному лечению антагонистом VEGF. Согласно одному варианту реализации данного способа биологический образец получают от пациента до введения любого антагониста VEGF и проводят анализ для оценки уровня продуктов экспрессии по меньшей мере одного гена в образце. Если экспрессия по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3, изменилась (т.е. увеличилась или уменьшилась) относительно эталонного уровня (например, см. выше), пациента определяют как чувствительного или восприимчивого к лечению антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF. Пациента можно проинформировать, что у него присутствует увеличенная вероятность чувствительности или восприимчивости к лечению антагонистом VEGF, и/или предоставить рекомендацию, что в противораковую терапию следует включить антагонист VEGF. Согласно другому варианту реализации данного способа биологический образец получают от пациента до и после введения антагониста VEGF, описанного в настоящей заявке.

Специалистам в области медицины, в особенности имеющим отношение к применению диагностических тестов и лечению терапевтическими средствами, очевидно, что биологические системы являются изменчивыми и не всегда полностью предсказуемыми, и вследствие этого много хороших диагностических тестов или терапевтических средств иногда являются неэффективными. Вследствие этого определение наиболее соответствующего курса лечения для конкретного пациента, в конечном счете, остается на усмотрение лечащего врача на основании результатов анализов, состояния пациента и истории болезни, а также собственного врачебного опыта. Могут даже иметь место случаи, когда, например, врач выберет лечение пациента антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF (например, бевацизумаб), даже если пациент, согласно прогнозам, не является в особенности чувствительным к антагонистам VEGF, на основании данных диагностических тестов или других критериев, в особенности, если все или большинство других очевидных вариантов лечения оказались неудачными или если предполагается некоторая синергия при введении антагониста VEGF с другим вариантом лечения.

Согласно следующим выраженным вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ прогнозирования чувствительности пациента к лечению антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF (например, бевацизумаб), или прогнозирования того, будет ли пациент эффективно отвечать на лечение антагонистом VEGF, включающий оценку уровня одного или нескольких генетических биомаркеров, указанных в настоящей заявке, экпрессированных в образце; и прогнозирование чувствительности пациента к ингибированию антагонистом VEGF, причем уровни экспрессии одного или нескольких из данных генетических биомаркеров коррелируют с высокой чувствительностью пациента к эффективному ответу на лечение антагонистом VEGF.

Образец может быть получен от пациента, который, как подозревают, имеет глиобластому или у которого была диагностирована глиобластома, и, следовательно, который вероятно, нуждается в лечении, или от нормального индивидуума, у которого не подозреваются какие-либо нарушения. Для оценки экспрессии маркера образцы, полученные от пациента, такие как образцы, содержащие клетки, или белки или нуклеиновые кислоты, образованные данными клетками, можно применять в способах согласно настоящему изобретению. В способах согласно настоящему изобретению уровень биомаркера можно определить посредством оценки количества (например, абсолютного количества или концентрации) маркеров в образце, предпочтительно, в образце ткани (например, образце ткани опухоли, таком как биопсия). Кроме того, уровень биомаркера можно оценить в биологических жидкостях или экскрементах, содержащих обнаруживаемые уровни биомаркеров. Биологические жидкости или секреты, пригодные для применения в качестве образцов согласно настоящему изобретению, включают, например, кровь, мочу, слюну, стул, плевральный выпот, лимфатическую жидкость, мокроту, асцитную жидкость, секрет предстательной железы, спинномозговую жидкость (СМЖ) или любой другой биологический секрет или его производное. Слово «кровь» включает цельную кровь, плазму, сыворотку или любое производное крови. Иногда оценка биомаркера в таких биологических жидкостях или экскрементах может быть предпочтительной в обстоятельствах, при которых инвазивный способ отбора образцов является несоответствующим или неудобным. Однако в случае образцов, представляющих собой биологические жидкости, образец, который будут исследовать согласно настоящему изобретению, представляет собой предпочтительно кровь, синовиальную ткань или синовиальную жидкость, наиболее предпочтительно, - кровь.

Образец может являться замороженным, свежим, зафиксированным (например, зафиксированным в формалине), центрифугированным и/или залитым (например, залитым в парафин) и т.д. Клеточный образец можно, разумеется, подвергнуть множеству хорошо известных методик подготовки и хранения образцов после отбора (например, экстракции нуклеиновой кислоты и/или белка, фиксации, хранению, замораживанию, ультрафильтрации, концентрированию, выпариванию, центрифугированию и т.д.) перед оценкой количества маркера в образце. Аналогично образцы, полученные в результате биопсии, также можно подвергнуть методикам подготовки и хранения образцов после отбора, например, фиксации.

В любом из способов, описанных в настоящей заявке, индивидуума (например, пациента/субъекта) можно проинформировать об увеличении или уменьшении вероятности того, что данный индивидуум является чувствительным или восприимчивым к лечению антагонистом VEGF (например, антителом против VEGF, например, бевацизумабом); предоставить рекомендации о противораковой терапии (например, противораковой терапии, включающей или не включающей антагонист VEGF); и/или выбранной подходящей терапии (например, антагонистом VEGF и/или другим антиангиогенным средством).

А. Обнаружение экспрессии гена

Генетические биомаркеры, описанные в настоящей заявке, можно обнаружить с применением любого способа, известного в данной области техники. Например, образцы ткани или клеток от млекопитающих можно легко проанализировать для определения, например, мРНК или ДНК генетического биомаркера, представляющего интерес, с применением анализа методом нозерн-блоттинга, дот-блота или полимеразной цепной реакции (ПНР), матричной гибридизации, анализа на основе защиты от РНКазы или с применением датчиков с ДНК ОНП (ДНК с однонуклеотидным полиморфизмом) для матричного анализа, которые являются коммерчески доступными, в том числе для мгновенного микроматричного анализа ДНК. Например, анализы ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), такие как количественные анализы ПЦР, хорошо известны в данной области техники. Согласно иллюстративному варианту реализации настоящего изобретения способ обнаружения мРНК генетического биомаркера, представляющего интерес, в биологическом образце, таком как образец опухоли (например, образец опухоли глиобластомы), включает получение кДНК из образца посредством обратной транскрипции с применением по меньшей мере одного праймера; амплификацию полученной таким образом кДНК; и обнаружение наличия амплифицированной кДНК. Кроме того, такие способы могут включать один или несколько этапов, позволяющих определять уровни мРНК в биологическом образце (например, посредством одновременного определения уровней последовательности мРНК сравнительного контроля - гена «домашнего хозяйства», такого как член семейства актина). Последовательность амплифицированной кДНК можно необязательно определить.

1. Обнаружение нуклеиновых кислот

Согласно одному конкретному варианту реализации настоящего изобретения экспрессию генов-биомаркеров, описанных в настоящей заявке, можно осуществить с применением технологии ПЦР-РВ. Зонды, которые применяют для ПЦР, можно пометить обнаруживаемым маркером, таким как, например, радиоактивный изотоп, флуоресцентное соединение, биолюминесцентное соединение, хемилюминесцентное соединение, хелатор металла или фермент. Такие зонды и праймеры можно применять для обнаружения наличия в образце экспрессированных генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3. Как понимает специалист в данной области техники, большое множество различных праймеров и зондов можно получить и эффективно применять для амплификации, клонирования и/или определения наличия и/или уровня экспрессии одного или нескольких из генов, представленных в Таблице 1, 2 и 3.

Другие способы включают протоколы, с помощью которых исследуют или обнаруживают мРНК по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), в образце ткани (например, ткани опухоли, например, ткани опухоли глиобластомы) или в образце клетки посредством методики микроматричного анализа. С применением микроматричного анализа нуклеиновой кислоты исследуемый и контрольный образцы мРНК из образцов исследуемой и контрольной ткани подвергают обратной транскрипции и метят для получения зондов кДНК. Затем зонды гибридизуют с любой матрицей нуклеиновых кислот, иммобилизованных на твердой подложке. Матрица сконструирована таким образом, что последовательность и положение каждого члена матрицы известны. Например, набор генов, которые характеризуются вероятностью экспрессии при определенных состояниях заболевания, может быть размещен на твердой подложке в виде матрицы. Гибридизация меченого зонда с конкретным членом матрицы свидетельствует, что данный образец, из которого был получен зонд, экспрессирует данный ген. Анализ дифференциальной экспрессии гена в тканях заболевания может предоставить ценную информацию. В микроматричной технологии применяют методики гибридизации нуклеиновой кислоты и компьютерную технологию для оценки профиля экспрессии мРНК тысяч генов в одном эксперименте (см., например, заявку WO 2001/75166). См., например, обсуждение получения матриц в патенте США №5,700,637, патенте США №5,445,934 и патенте США №5,807,522, а также в публикациях Lockart, Nature Biotechnology 14: 1675-1680 (1996); и Cheung et al., Nature Genetics 21 (Suppl): 15-19 (1999).

Кроме того, можно применять профилирование ДНК и способ обнаружения с использованием микроматричного анализа, описанный в патенте EP 1753878. Данный способ позволяет быстро обнаружить и провести различие между различными последовательностями ДНК с применением анализа коротких тандемных повторов (КТП) и микроматричного анализа ДНК. Согласно варианту реализации настоящего изобретения меченую последовательность-мишень КТП гибридизуют с микроматрицей ДНК, содержащей комплементарные зонды. Данные зонды различаются длиной, чтобы охватить диапазон возможных КТП. Меченые одноцепочечные области гибридов ДНК селективно удаляют с поверхности микроматрицы посредством послегибридизационного ферментативного расщепления. Количество повторов в неизвестной мишени вычисляют на основании схемы ДНК-мишени, которая остается гибридизованной на микроматрице.

Примером устройства для микроматричного анализа является система Affymetrix GENECHIP®, которая является коммерчески доступной и содержит матрицы, изготовленные посредством прямого синтеза олигонуклеотидов на стеклянной поверхности. Другие системы, которые можно применять, известны специалисту в данной области техники.

Другие способы определения уровня биомаркера, помимо ПЦР-РВ или других способов на основе ПЦР, включают протеомные методики, а также персонализированные генетические профили, необходимые для лечения ангиогенных нарушений на основании ответа пациента на молекулярном уровне. Специализированные микроматрицы согласно настоящей заявке, например, олигонуклеотидные микроматрицы или микроматрицы кДНК, могут содержать один или несколько биомаркеров, обладающих профилями экспрессии, которые коррелируют с чувствительностью или невосприимчивостью к одному или нескольким антителам против VEGF. Другие способы, которые также можно использовать для обнаружения нуклеиновых кислот для применения в настоящем изобретении, включают анализ высокопродуктивной экспрессии последовательности РНК, в том числе геномные анализы на основе РНК, такой как, например, RNASeq.

Множество источников доступны для получения сведений по применению вышеуказанных методик (Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); и Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)). Анализ методом нозерн-блоттинга является общепринятой методикой, хорошо известной в данной области техники и описанной, например, в руководстве Molecular Cloning, a Laboratory Manual, second edition, 1989, Sambrook, Fritch, Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 10 Skyline Drive, Plainview, NY 11803-2500. Традиционные протоколы оценки статуса генов и продуктов генов можно найти, например, в руководстве Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, в части 2 (нозерн-блоттинг), 4 (саузерн-блоттинг), 15 (иммуноблоттинг) и 18 (анализ ПЦР).

2. Обнаружение белков

Для обнаружения белков-биомаркеров, таких как белок-биомаркер, соответствующий по меньшей мере одному из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одному другому гену (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленному в Таблице 2, и/или по меньшей мере одному другому гену (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленному в Таблице 1), доступны, например, различные анализы белков, включая, например, способы на основе антител, а также масс-спектроскопию и другие аналогичные способы, известные в данной области техники. В случае способов на основе антител, например, можно осуществлять контакт образца с антителом, специфичным к указанному биомаркеру, в условиях, достаточных для образования комплекса антитело-биомаркер, а затем проводить обнаружение указанного комплекса. Обнаружение наличия белка-биомаркера можно осуществить множеством способов, таких как вестерн-блоттинг (с иммунопреципитацией или без нее), 2-мерный ДСН-ПААГ, иммунопреципитация, сортировка флуоресцентно-активированных клеток (fluorescence activated cell sorting, FACS), проточная цитометрия и процедуры ELISA для оценки большого множества тканей и образцов, включая плазму или сыворотку. Доступен широкий диапазон методик иммуноанализа с применением такого формата анализа, см., например, патенты США №№4,016,043, 4,424,279 и 4,018,653. Данные методики включают как моносайтовые, так и двухсайтовые или «сэндвич»-анализы неконкурентных типов, а также традиционные конкурентные анализы связывания. Данные анализы также включают непосредственное связывание меченого антитела с биомаркером-мишенью.

«Сэндвич»-анализы относятся к наиболее полезным и широко применяемым анализам. Существует множество вариантов методики «сэндвич»-анализа, и все они охватываются настоящим изобретением. Вкратце, в типичном прямом анализе немеченое антитело иммобилизуют на твердую подложку, и образец, исследование которого будут проводить, приводят в контакт со связанной молекулой. После соответствующего периода инкубации в течение периода времени, достаточного для образования комплекса антитело-антиген, добавляют второе антитело, специфичное к антигену, меченному репортерной молекулой, способной к образованию обнаруживаемого сигнала, и инкубируют в течение времени, достаточного для образования другого комплекса антитело - антиген - меченое антитело. Любое непрореагировавшее вещество смывают, и наличие антигена определяют посредством наблюдения сигнала, образованного репортерной молекулой. Результаты могут являться качественными, что определяют посредством простого наблюдения видимого сигнала, или могут быть определены количественно посредством сравнения с контрольным образцом, содержащим известные количества биомаркера.

Вариации прямого анализа включают одновременный анализ, в котором образец и меченое антитело добавляют одновременно к связанному антителу. Данные методики хорошо известны специалистам в данной области техники, включая любые минимальные вариации, которые будут очевидны. В традиционном прямом «сэндвич»-анализе первое антитело, обладающее специфичностью к биомаркеру, ковалентно или пассивно присоединяют к твердой подложке. Твердая подложка, как правило, представляет собой стекло или полимер, причем наиболее часто применяемыми полимерами являются целлюлоза, полиакриламид, нейлон, полистирол, поливинилхлорид или полипропилен. Твердые подложки могут находиться в форме пробирок, бусин, лунок микропланшетов или любой другой поверхности, подходящей для проведения иммуноанализа. Процессы связывания хорошо известны в данной области техники и, как правило, включают перекрестно-сшивающее ковалентное связывание или физическую адсорбцию, комплекс полимер-антитело промывают в препарате для исследуемого образца. Затем аликвоту исследуемого образца добавляют к твердофазному комплексу и инкубируют в течение достаточного периода времени (например, 2-40 минут или в течение ночи, если это более удобно) и при подходящих условиях (например, от комнатной температуры до 40°C, например, от 25°C до 32°C включительно), чтобы сделать возможным связывание любой субъединицы, присутствующей в данном антителе. После периода инкубации твердую фазу с субъединицами антител промывают, сушат и инкубируют со вторым антителом, специфичным к части биомаркера. Второе антитело связано с репортерной молекулой, которую используют для обнаружения связывания второго антитела с молекулярным маркером.

Альтернативный способ предусматривает иммобилизацию биомаркеров-мишеней в образце с последующим экспонированием иммобилизованной мишени специфичному антителу, которое может являться меченным репортерной молекулой или может не являться меченым. В зависимости от количества мишени и силы сигнала репортерной молекулы связанную мишень можно обнаружить посредством прямого мечения антителом. В качестве альтернативы, второе меченое антитело, специфичное к первому антителу, экспонируют комплексу мишень - первое антитело для образования тройного комплекса мишень - первое антитело - второе антитело. Данный комплекс обнаруживают с использованием сигнала, испускаемого репортерной молекулой. Под «репортерной молекулой» в настоящей заявке подразумевают молекулу, которая вследствие своей химической природы обеспечивает аналитически обнаруживаемый сигнал, который позволяет обнаружить антиген-связанное антитело. Наиболее часто используемыми репортерными молекулами в анализах данного типа являются ферменты, флуорофоры либо содержащие радионуклид молекулы (т.е. радиоактивные изотопы) и хемилюминесцентные молекулы.

В случае ферментного иммуноанализа фермент конъюгируют со вторым антителом, как правило, посредством глутарового альдегида или периодата. Однако, как будет легко понятно, существует большое разнообразие методик конъюгирования, которые легко доступны специалисту в данной области техники. Обычно используемые ферменты включают, среди прочих, пероксидазу хрена, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу и щелочную фосфатазу. Субстраты для применения с конкретными ферментами, как правило, выбирают для получения при гидролизе соответствующим ферментом обнаруживаемого изменения цвета. Примеры подходящих ферментов включают щелочную фосфатазу и перокисдазу. Можно также использовать флуорогенные субстраты, из которых образуется флуоресцентный продукт, а не хромогенные субстраты, указанные выше. Во всех случаях меченное ферментом антитело добавляют к комплексу первое антитело - молекулярный маркер, позволяют связываться, а затем избыток реактива вымывают. После этого к комплексу антитело - антиген - антитело добавляют раствор, содержащий подходящий субстрат. Субстрат будет реагировать с ферментом, связанным со вторым антителом, образуя качественный визуальный сигнал, который может быть дополнительно превращен в количественный, обычно спектрофотометрическим способом, с обеспечением указания количества биомаркера, присутствующего в образце. В качестве альтернативы, флуоресцентные соединения, такие как флуоресцеин и родамин, могут быть химически связаны с антителами без изменения связывающей способности последних. При активации светом определенной длины волны меченное флуорохромом антитело поглощает световую энергию, вызывая состояние возбудимости в молекуле, с последующим испусканием света характерного цвета, визуально обнаруживаемого при помощи светового микроскопа. Как и в иммуноферментном анализе, флуоресцентно меченному антителу позволяют связаться с комплексом первое антитело - молекулярный маркер. После вымывания несвязавшегося реактива оставшийся тройной комплекс экспонируют свету подходящей длины волны, наблюдаемая флуоресценция указывает на присутствие молекулярного маркера, представляющего интерес. Иммунофлуоресцентная и иммуноферментная методики хорошо разработаны в данной области техники. Однако могут быть также использованы другие репортерные молекулы, такие как радиоизотопные, хемилюминесцентные или биолюминесцентные молекулы.

В. Наборы

В настоящем изобретении также предложены наборы или изделия для применения при обнаружении биомаркеров. Такие наборы можно применять для определения того, получит ли пациент пользу от лечения антагонистом VEGF (например, антителом против VEGF, например, бевацизумабом). Данные наборы могут содержать полипептиды или полинуклеотиды, способные к определению уровня экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из генов, представленных в Таблице 3, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50 или 60 или более других генов), представленного в Таблице 2, и/или по меньшей мере одного другого гена (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 или более других генов), представленного в Таблице 1), и инструкции по применению полипептидов или полинуклеотидов для определения уровня экспрессии по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3. Если экспрессия по меньшей мере одного из генов, представленных в Таблице 1, 2 или 3, изменяется (т.е. увеличивается или уменьшается) по сравнению с эталонным уровнем или в отличие от эталонного уровня (например, см. выше), пациент может получить пользу от лечения антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF (например, бевацизумаб). Пациента можно затем проинформировать, что у него присутствует увеличенная вероятность чувствительности или восприимчивости к лечению антагонистом VEGF и/или предоставить рекомендацию, что в противораковую терапию следует включить антагонист VEGF.

Данные наборы могут содержать поддерживающее приспособление, разделенное на ячейки, плотно удерживающие один или нескольких контейнеров, таких как флаконы, пробирки и т.п., при этом каждый контейнер содержит одно из отдельных соединений или элементов, используемых в способе. Например, один из контейнеров может содержать зонд, который является обнаруживаемо меченным или может быть обнаруживаемо меченным. Такой зонд может представлять собой полипептид (например, антитело) или полинуклеотид, специфичный к белку или мРНК, соответственно. Когда в наборе применяется гибридизация нуклеиновой кислоты для обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени, такой набор может также содержать контейнеры, содержащие нуклеотид или нуклеотиды для амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, и/или контейнер, содержащий репортерное средство, такое как биотин-связывающий белок, например авидин или стрептавидин, связанный с репортерной молекулой, такой как ферментная, флуоресцентная метка или метка на основе радиоактивного изотопа.

Такой набор будет, как правило, содержать контейнер, описанный выше, и один или несколько других контейнеров, содержащих вещества, необходимые с коммерческой точки зрения и точки зрения пользователя, в том числе буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и листки-вкладыши с инструкциями по применению. Этикетка может присутствовать на контейнере для указания, что данную композицию используют для конкретного применения, и может также указывать направления для применения in vivo или in vitro, такие как применения, описанные выше.

Наборы согласно настоящему изобретению характеризуются множеством вариантов реализации. Типичный вариант реализации представляет собой набор, содержащий контейнер, этикетку на указанном контейнере и композицию, содержащуюся в указанном контейнере, причем композиция содержит первичное антитело, которое связывается с белком-биомаркером или аутоантителом-биомаркером, и этикетка на данном контейнере указывает, что композицию можно применять для оценки наличия таких белков или антител в образце, и причем набор содержит инструкции по применению антитела для оценки наличия белков-биомаркеров в конкретном типе образца. Набор может дополнительно содержать набор инструкций и веществ для получения образца и применения антитела с образцом. Набор может содержать как первичное, так и вторичное антитело, причем вторичное антитело является конъюгированным с меткой, например ферментной меткой.

Другой вариант реализации настоящего изобретения представляет собой набор, содержащий контейнер, этикетку на указанном контейнере и композицию, содержащуюся в указанном контейнере, причем композиция содержит один или несколько полинуклеотидов, которые гибиридизуются с комплементарным биомаркером, описанным в настоящей заявке, в жестких условия, и этикетка на данном контейнере указывает, что композицию можно применять для оценки наличия биомаркера, описанного в настоящей заявке, в образце, и причем набор содержит инструкции по применению полинуклеотида или полинуклеотидов для оценки наличия РНК или ДНК биомаркера в конкретном типе образца.

Другие необязательные компоненты набора включают один или несколько буферов (например, блокирующий буфер, промывочный буфер, буфер для субстрата и т.д.), другие реактивы, такие как субстрат (например, хромоген), который химически изменяют ферментной меткой, раствор для демаскировки эпитопов, контрольные образцы (положительный и/или отрицательный контроли), контрольное стекло или стекла и т.д. Наборы могут также содержать инструкции для интерпретации результатов, полученных с применением набора.

Согласно следующим конкретным вариантам реализации наборов на основе антител указанный набор может содержать, например: (1) первое антитело (например, присоединенное к твердой подложке), которое связывается с белком-биомаркером; и необязательно (2) второе отличное антитело, которое связывается с белком или с первым антителом и является конъюгированным с обнаруживаемой меткой.

В случае наборов на основе олигонуклеотидов указанный набор может содержать, например: (1) олигонуклеотид, например, обнаруживаемо меченный олигонуклеотид, который гибридизуется с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок-биомаркер, или (2) пару праймеров, пригодных для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты биомаркера. Набор может также содержать, например, буферное вещество, консервант или вещество, стабилизирующее белок. Набор может дополнительно содержать компоненты, необходимые для обнаружения обнаруживаемой метки (например, фермент или субстрат). Набор может также содержать контрольный образец или серию контрольных образцов, которые можно проанализировать и сравнить с исследуемым образцом. Каждый компонент набора может быть заключен в отдельный контейнер, и все из различных контейнеров могут находиться в одной упаковке вместе с инструкциями по интерпретации результатов анализов, проведенных с применением набора.

С. Статистика

В настоящей заявке общая форма правила прогноза состоит в определении функции одного или нескольких биомаркеров, потенциально включающих клинические ковариаты, для прогнозирования ответа или отсутствия ответа, или, в более общем смысле, в прогнозировании пользы или отсутствия пользы относительно соответствующим образом определенных клинических конечных точек.

Наиболее простая форма правила прогноза состоит в одномерной модели без ковариат, причем прогноз определяют посредством предела или порога. Такое правило можно сформулировать относительно функции Хевисайда для конкретного предела с и измерения биомаркера х, где необходимо осуществить бинарный прогноз А или В, и затем, если Н(х-с)=0, тогда прогнозируют А, если Н(х-с)=1, тогда прогнозируют В.

Выше представлен наиболее простой способ применения одномерных измерений биомаркера в прогностических правилах. Если такого простого правила достаточно, оно позволяет проводить простое выявление направления эффекта, т.е. определение того, высокие или низкие уровни экспрессии благотворны для пациента.

Данная ситуация может являться более сложной, если необходимо учитывать клинические ковариаты и/или если в многомерных прогностических правилах используют несколько биомаркеров. Представленную ситуацию иллюстрируют два гипотетических примера ниже:

Корректировка на ковариаты (гипотетический пример):

Для биомаркера X в популяции клинических исследований было установлено, что высокие уровни экспрессии связаны с худшим клиническим ответом (одномерный анализ). Более подробный анализ показал, что в популяции существует два типа клинического ответа: первая группа характеризуется худшим ответом, чем вторая группа, и в то же время экспрессия биомаркера в первой группе является, как правило, выше после введения по меньшей мере одной дозы антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, например, бевацизумаба). Анализ с корректировкой ковариат показывает, что для каждой из групп связь клинической пользы и клинического ответа является обратной, т.е. в пределах групп меньшие уровни экспрессии связаны с лучшим клиническим ответом. Общий противоположный эффект маскировался анализом типа ковариаты и анализом корректировки на ковариаты как частью изменения направления правила прогноза.

Многомерный прогноз (гипотетический пример):

Для биомаркера X в популяции клинических исследований было установлено, что высокие уровни экспрессии незначительно связаны с худшим клиническим ответом (одномерный анализ). Для второго биомаркера Y в ходе одномерного анализа было сделано аналогичное наблюдение. Комбинация X и Y показала, что хороший клинический ответ наблюдается, если уровень экспрессии обоих биомаркеров был низок. Данные результаты позволяют сформулировать правило для прогноза пользы при условии, если уровень экспрессии обоих биомаркеров находится ниже определенных пределов (функция «И» прогностической функции Хэвисайда). Для комбинированного правила простое правило в одномерном смысле больше не применимо; например, наблюдение низких уровней экспрессии X автоматически не прогнозирует лучший клинический ответ.

Данные простые примеры показывают, что правила прогноза с ковариатами и без них нельзя оценивать, исходя из одномерного уровня каждого биомаркера. Комбинация нескольких биомаркеров и потенциальная корректировка на ковариаты не позволяют проводить оценку простых связей относительно отдельных биомаркеров. Поскольку гены-маркеры, в частности, в сыворотке, можно применять в моделях прогноза с несколькими маркерами, потенциально включая другие клинические ковариаты, направление благотворного эффекта отдельного гена-маркера в таких моделях нельзя определить простым способом, и такое направление может противоречить направлению, обнаруженному в одномерных анализах, т.е. в ситуации, описанной для одного гена-маркера.

Клиницист может применять любой из нескольких способов, известных в данной области техники, для измерения эффективности конкретной схемы введения антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, например, бевацизумаба). Например, для определения размера опухоли и обнаружения любых метастазов для определения относительной эффективной восприимчивости к терапии можно применять визуализацию in vivo (например, MPT, магнитно-резонансную томографию). Режимы приема могут быть откорректированы для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, можно вводить дозу, можно вводить несколько разделенных доз в течение времени или дозу можно пропорционально уменьшить или увеличить, исходя из терапевтической ситуации.

IV. Лечение антагонистом VEGF

А. Дозы и введение

Если был выявлен пациент, который является восприимчивым или чувствительным к лечению антагонистом VEGF (например, антителом против VEGF, например, бевацизумабом), описанным в настоящей заявке, можно проводить лечение антагонистом VEGF самим по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами. Такое лечение может приводить, например, к уменьшению размера опухоли (например, размера опухоли глиобластомы) или увеличению выживаемости без прогрессирования заболевания (ВБПЗ) и/или общей выживаемости (ОВ). Более того, лечение комбинацией антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, например, бевацизумаба) и по меньшей мере одного второго лекарственного препарата или препаратов предпочтительно приводит к аддитивной, более предпочтительно синергической (или более чем аддитивной), терапевтической пользе для пациента. Предпочтительно, в данном комбинированном способе время между по меньшей мере одним введением второго лекарственного препарата и по меньшей мере одним введением антагониста согласно настоящему изобретению составляет приблизительно один месяц или менее, более предпочтительно, приблизительно две недели или менее.

Специалистам в области медицины очевидно, что точный способ введения пациенту терапевтически эффективного количества антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, например, бевацизумаба) после определения того, что данный пациент с большой вероятностью является восприимчивым к антагонисту VEGF, будет выбран по усмотрению лечащего врача. На способ введения, в том числе дозу, комбинацию с другими средствами, время и частоту введения и т.п., может влиять диагноз пациента, который с большой вероятностью является восприимчивым к такому антагонисту VEGF, а также состояние пациента и история болезни. Таким образом, даже пациенты, имеющие глиобластому, которые, согласно прогнозу, являются относительно нечувствительными к антагонисту VEGF, могут все равно получить пользу от лечения антагонистом VEGF, в особенности в комбинации с другими средствами, в том числе средствами, которые способны изменять восприимчивость пациента к указанному антагонисту.

Композиция, содержащая антагонист VEGF, будет приготовлена в состав, разделена на дозы и введена способом, соответствующим надлежащей клинической практике. Рассматриваемые в этой связи факторы включают конкретный тип глиобластомы, которую подвергают лечению (например, впервые диагностированная глиобластома или вторичная глиобластома, глиобластома пронейрального типа, глиобластома мезенхимального типа или глиобластома пролиферативного типа), конкретное млекопитающее, которое получает лечение (например, человек), клиническое состояние конкретного пациента, причину возникновения глиобластомы, область доставки средства, возможные побочные эффекты, тип антагониста, способ введения, схему введения и другие факторы, известные практикующему врачу. Эффективное количество антагониста VEGF, которое будет введено, будет определяться данными факторами.

Врач, обладающий средней квалификацией в данной области техники, может легко определить и назначить эффективное количество необходимой фармацевтической композиции в зависимости от таких факторов, как тип конкретного антагониста. Например, врач может начать с доз такого антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, например, бевацизумаба), которые используются в фармацевтической композиции на уровне, меньшем, чем требуемый для достижения предпочтительного терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозу, пока не будет достигнут предпочтительный эффект. Эффективность данной дозы или схемы лечения антагонистом можно определить, например, посредством оценки признаков и симптомов пациента с применением стандартных показателей эффективности.

В определенных примерах антагонист VEGF (например, антитело против VEGF, например, бевацизумаб) может являться единственным лекарственным препаратом, который вводят субъекту (т.е. лечение проводят в режиме монотерапии).

В определенных примерах пациент получает лечение тем же антагонистом VEGF (например, антителом против VEGF, например, бевацизумабом) по меньшей мере дважды. Таким образом, исходное и второе воздействие антагонистом VEGF осуществляют предпочтительно тем же антагонистом, и более предпочтительно все воздействия антагонистами VEGF осуществляют тем же антагонистом VEGF, т.е. лечение при первых двух воздействиях и предпочтительно при всех воздействиях осуществляют антагонистом VEGF одного типа, например, антагонистом, который связывается с VEGF, таким как антитело против VEGF, например, все воздействия осуществляют бевацизумабом.

В качестве общего предложения, эффективное количество антагониста VEGF, которое вводят парентерально за одну дозу, будет находиться в диапазоне от приблизительно 20 мг до приблизительно 5000 мг, в одной или нескольких дозах. Примеры режимов введения для антител, таких как антитела против VEGF (например, бевацизумаб), включают введение 100 или 400 мг каждые 1, 2, 3 или 4 недели или введение в дозе приблизительно 1, 3, 5, 10, 15 или 20 мг/кг каждые 1, 2, 3 или 4 недели. Например, эффективное количество антитела против VEGF (например, бевацизумаба) можно вводить в дозе 10 мг/кг каждые две недели, необязательно посредством внутривенного (в.в.) введения. В другом примере эффективное количество антитела против VEGF можно вводить в дозе 15 мг/кг каждые три недели, необязательно посредством в.в. введения. Дозу можно вводить в виде одной дозы или нескольких доз (например, 2 или 3 доз), например, инфузиями.

В некоторых случаях в зависимости от типа и тяжести заболевания дозы в диапазоне приблизительно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг) антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, например, бевацизумаба) представляют собой исходные дозы-кандидаты для введения субъекту, независимо от того, осуществляют ли одно или несколько отдельных введений или непрерывную инфузию. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предпочтительные дозы включают, например, 6 мг/кг, 8 мг/кг, 10 мг/кг и 15 мг/кг. В случае повторного или цикличного введения в течение нескольких дней или более в зависимости от состояния лечение продолжают до момента излечивания рака, который определяют способами, описанными выше, или известными в данной области техники. Однако можно применять и другие схемы введения доз. В одном примере антитело против VEGF вводят один раз в неделю, один раз в две недели или один раз в три недели в дозе, составляющей от приблизительно 6 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг, включая, но не ограничиваясь ими, 6 мг/кг, 8 мг/кг, 10 мг/кг или 15 мг/кг. Мониторинг успеха лечения в соответствии с настоящим изобретением можно легко провести с применением общепринятых методик и анализов. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения такую схему введения доз осуществляют в комбинации со схемой химиотерапии глиобластомы.

Если обеспечивают несколько воздействий антагониста VEGF, каждое такое воздействие можно осуществлять с применением того же или отличного способа введения. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения каждое воздействие осуществляют посредством внутривенного введения. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения каждое воздействие осуществляют посредством подкожного введения. Согласно еще одному варианту реализации воздействие осуществляют посредством внутривенного и подкожного введения.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антагонист VEGF (например, антитело против VEGF, например, бевацизумаб) вводят в виде медленной внутривенной инфузии вместо внутривенного струйного или болюсного введения. Например, стероид, такой как преднизолон или метилпреднизолон (например, приблизительно 80-120 мг в.в., более конкретно, приблизительно 100 мг в.в.) вводят приблизительно за 30 минут до любой инфузии антитела против VEGF. Например, антитело против VEGF, такое как бевацизумаб, вводят инфузией через специально предназначенную линию.

Для первоначальной дозы мультидозового воздействия антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, например, бевацизумаба), или для единичной дозы, если воздействие включает в себя только одну дозу, такую инфузию предпочтительно начинают при скорости приблизительно 50 мг/час. Данную скорость можно увеличить, например, при скорости увеличений приблизительно на 50 мг/час приблизительно каждые 30 минут до максимума приблизительно 400 мг/час. Однако если субъект испытывает связанную с инфузией реакцию, скорость инфузии предпочтительно уменьшают, например, до половины существующей скорости, например с 100 мг/час до 50 мг/час. Например, инфузию такой дозы антагониста VEGF (например, суммарной дозы приблизительно 1000 мг) завершают в течение приблизительно 255 минут (4 часов 15 мин.). Субъекты необязательно получают профилактическое лечение в виде ацетаминофена/парацетамола (например, приблизительно 1 г) и дифенгидрамина-HCl (например, приблизительно 50 мг или эквивалентную дозу сходного средства) перорально приблизительно за 30-60 минут до начала инфузии.

Если для достижения общего воздействия предоставляется более чем одна инфузия (доза) антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, например, бевацизумаба), в данном варианте реализации настоящего изобретения вторую или последующие инфузии антагониста VEGF начинают при более высокой скорости, чем скорость первоначальной инфузии, например, при скорости приблизительно 100 мг/час. Данную скорость можно увеличить, например, при скорости увеличений приблизительно на 100 мг/час приблизительно каждые 30 минут до максимума приблизительно 400 мг/час. Субъектам, которые испытывают связанную с инфузией реакцию, скорость инфузии предпочтительно уменьшают до половины существующей скорости, например с 100 мг/час до 50 мг/час. Предпочтительно, инфузию такой второй или последующей дозы антагониста VEGF (например, приблизительно 1000 мг суммарной дозы) завершают в течение приблизительно 195 минут (3 часов 15 минут).

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антагонист VEGF представляет собой антитело против VEGF (например, бевацизумаб), которое вводят в дозе приблизительно от 0,4 до 4 грамм, и более предпочтительно данное антитело вводят в дозе приблизительно от 0,4 до 1,3 грамм с частотой от одной до четырех доз в течение периода времени приблизительно один месяц. Еще более предпочтительно доза составляет приблизительно от 500 мг до 1,2 грамм, и согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения доза составляет приблизительно от 750 мг до 1,1 грамм. Согласно таким аспектам настоящего изобретения антагонист VEGF предпочтительно вводят в от двух до трех дозах, и/или вводят в течение периода времени приблизительно 2-3 недели.

Терапия может продолжаться до тех пор, пока терапия показана с медицинской точки зрения, или до достижения желаемого терапевтического эффекта (например, описанного в настоящей заявке). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения терапию продолжают в течение 1 месяца, 2 месяцев, 4 месяцев, 6 месяцев, 8 месяцев, 10 месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет, 4 лет, 5 лет или в течение периода времени от года до продолжительности жизни субъекта.

Однако, как указано выше, данные предложенные количества антагониста VEGF являются, в большей степени, предметом терапевтической прозорливости. Ключевым фактором при выборе соответствующей дозы и режима является полученный результат, как указано выше. Согласно некоторым вариантам реализации антагонист VEGF вводят как можно быстрее после первого признака, диагноза, появления или возникновения глиобластомы.

1. Пути введения

Антагонист VEGF (например, антитело против VEGF, например, бевацизумаб) можно вводить любыми подходящими способами, включая парентеральное, местное, подкожное, интраперитонеальное, внутрилегочное, интраназальное и/или внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное или подкожное введение. Также предусмотрено интратекальное введение. Кроме того, антагонист VEGF можно подходящим образом ввести посредством пульсирующей инфузии, например, понижающихся доз антагониста VEGF. Наиболее предпочтительно дозу вводят посредством внутривенных инъекций.

Если обеспечивают несколько воздействий антитела против VEGF, каждое воздействие можно осуществлять с применением того же или отличного способа введения. Воздействие осуществляют посредством внутривенного (в.в.) введения. Например, антитело против VEGF, такое как бевацизумаб, можно вводить посредством инфузии через специально предназначенную линию. Например, антитело против VEGF, такое как бевацизумаб, можно вводить вначале внутривенно в течение приблизительно 90 минут с последующими инфузиями в течение приблизительно 60 минут, а затем в течение приблизительно 30 минут. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения каждое воздействие осуществляют посредством подкожного (п.к.) введения. Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения воздействия осуществляют посредством в.в. и п.к. введения.

Помимо введения антагонистов VEGF пациенту традиционными путями, как указано выше, настоящее изобретение включает введение посредством генной терапии. См., например, заявку WO 1996/07321 относительно применения генной терапии для образования внутриклеточных антител.

Существует два основных подхода введения нуклеиновой кислоты (необязательно содержащейся в векторе) в клетки пациента: in vivo и ex vivo. Для доставки in vivo нуклеиновую кислоту непосредственно инъецируют пациенту, обычно в участок, в котором требуется антагонист. Для лечения ex vivo клетки пациента выделяют, нуклеиновую кислоту вводят в данные выделенные клетки, и модифицированные клетки вводят пациенту непосредственно или, например, инкапсулированными в пористых мембранах, которые имплантируют пациенту (см., например, патенты США №№4,892,538 и 5,283,187). Существует множество методик, доступных для введения нуклеиновых кислот в жизнеспособные клетки. Методики изменяются в зависимости от того, переносят ли нуклеиновую кислоту в культивированные клетки in vitro или в клетки предназначенного хозяина in vivo. Методики, подходящие для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro, включают применение липосом, электропорацию, микроинъекцию, слияние клеток, DEAE-декстран, способ кальций-фосфатного осаждения и т.д. Обычно используемый вектор для доставки гена ex vivo представляет собой ретровирус.

Предпочтительные в настоящее время способы переноса нуклеиновой кислоты in vivo включают трансфекцию векторами вирусов (таких как аденовирус, вирус простого герпеса I или аденоассоциированный вирус) и системы на основе липидов (полезными липидами для липид-опосредованного переноса гена являются, например, DOTMA, DOPE и DC-Chol). В некоторых ситуациях желательно обеспечить источник нуклеиновой кислоты средством, специфичным к клеткам-мишеням, таким как антитело, специфичное к белку поверхности клеточной мембраны на клетке-мишени, лиганд рецептора на поверхности клетки-мишени и т.д. Если используют липосомы, для нацеливания и/или облегчения поглощения могут быть использованы белки, которые связываются с белком поверхности клеточной мембраны, связанным с эндоцитозом, например, капсидные белки или их фрагменты, тропные в отношении конкретного типа клетки, антитела для белков, которые подвергаются интернализации в клеточном цикле, и белки, которые нацелены на внутриклеточную область и увеличивают внутриклеточный период полужизни. Методика рецептор-опосредованного эндоцитоза описана, например, в публикациях Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987); и Wagner et al., PNAS USA 87: 3410-3414 (1990). Маркирования гена и протоколы генной терапии приведены, например, в публикациях Anderson etal, Science 256: 808-813 (1992) и WO 1993/25673.

2. Комбинированная терапия

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антагонист VEGF (например, антитело против VEGF, например, бевацизумаб) можно применять в комбинации с одним или несколькими дополнительными противораковыми средствами или вариантами терапии. Примеры вариантов противораковой терапии включают, без ограничения, хирургию, радиационную терапию (лучевую терапию), биотерапию, иммунотерапию, химиотерапию (например, темозоломидом (ТМЗ)) или комбинацию указанных вариантов терапии. Кроме того, цитотоксические средства, антиангиогенные и антипролиферативные средства можно применять в комбинации с антителом против VEGF. Одно или несколько дополнительных противораковых средств или вариантов терапии предпочтительно обладают комплементарными активностями с антагонистом VEGF, так что данные средства не оказывают нежелательного эффекта друг на друга. Комбинированное введение включает совместное введение с применением отдельных составов или одного фармацевтического состава, и последовательное введение в любом порядке, причем предпочтительно существует период времени, когда оба (или все) активные средства одновременно проявляют свои биологические активности.

Одно или несколько дополнительных противораковых средств могут представлять собой химиотерапевтическое средство, цитотоксическое средство, цитокин, средство, ингибирующее рост, противогормональное средство и комбинации указанных средств. Такие молекулы соответствующим образом присутствуют в комбинации в количествах, являющихся эффективными для достижения поставленной цели. Фармацевтическая композиция, содержащая антагонист VEGF (например, антитело против VEGF, например, бевацизумаб) может также содержать терапевтически эффективное количество противоопухолевого средства, химиотерапевтического средства, средства, ингибирующего рост, цитотоксического средства или комбинации указанных средств.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения первое соединение представляет собой антитело против VEGF, и по меньшей мере одно дополнительное соединение представляет собой терапевтическое антитело, отличное от антитела против VEGF. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одно дополнительное соединение представляет собой антитело, которое связывается с маркером поверхности раковой клетки. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одно дополнительное соединение представляет собой антитело против HER2, трастузумаб (например, Herceptin®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одно дополнительное соединение представляет собой антитело против HER2, пертузумаб (Omnitarg™, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, см. патент США №6,949,245). Согласно варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одно дополнительное соединение представляет собой антитело («голое» антитело или ADC, antibody drug conjugate, конъюгат антитела с лекарственным препаратом), и дополнительное антитело представляет собой второе, третье, четвертое, пятое, шестое антитело или более, таких, что комбинация такого второго, третьего, четвертого, пятого, шестого или более антител («голого антитела» или ADC) является эффективной для лечения ангиогенного нарушения.

Другие схемы лечения согласно настоящему изобретению могут включать введение противоракового средства и, без ограничения, лучевую терапию и/или трансплантацию костного мозга и периферической крови, и/или введение цитотоксического средства, химиотерапевтического средства или средства, ингибирующего рост. Согласно одному из таких вариантов реализации настоящего изобретения химиотерапевтическое средство представляет собой средство или комбинацию средств, таких как, например, циклофосфамид, гидроксидаунорубицин, адриамицин, доксорубицин, винкристин (ONCOVIN™), преднизолон, CHOP, CVP или СОР, или иммунотерапевтические средства, такие как антитела против PSCA, антитела против HER2 (например, HERCEPTIN®, OMNITARG™). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения комбинация содержит доцетаксел, доксорубицин и циклофосфамид. Комбинированную терапию можно вводить в одновременном или последовательном режиме. При последовательном введении комбинацию можно вводить в ходе двух или более двух введений. Комбинированное введение включает совместное введение с применением отдельных составов или единого фармацевтического состава и последовательное введение в любом порядке, причем предпочтительно существует период времени, когда оба (или все) активные средства одновременно проявляют свои биологические активности.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения лечение антагонистом VEGF (например, антителом против VEGF) включает комбинированное введение противоракового средства, указанного в настоящей заявке, и одного или нескольких химиотерапевтических средств или средств, ингибирующих рост, в том числе совместное введение коктейлей различных химиотерапевтических средств. Химиотерапевтические средства включают таксаны (такие как паклитаксел и доцетаксел) и/или антрациклиновые антибиотики. Получение и схема приема таких химиотерапевтических средств могут соответствовать инструкциям производителя или могут быть определены опытным путем специалистом-практиком. Получение и схема приема препарата для такой химиотерапии также описаны в руководстве "Chemotherapy Service," (1992) Ed., М.С. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md.

Подходящие дозы любого из вышеуказанных средств, которые вводят совместно, являются таковыми, которые применяют в настоящее время, и могут быть уменьшены в связи с комбинированным действием (синергией) антагониста VEGF и других химиотерапевтических средств или вариантов лечения.

Комбинированная терапия может обеспечивать «синергию» и быть «синергической», т.е. достигаемый эффект при совместном использовании активных компонентов является большим по сравнению с суммой эффектов, обеспечиваемых с использованием соединений по отдельности. Синергический эффект можно обеспечить, когда активные компоненты: (1) совместно приготавливают в состав и вводят или доставляют одновременно в комбинированной единичной лекарственной форме; (2) вводят поочередно или параллельно в виде отдельных составов или (3) вводят по другой схеме. При введении поочередно синергический эффект можно обеспечить, если соединения вводят или доставляют последовательно, например, с помощью разных инъекций в отдельных шприцах. В основном, во время поочередной терапии эффективную дозу каждого активного компонента вводят последовательно, т.е. поочередно, тогда как в комбинированной терапии эффективные дозы двух или нескольких активных компонентов вводят совместно.

Как правило, для предотвращения или лечения заболевания соответствующая доза дополнительного терапевтического средства будет зависеть от типа заболевания, которое подвергают лечению, типа антитела, тяжести и течения заболевания, от того, вводят ли антагонист VEGF (например, антитело против VEGF, например, бевацизумаб) и дополнительное средство (например, ТМЗ) для профилактических или терапевтических целей, от предшествующей терапии, клинической истории пациента и ответа на антагонист VEGF и дополнительное средство, а также от усмотрения лечащего врача. Антагонист VEGF и дополнительное средство соответствующим образом вводят пациенту единовременно или в ходе серии введений. Антагонист VEGF, как правило, вводят, как указано выше. В зависимости от типа и тяжести заболевания исходные дозы-кандидаты дополнительного средства для введения пациенту составляют от приблизительно 20 мг/м² до 600 мг/м², будь то введение, например, посредством одного или нескольких отдельных введений или посредством непрерывной инфузии. Типичная суточная доза может варьировать от приблизительно или приблизительно 20 мг/м², 85 мг/м², 90 мг/м², 125 мг/м², 200 мг/м², 400 мг/м², 500 мг/м² или более в зависимости от факторов, указанных выше. Для повторяемых введений в течение нескольких дней или дольше в зависимости от состояния лечение продолжают до возникновения желаемого подавления симптомов заболевания. Таким образом, пациенту можно вводить одну или несколько доз, составляющих приблизительно 20 мг/м², 85 мг/м², 90 мг/м², 125 мг/м², 200 мг/м², 400 мг/м², 500 мг/м², 600 мг/м² (или любую комбинацию указанных доз). Такие дозы можно вводить периодически, например, каждую неделю или каждые две, три недели, четыре, пять или шесть недель (например, так, что пациент получает от приблизительно двух до приблизительно двадцати, например, приблизительно шесть доз дополнительного средства). Можно вводить исходную большую насыщающую дозу, после которой следуют одна или несколько меньших доз. Однако могут быть пригодными и другие режимы введения. Прогресс данной терапии легко контролировать с помощью общепринятых методик и анализов.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъекту никогда ранее не вводили какой-либо лекарственный препарат или препараты для лечения глиобластомы. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъекту или пациенту ранее вводили один или несколько лекарственных препаратов для лечения глиобластомы. Согласно следующему варианту реализации настоящего изобретения субъект или пациент был не восприимчивым к одному или нескольким лекарственным препаратам, которые вводили ему ранее. Такие лекарственные препараты, к которым субъект может быть невосприимчивым, включают, например, противоопухолевые средства, химиотерапевтические средства, цитотоксические средства и/или средства, ингибирующие рост. Более конкретно, лекарственные препараты, к которым субъект может быть невосприимчивым, включают антагонисты VEGF, такие как антитела против VEGF (например, бевацизумаб). Согласно следующему аспекту настоящего изобретения такие антагонисты VEGF включают антитело или иммуноадгезин, вследствие чего предполагается повторное лечение одним или несколькими антителами или иммуноадгезинами, к которым субъект был ранее не восприимчивым.

В. Антагонист VEGF

Во всех данных способах, изложенных в настоящей заявке, антагонист VEGF может представлять собой антитело против VEGF.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело против VEGF может представлять собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в патенте США №4,816,567; и публикации Morrison et al., PNAS USA, 81: 6851-6855 (1984)). В одном примере химерное антитело содержит вариабельную область, отличную от вариабельной области человека (например, вариабельную область, полученную от мыши, крысы, хомяка, кролика или нечеловекообразного примата, такого как обезьяна), и константную область человека. В следующем примере химерное антитело представляет собой антитело «с переключенным классом», в котором класс или подкласс были изменены по сравнению с родительским антителом. Химерные антитела включают антиген-связывающие фрагменты указанных антител.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело против VEGF может представлять собой гуманизированное антитело. Как правило, антитело, отличное от антитела человека, гуманизируют для уменьшения иммуногенности по отношению к людям с сохранением специфичности и аффинности родительского антитела, отличного от антитела человека. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или несколько вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR (или их части), получены из антитела, отличного от антитела человека, и FR (или их части) получены из последовательностей антитела человека. Гуманизированное антитело необязательно будет также содержать по меньшей мере часть константной области человека. Согласно некоторым вариантам реализации некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменяют соответствующими остатками антитела, отличного от антитела человека (например, антитела, из которого получены остатки HVR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела. Обзор гуманизированных антител и способов их получения представлен, например, в публикации Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008), а также, например, в публикациях Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); патентах США №№5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 и 7,087,409; публикациях Kashmiri et al., Methods 36: 25-34 (2005) (описана трансплантация SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991) (описано «изменение поверхности»); Dall'Acqua et al., Methods 36: 43-60 (2005) (описана «перетасовка FR»); и Osbourn et al., Methods 36: 61-68 (2005) и Klimka et al., Br. J. Cancer, 83: 252-260 (2000) (описан подход «управляемой селекции» при перетасовке FR).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело против VEGF может представлять собой антитело человека. Антитела человека можно получить с применением различных методик, известных в данной области техники. Антитела человека описаны в общем виде в публикациях van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008). Антитела человека можно получить посредством введения иммуногена трансгенному животному, которое было модифицировано для образования интактных антител человека или интактных антител с вариабельными областями человека в ответ на антигенный стимул. Такие животные, как правило, содержат все локусы иммуноглобулинов человека или их часть, которые замещают эндогенные локусы иммуноглобулинов, или которые присутствуют экстрахромосомно или случайным образом встраиваются в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей эндогенные локусы иммуноглобулинов, как правило, инактивированы. Обзор способов получения антител человека из трансгенных животных см. в публикации Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005). См. также, например, патенты США №№6,075,181 и 6,150,584, в которых описана технология XENOMOUSE™; патент США №5,770,429, в котором описана технология HUMAB®; патент США №7,041,870, в котором описана технология K-М MOUSE®, и публикацию заявки на патент США №US 2007/0061900, в которой описана технология VELOCIMOUSE®). Вариабельные области человека из интактных антител, созданных с помощью таких животных, можно затем модифицировать, например, посредством объединения с отличной константной областью человека. Антитела человека можно также получать способами на основе гибридомы. Были описаны линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека для получения моноклональных антител человека. (См., например, публикации Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Антитела человека, созданные благодаря гибридомной технологии с использованием В-клеток человека, также описаны в публикации Li et al., PNAS USA, 103: 3557-3562 (2006). Дополнительные способы включают способы, описанные, например, в патенте США №7,189,826 (описано получение моноклональных антител человека класса IgM за счет линий гибридомных клеток) и в публикации Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4): 265-268 (2006) (описаны гибридомы человек-человек). Технология получения гибридом человека (технология Trioma) также описана в публикациях Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3): 927-937 (2005) и Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (3): 185-91 (2005).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело против VEGF может быть выделено или было выделено посредством скрининга комбинаторных библиотек антител с желаемой активностью или активностями. Например, в данной области техники известен ряд способов создания библиотек фагового дисплея и скрининга таких библиотек для обнаружения антител, обладающих желаемыми характеристиками связывания. Такие способы рассматриваются, например, в публикациях Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001), а также описаны, например, в публикациях McCafferty et al., Nature 348: 552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340 (5): 1073-1093 (2004); Fellouse, PNAS USA 101 (34): 12467-12472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132( 2004).

В некоторых методах фагового дисплея репертуар генов VH и VL клонируют отдельно с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР) и рекомбинируют случайным образом в библиотеки фагов, которые затем можно подвергнуть скринингу для обнаружения антиген-связывающего фага, как описано в публикации Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Фаги обычно экспонируют фрагменты антител в виде одноцепочечных Fv(scFv)-фрагментов либо Fab-фрагментов. Библиотеки на основе иммунизированных источников позволяют получать антитела с высокой аффинностью к иммуногену без необходимости конструирования гибридом. В качестве альтернативы, можно клонировать репертуар генов из «наивного» (неиммунизированного) источника (например, человека) для обеспечения одного источника антител против широкого ряда антигенов, не являющихся аутоантигенами, а также аутоантигенов без какой-либо иммунизации, как описано в публикации Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Наконец, библиотеки на основе неиммунизированных источников можно также получать синтетическим путем посредством клонирования сегментов V-генов из стволовых клеток, которые не подверглись реаранжировке, и использования праймеров, содержащих случайную последовательность, для ПЦР, чтобы кодировать в высокой степени вариабельные CDR3-участки и завершить реаранжировку in vitro, как описано в публикации Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Патенты и публикации заявок на патенты, в которых описываются библиотеки антител человека в фагах, включают, например, патент США №5,750,373 и публикации патентов США №№2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела против VEGF, которые можно применять в способах согласно настоящему изобретению, включают любое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которое связывается с достаточной аффинностью и специфичностью с VEGF и может уменьшать или ингибировать биологическую активность VEGF. Антитело против VEGF обычно не будет связываться с другими гомологами VEGF, такими как VEGF-B или VEGF-C, и другими факторами роста, такими как PlGF , PDGF или bFGF. Например, согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения антитела против VEGF включают, но не ограничены ими, моноклональное антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело против VEGF А4.6.1, наработанное гибридомой АТСС НВ 10709; рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против VEGF, полученное согласно публикации Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитело против VEGF представляет собой бевацизумаб (BV или Bev), также известное как «rhuMAb VEGF» или «AVASTTN®». Данное антитело содержит мутантные каркасные области IgG1 человека и антиген-связывающие области, определяющие комплементарность, моноклонального антитела А.4.6.1 мыши против чVEGF , которое блокирует связывание VEGF человека с рецепторами VEGF. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, включая большинство каркасных областей, получено из IgG1 человека, и приблизительно 7% последовательности получено из антитела мыши А4.6.1. Бевацизумаб и другие гуманизированные антитела против VEGF описаны в патенте США №6,884,879, выданном 26 февраля 2005 г. Дополнительные антитела включают антитела серии G6 или В20 (например, G6-31, В20-4.1), описанные в публикации РСТ №WO 2005/012359, публикации РСТ №WO 2005/044853 и заявке на патент США 60/991,302, содержание которых явным образом включено в настоящую заявку посредством ссылки. Информацию о дополнительных антителах см. в патентах США №№7,060,269, 6,582,959, 6,703,020; 6,054,297; заявках WO 98/45332; WO 96/30046; WO 94/10202; EP 0666868 В1; публикациях заявок на патент США №№2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409 и 20050112126; и в публикации Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288: 149-164 (2004). Другие антитела включают антитела, которые связываются с функциональным эпитопом на VEGF человека, содержащим остатки F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I191, K101, Е103 и С104 или, в качестве альтернативы, содержащим остатки F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 и Q89.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело против VEGF, которое можно применять в любом из способов, описанных в настоящей заявке, может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую следующую аминокислотную последовательность:

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR (SEQ ID NO: 1),

и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую следующую аминокислотную последовательность:

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 2).

Антитело против VEGF согласно настоящей заявке может представлять собой химерное, гуманизированное антитело или антитело человека и может, например, представлять собой бевацизумаб.

Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения антитело против VEGF может являться неконъюгированным, таким как «голое» антитело против VEGF, или может являться конъюгированным с другой молекулой для улучшения эффективности, например, для увеличения периода полужизни.

V. Фармацевтические составы

Терапевтические составы антагонистов, применяемых в соответствии с настоящим изобретением, получают для хранения посредством смешивания антагониста, характеризующегося желаемой степенью чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами в виде лиофилизованных препаратов или водных растворов. Общую информацию относительно составов см., например, в руководствах Gilman et al., (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; A. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (1990), Mack Publishing Co., Eastori, Pennsylvania.; Avis et al., (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman et al., (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York; и Lieberman et al., (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York, Kenneth A. Walters (ed.) (2002) Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119, Marcel Dekker.

Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадециддиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабены; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннитол, трегалоза или сорбитол; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Иллюстративные препараты антитела против VEGF описаны в патенте США №6,884,879. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения антитела против VEGF приготавливают в состав в концентрации 25 мг/мл во флаконе для однократного применения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 100 мг антитела против VEGF приготавливают в состав в 240 мг дигидрата α,α-трегалозы, 23,2 мг фосфата натрия (одноосновный, моногидрат), 4,8 мг фосфата натрия (двухосновный безводный), 1,6 мг полисорбата 20 и в воде для инъекций качества согласно фармакопее США. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 400 мг антитела против VEGF приготавливают в состав в 960 мг дигидрата α,α-трегалозы, 92,8 мг фосфата натрия (одноосновный, моногидрат), 19,2 мг фосфата натрия (двухосновный безводный), 6,4 мг полисорбата 20 и в воде для инъекций качества согласно фармакопее США.

Лиофилизованные препараты, приспособленные для подкожного введения, описаны, например, в патенте США №6,267,958. Такие лиофилизованные препараты можно восстановить с использованием подходящего разбавителя до высокой концентрации белка, и восстановленный препарат можно ввести подкожно млекопитающему, которое будет получать лечение согласно настоящему изобретению.

Кристаллические формы антагониста также предусмотрены. См., например, заявку US 2002/0136719 А1.

Состав согласно настоящему изобретению также может содержать более одного активного компонента (второго лекарственного препарата, как указано выше), предпочтительно, таких компонентов, дополняющая активность которых не будет оказывать неблагоприятного влияния друг на друга. Тип и эффективные количества таких лекарственных препаратов зависят, например, от количества и типа антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, например, бевацизумаба), присутствующего в составе, и клинических параметров субъектов. Предпочтительные из таких вторых лекарственных препаратов указаны выше.

Активные компоненты также можно заключить в микрокапсулы, полученные, например, методами коацервации или путем межфазной полимеризации, например, микрокапсулы гидроксиметилцеллюлозы или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы, соответственно, в виде коллоидных систем доставки лекарственных препаратов (например, липосомы, микросферы альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в виде макроэмульсий. Такие способы описаны в руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Могут быть получены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антагонист, в которых матрицы находятся в виде сформованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поли(виниловый спирт)), полиактиды (патент США №3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразлагаемый этилен-винилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (микросферы для инъекций, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и леупролидацетата) и поли-D-(-)-3-гидроксибутановую кислоту.

Препараты, предназначенные для применения in vivo, должны быть стерильными. Стерилизацию можно легко обеспечить посредством фильтрования через стерильные фильтрующие мембраны.

Примеры

Следующие примеры приведены для иллюстрации, но не ограничения настоящего заявленного изобретения.

Пример 1. Статистические методы и микроматричный анализ

Статистические методы

Статистические задачи могут, как правило, включать следующие этапы:

- 1. Предварительный отбор биомаркеров-кандидатов

- 2. Предварительный отбор значимых клинических прогностических ковариат ответа эффективности

- 3. Выбор прогностических функций биомаркера на одномерном уровне

- 4. Выбор прогностических функций биомаркера, включая клинические ковариаты, на одномерном уровне

- 5. Выбор прогностических функций биомаркера на многомерном уровне

- 6. Выбор прогностических функций биомаркера, включая клинические ковариаты, на многомерном уровне

Ниже подробнее описаны различные этапы:

1. Предварительный отбор биомаркеров-кандидатов

Статистический предварительный отбор биомаркеров-кандидатов ориентирован на степень связи с измерением клинической пользы. С данной целью различные клинические результаты можно преобразовать в производные косвенные показатели, как, например, ранговое отнесение степени показателей клинической пользы относительно ТТР (time to disease progression, время до прогрессирования заболевания), при котором можно избежать цензурированных наблюдений. Данные косвенные преобразованные измерения можно легко использовать для простого анализа корреляции, например, посредством подхода на основе непараметрического коэффициента ранговой корреляции Спирмена. В качестве альтернативы, измерения биомаркера можно использовать в качестве метрических ковариат в регрессионных моделях времени до наступления события, как, например, в методе пропорциональной регрессии рисков Кокса. В зависимости от статистического распределения значений биомаркера на данном этапе может потребоваться некоторая предварительная обработка данных, такая как, например, преобразования, стабилизирующие дисперсию, и использование соответствующих шкал или, в качестве альтернативы, этап стандартизации, такой как применение процентилей вместо необработанных измерений. Следующий подход заключается в анализе двумерных диаграмм разброса данных, например, посредством отображения разброса (ось x = значение биомаркера, ось y = измерение клинической пользы) для одного пациента. Определенную непараметрическую линию регрессии, которая достигается, например, посредством сглаживания сплайнами, можно использовать для визуализации связи биомаркера и клинической пользы.

Целью данных различных подходов является предварительный отбор биомаркеров-кандидатов, демонстрирующих определенную связь с клинической пользой в по меньшей мере одном из использованных измерений пользы, если результаты других измерений не являются противоречащими. Если доступны контрольные группы, тогда различия в связи биомаркеров с клинической пользой в различных группах могут свидетельствовать о дифференциальном прогнозе, что делает биомаркер или биомаркеры приемлемыми для дальнейшего рассмотрения.

2. Предварительный отбор значимых клинических прогностических ковариат ответа эффективности

Статистический предварительный отбор клинических ковариат, как определено в настоящей заявке, предполагает подходы предварительного отбора биомаркеров, а также ориентирован на степень связи с измерениями клинической пользы. Следовательно, в данном подходе, в принципе, применяют те же способы, которые рассматривались в п. 1 выше. Помимо статистического критерия, для предварительного отбора значимых клинических ковариат можно применять критерий клинического опыта и теоретические знания.

Прогностическая ценность клинических ковариат может влиять на прогностическую ценность биомаркеров. При необходимости ковариаты следует рассматривать для уточнения прогностических правил.

3. Выбор прогностических функций биомаркера на одномерном уровне

Термин «прогностическая функция» будет использован в общем смысле для обозначения численной функции измерения биомаркера, которая позволяет получить числовую ось и которая предполагает целевой прогноз.

Простой пример представляет собой выбор функции Хевисайда для конкретного предела с и измерения биомаркера х, где необходимо осуществить бинарный прогноз A или B, затем, если Н(х-с)=0, тогда прогнозируют A, если H(х-с)=1, тогда прогнозируют В.

Выше представлен с большой вероятностью наиболее распространенный способ использования измерений одномерного биомаркера в прогностических правилах. Определение «прогностической функции», как указано выше, включает направление на существующее множество обучающих данных, которые можно применять для изучения возможностей прогнозирования. Для достижения подходящего предела с из обучающего множества можно применять различные пути. Во-первых, для определения предела можно применять диаграмму разброса данных со сглаживающим сплайном, упомянутым в п. 1. В качестве альтернативы, можно выбрать некоторый процентиль распределения, например, медиану или квартиль. Пределы можно также систематически получить посредством исследования всех возможных пределов согласно их прогностическому потенциалу относительно измерений клинической пользы. Затем данные результаты можно отложить на графике для возможности проведения ручного выбора или применения определенных алгоритмов поиска оптимальности. Данный процесс можно осуществить на основании определенных клинических результатов с применением модели Кокса, в которой биомаркер используют в качестве бинарной ковариаты в каждом пределе теста. Затем результаты для клинических конечных точек можно рассматривать совместно для выбора предела, который демонстрирует прогноз, согласующийся с обеими конечными точками.

Другой малораспространенный подход для выбора прогностической функции может быть основан на регрессионной модели Кокса с фиксированными параметрами, полученной от обучающего множества, со значениями биомаркера (возможно, преобразованными) в качестве ковариаты. Другая возможность заключается в принятии решения на основании определенного соотношения вероятности (или его монотонном преобразовании), в котором целевые плотности вероятности предопределены в обучающем множестве для разделения прогностических состояний. Затем биомаркер подставляют в определенную функцию прогностического критерия.

4. Выбор прогностических функций биомаркера, включая клинические ковариаты, на одномерном уровне

«Одномерный» означает применение только одного биомаркера - относительно клинических ковариат, это может быть многомерная модель. Данный подход предполагает поиск без клинических ковариат, кроме случаев, когда данные способы должны позволить включение информации о значимой ковариате. Способ диаграмм разброса данных для выбора предела делает возможным только ограниченное использование ковариат, например, бинарная ковариата может быть обозначена на графике цветом. Если анализ основан на определенном регрессионном подходе, тогда использование ковариат (также многих из них одновременно) обычно облегчается. Поиск предела на основании модели Кокса, описанной в п. 3 выше, позволяет легко включать ковариаты и посредством этого приводит к скорректированному на ковариаты одномерному поиску предела. Корректировку на ковариаты можно осуществить посредством введения ковариат в модели или посредством включения в стратифицированный анализ.

Другие варианты выбора прогностических функций также позволяют включение ковариат.

Данный процесс имеет прямое значение для выбора модели Кокса в качестве прогностической функции. Данный процесс включает возможность оценить влияние ковариат на уровень взаимодействия, что означает, что, например, для различных возрастных групп применяют различные прогностические критерии.

Для типа соотношения вероятности прогностических функций необходимо оценивать плотности вероятности, включая ковариаты. С данной целью можно применять методологию многомерного распознавания образа либо значения биомаркера можно откорректировать посредством множественной регрессии на ковариаты (перед оценкой плотности).

С данной целью можно применять технологию CART (Classification and Regression Trees; Breiman et al. (Wadsworth, Inc.: New York, 1984), «деревья регрессии и классификации») посредством использования биомаркера (необработанный измеренный уровень) и клинических ковариат и измерения клинической пользы в качестве ответа. После выбора пределов будет найден тип функции «дерева решений», включающий ковариаты для прогнозирования. Пределы и алгоритмы, выбранные посредством CART, часто близки к оптимальным и могут быть объединены и унифицированы посредством рассмотрения различных измерений клинической пользы.

5. Выбор прогностических функций биомаркера на многомерном уровне

Если существует несколько биомаркеров-кандидатов, которые сохраняют свой прогностический потенциал в пределах различных вариантов выбора одномерных прогностической функции, тогда следующего усовершенствования можно достичь посредством комбинаций биомаркеров, т.е., рассматривая многомерные прогностические функции.

На основании простой модели функции Хевисайда комбинации биомаркеров можно оценивать, например, посредством рассмотрения двумерных диаграмм разброса данных значений биомаркера, в которых указаны оптимальные пределы. Затем можно обеспечить комбинацию биомаркеров посредством объединения различных функций Хевисайда с применением логических операторов «И» и «ИЛИ» для улучшения прогнозирования.

С данной целью можно применять технологию CART, используя множество биомаркеров (необработанный измеренный уровень) и измерение клинической пользы в качестве ответа, для достижения пределов для биомаркеров и функций типа «дерева решений» для прогнозирования. Пределы и алгоритмы, выбранные CART, часто близки к оптимальным и могут быть объединены и унифицированы посредством рассмотрения различных измерений клинической пользы.

Регрессию Кокса можно использовать на различных уровнях. Первый способ заключается во включении множества биомаркеров в рамках бинарного способа (т.е. на основании функций Хевисайда с определенными пределами). Второй вариант заключается в использовании биомаркеров в рамках метрического способа (после соответствующих преобразований) или смеси бинарного и метрического подходов. Развитие многомерной прогностической функции соответствует типу Кокса, как описано в п. 3 выше.

Подход многомерного соотношения вероятности сложно реализовать, но данный подход представляет другой вариант для многомерных прогностических функций.

6. Выбор прогностических функций биомаркера, включая клинические ковариаты, на многомерном уровне

Если существуют значимые клинические ковариаты, тогда следующего усовершенствования можно достичь посредством объединения множества биомаркеров с множеством клинических ковариат. Различные варианты выбора прогностической функции будут оценены в отношении возможностей включения клинических ковариат.

На основании простых логических комбинаций функций Хевисайда для биомаркеров дополнительные ковариаты могут быть включены в прогностическую функцию на основании регрессионной логистической модели, полученной в обучающем множестве.

Технологию CART и развивающиеся «деревья решений» можно легко использовать вместе с дополнительными ковариатами, которые будут включены в алгоритм прогнозирования.

Во всех прогностических функциях на основании регрессии Кокса можно использовать дополнительные клинические ковариаты. Существует вариант для оценки влияния ковариат на уровень взаимодействия, что означает, что, например, для различных возрастных групп применяют различные прогностические критерии.

Подход многомерного соотношения вероятности напрямую не расширяется для использования дополнительных ковариат.

Микроматричный анализ

Все этапы анализа осуществляли с применением общедоступного языка программирования R (R Core Team (2013) R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). Необработанные данные от всех микроматриц Affymetrix нормировали к общему эталонному распределению с применением пакета программ RefPlus R (Harbron et al. Bioinformatics. 23 (18): 2493-2494, 2007).

Пример 2. Исследование AvaGlio

В исследовании AvaGIio проводили оценку эффективности и безопасности бевацизумаба в комбинации с темозоломидом и лучевой терапией при впервые диагностированной глиобластоме. Данное исследование было разработано как проспективное рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование III фазы бевацизумаба совместно с химиотерапией по сравнению с химиотерапией самой по себе. Для соответствия критериям включения у пациентов должна была наблюдаться впервые диагностированная глиобластома с диагнозом ткани, который был установлен после хирургической резекции или биопсии. Посредством добавления бевацизумаба к химиотерапии и лучевой терапии в исследовании AvaGlio ставилась цель улучшить общее выживание (ОВ) и выживание без прогрессирования заболевания (ВБПЗ) для данной группы пациентов, которые характеризовались ограниченными возможными методами лечения и в особенности неблагоприятным прогнозом. Первичная цель состояла в сравнении ОВ и ВБПЗ пациентов, рандомизированных в группу темозоломида (ТМЗ) самого по себе и лучевой терапии, или в группу темозоломида и лучевой терапии в сочетании с бевацизумабом.

Обзор исследования AvaGlio

Данное исследование состояло из трех фаз (совместное введение, поддержание и монотерапия) и двух (2) групп лечения: ТМЗ и лучевой терапии (Группа 1) и ТМЗ и лучевой терапии в сочетании с бевацизумабом (Группа 2). Пациентов случайным образом распределяли (в соотношении 1:1) в каждую группу.

Группа 1 (химиотерапия и лучевая терапия сами по себе): Соответствующие критериям включения пациенты получали 2 Gy лучевой терапии 5 дней в неделю в течение 6 недель и 75 мг/м² ТМЗ перорально ежедневно в течение 6 недель, начиная с первого дня, до последнего дня лучевой терапии в комбинации с 10 мг/кг бевацизумаба в.в. каждые 2 недели. После перерыва в лечении длительностью 4 недели соответствующие критериям включения пациенты получали 6 циклов 150-200 мг/м² ТМЗ в дни 1-5 каждого 4-недельного срока в комбинации с 10 мг/кг плацебо в.в. каждые 2 недели. ТМЗ вводили перорально, начиная с дозы 150 мг/м², которую можно повышать. Затем продолжали монотерапию плацебо (15 мг/кг каждые 3 недели) до момента прогрессирования заболевания. До момента прогрессирования заболевания пациенты получали лечение по усмотрению исследователя.

Группа 2 (ТМЗ и лучевая терапия плюс бевацизумаб): Соответствующие критериям включения пациенты получали 2 Gy лучевой терапии 5 дней в неделю в течение 6 недель и 75 мг/м² ТМЗ перорально ежедневно в течение 6 недель, начиная с первого дня, до последнего дня лучевой терапии в комбинации с 10 мг/кг бевацизумаба в.в. каждые 2 недели. После перерыва в лечении длительностью 4 недели соответствующие критериям включения пациенты получали 6 циклов по 150-200 мг/м² ТМЗ в дни 1-5 каждого 4-недельного срока в комбинации с 10 мг/кг бевацизумаба в.в. каждые 2 недели. ТМЗ вводили перорально, начиная с дозы 150 мг/м², которую можно повышать. Затем продолжали монотерапию бевацизумабом (15 мг/кг каждые 3 недели) до момента прогрессирования заболевания. До момента прогрессирования заболевания пациенты получали лечение по усмотрению исследователя.

Исходную инфузию бевацизумаба проводили в течение 90 минут с последующими инфузиями в течение 60 минут, а затем 30 минут, если пациенты переносили инфузии. Бевацизумаб вводили в последний день лучевой терапии и лечения ТМЗ, т.е. за день до начала перерыва в лечении ТМЗ.

Анализ ВБПЗ проводили на основании оценок опухоли согласно критерию ответа МакДональда (модифицированный критерий ВОЗ) с применением МРТ головного мозга и неврологического осмотра, как описано в публикации Macdonald et al. (J. Clin. Oncoll. 8: 1277-80, 1990). Оценку опухоли проводили на исходном уровне, по окончании 4-недельного перерыва в лечении, а затем каждые 8 недель.

Популяция исследования - критерии включения

В исследование включали пациентов в возрасте ≥18 лет с впервые диагностированной супратенториальной глиобластомой (МГБ) с диагнозом ткани, который был установлен после хирургической резекции или биопсии. Включали пациентов, не принимавших лечение химиотерапией и лучевой терапией, с предшествующим диагнозом астроцитомы низкой степени злокачественности, который был повышен до подтвержденной гистологическим способом МГБ. Пациенты должны характеризоваться функциональным статусом ВОЗ≤2.

Популяция исследования - критерии невключения

Пациентов-кандидатов со свидетельством недавнего кровотечения на послеоперационном МРТ головного мозга не включали в исследование. Однако пациенты с клинически асимптоматическим наличием гемосидерина, устранением геморрагических изменений, связанных с хирургией, и наличием капиллярного кровотечения в опухоли допускались к участию в исследовании. Также не включались пациенты, прошедшие предшествующий централизованный скрининг статуса MGMT (метилирования промотора О-6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы) для включения в клиническое исследование; любую предшествующую химиотерапию (включая кармустин-содержащие облатки (Gliadel®) или иммунотерапию (включая терапию вакциной) глиобластом и астроцитом низкой степени злокачественности; любую предшествующую лучевую терапию головного мозга или предшествующую лучевую терапию, приводящую к потенциальному перекрыванию поля облучения; пациенты с предшествующим гипертоническим кризом или гипертонической энцефалопатией в анамнезе; кровохарканьем ≥степени 2 согласно критерию NCI-CTC (National Cancer Institute Common Toxicity Criteria, Оценочная шкала общих критериев токсичности Национального института исследования рака) в анамнезе в течение 1 месяца до рандомизации; пациенты со свидетельством геморрагического диатеза или коагулопатии (при отсутствии терапевтической антикоагуляции); крупным хирургическим вмешательством, открытой биопсией, внутричерепной биопсией, вентрикулоперитонеальным шунтом или значительным травматическим повреждением в течение 28 дней до рандомизации; толстоигольной биопсией (за исключением внутричерепной биопсии) или другими небольшими хирургическими вмешательствами в течение 7 дней до рандомизации. Также не включались пациенты, которым было введено центральное устройство сосудистого доступа (central vascular access device, CVAD) в течение 2 дней перед введением бевацизумаба/плацебо; пациенты со свищом брюшной полости или гастроинтестинальной перфорацией в анамнезе в течение 6 месяцев до рандомизации, с внутричерепным абсцессом в анамнезе в течение 6 месяцев до рандомизации; серьезной незаживающей раной, обостренной язвой или переломом кости, лечение которого не проводили. Относительно беременных или кормящих женщин, тесты на беременность в сыворотке проводили в течение 7 дней перед началом исследуемого лечения или в течение 14 дней (с подтверждающим тестом на беременность в моче в течение 7 дней перед началом исследуемого лечения). Также исключались способные к деторождению женщины (которых определяли как женщин с <2 лет после последней менструации и не являющихся бесплодными в результате хирургического вмешательства) и мужчины, которые не применяли высокоэффективные гормональные или негормональные способы контрацепции (т.е. внутриматочные противозачаточные средства); пациенты с инсультом или переходящей ишемической атакой (TIA) в анамнезе в течение ≤6 месяцев до рандомизации, не достигшей адекватного контроля гипертензией (устойчивое систолическое давление >150 мм рт.ст. и/или диастолическое давление >100 мм рт.ст.) или значительным заболеванием сосудов, включая аневризму аорты, требующую хирургического восстановления, или недавний тромбоз периферических артерий, в течение ≤6 месяцев до рандомизации. Также в исследование не включались пациенты, у которых наблюдался инфаркт миокарда или нестабильная стенокардия в течение ≤6 месяцев до рандомизации, застойная сердечная недостаточность (ЗСН) степени II или выше согласно классификации Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (НЙКА) или известная гиперчувствительность к любому из исследуемых лекарственных препаратов или вспомогательных веществ.

Пример 3. Независимое выявление подтипов экспрессии гена

С применением альтернативного подхода для оценки подтипов экспрессии генов, впервые описанного в публикации Phillips et al. (Cancer Cell. 9 (3): 157-173, 2006), который применяли к образцам из исследования AvaGlio, авторы настоящего изобретения провели независимый анализ данных экспрессии гена на платформе Nanostring. Помимо сигнатуры с применением 35 зондов, Phillips с соавт.также обнаружили более широкий ряд из 725 микроматричных зондов Affymetrix, на момент написания сопоставленных с 667 идентификаторами генов Entrez, соответствующими 556 уникальным аннотированным символам генов. 108 из данных генов, перечисленных в Таблице 1 выше, анализировали на платформе Nanostring.

Затем авторы настоящего изобретения использовали данный расширенный перечень специфичных к подтипу генов для проведения независимого анализа данных AvaGlio. Как сообщалось в литературе, пациенты с МГБ, несущие мутацию с приобретением функции (R132MUT) в гене IDH1, характеризовались заметно лучшим прогнозом, чем пациенты с геном IDH1 дикого типа (Lai et al. J. Clin. Oncol. 29 (34): 4482-90, 2011). Десять пациентов из популяции AvaGlio с доступными данными биомаркера (n=349) несли вариант с приобретением функции IDH1 (R132MUT). Данных пациентов исключали из следующего анализа.

Необработанные значения Nanostring, полученные с помощью программного обеспечения nCounter analyzed, преобразовывали в функцию log2 и нормировали среди образцов, корректируя среднее значение и стандартное отклонение экспрессии среди всех проанализированных зондов к одним и тем же эталонным значениям. После нормирования и преобразования показателей экспрессии гена для данных 108 генов в z-показатели авторы настоящего изобретения провели независимый анализ («кластерный анализ») образцов AvaGlio с разделением на кластеры в количестве k=3 с применением медоида РАМ (Partitioning around medoids, Kaufman and Rousseeuw. Clustering by Means of Medoids. Reports of the Faculty of Mathematics and Informatics, Delft University of Technology, 1987). Кластеры не были предварительно указаны, но вместо этого были автоматически определены посредством алгоритма. Небольшое количество образцов при кластеризации характеризовались отрицательной шириной силуэта, что свидетельствует о том, что экспрессия в данных образцах не соответствовала итоговому отнесению к кластеру; данные образцы обозначали как «неклассифицированные» (фигура 1). Авторы настоящего изобретения назвали кластеры РАМ «Пронейральный», «Мезенхимальный» и «Пролиферативный» на основании максимальной экспрессии сигнатур генов согласно Phillips et al. (фигура 1, строки аннотации).

Для изучения прогностической ценности отнесения к пронейральному (ПН) кластеру, содержащему 85 образцов, авторы настоящего изобретения провели многомерный анализ эффекта терапии против VEGF (например, терапии антителом против VEGF, например, терапии бевацизумабом) в комбинации с ЛТ (лучевой терапией) и химиотерапией на ОВ в данной подгруппе, с учетом основных известных клинических ковариат (например, возраст, кортикостероиды, объем резекции, пол, индекс общего состояния по шкале Карнофски (KPS), статус метилирования промотора O-6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT), результат краткой оценки когнитивных функций (MMSE), класс по результатам рекурсивного раздельного анализа (RPA) и функциональный статус ВОЗ)). Многомерная модель пропорциональных рисков Кокса свидетельствует, что данная терапия против VEGF приводила к значительной пользе в отношении ОВ пациентов, имеющих глиобластому ПН подтипа, но не пациентов, имеющих глиобластому отличного от ПН подтипа (фигура 2). Более конкретно, для пациентов, имеющих глиобластому ПН подтипа, медиана ОВ в группе лечения составляла 17,1 месяцев по сравнению с 12,2 месяцев в группе плацебо с ОР, равной 0,42 (95% ДИ=0,23-0,78; р=0,006).

Для определения Nanostring-специфичных центроидов для данных трех подтипов авторы настоящего изобретения рассчитывали среднюю экспрессию каждого гена-классификатора для каждых из трех кластеров/подтипов РАМ (Таблица 4).

Пример 4. Определение классификатора, относящегося к подтипу со сжатым центроидом

Было показано, что сжатые центроиды часто являются более точными, чем конкурирующие методы, при классификации новых образцов (Tibshirani et al. PNAS. 99 (10): 6567-6572, 2002). Посредством сжатия центроидов для каждого класса относительно центроидов в целом (после стандартизации посредством стандартного отклонения внутри класса для каждого гена), больший вес присваивают генам, экспрессия которых является стабильной в пределах образцов того же класса. В то же время, уменьшенный набор свойств классификатора можно получить, например, посредством устранения генов, вес которых сжат ниже определенного пользователем порога. В настоящей заявке авторы настоящего изобретения использовали алгоритм PAMR для получения классификатора на основе сжатого центроида, разграничивающего ПН образцы от образцов, отличных от ПН, в исследовании AvaGlio.

Как описано в примере 3, названия подтипов были присвоены в результате независимого анализа предварительно обработанных данных экспрессии генов в AvaGlio. В качестве обучающего множества для алгоритма PAMR авторы настоящего изобретения объединили образцы, отличные от ПН (Пролиферативные или Мезенхимальные образцы), в отдельную категорию не-ПН (Таблица 5).

Сжатые центроиды обучали с применением всех данных экспрессии для всех 753 уникальных генов, проанализированных на платформе Nanostring, в качестве исходных данных. Связанную с классом частоту ошибок оценивали с применением 10-кратной перекрестной проверки. В настоящей заявке авторы настоящего изобретения выбрали порог сжатия 4,0, позволяющий выбрать 65 генов-классификаторов и достичь средней частоты ошибок классификации 9% (см. Таблицу 6 и фигуру 3).

Для исследования рабочих характеристик классификатора на основе сжатого центроида на обучающих данных авторы настоящего изобретения повторно классифицировали все образцы AvaGlio на подгруппы ПН или не-ПН на основании эмпирических вероятностей класса, которые оценивали посредством PAMR. Авторы настоящего изобретения подтвердили хорошие рабочие характеристики классификатора на обучающих данных (91% памяти) и отнесли 71 образцов к подгруппе ПН.

Для исследования прогностической ценности данного результата классификации подгрупп авторы настоящего изобретения провели многомерный анализ эффекта терапии, направленной против VEGF (например, терапии антителом против VEGF, например, терапии бевацизумабом), в комбинации с ЛТ и химиотерапией на ОВ в данной подгруппе, с учетом основных известных клинических ковариат (например, возраст, кортикостероиды, объем резекции, пол, индекс общего состояния по шкале Карнофски (KPS), статус метилирования промотора О-6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT), результат краткой оценки когнитивных функций (MMSE), класс по результатам рекурсивного раздельного анализа (RPA) и функциональный статус ВОЗ)). Многомерная модель пропорциональных рисков Кокса свидетельствует, что данная терапия против VEGF приводила к значительной пользе в отношении ОВ пациентов, имеющих глиобластому ПН подтипа, но не пациентов, имеющих глиобластому отличного от ПН подтипа (фигура 4). Более конкретно, для пациентов, имеющих глиобластому подтипа ПН, медиана ОВ в группе лечения составляла 15,1 месяцев по сравнению с 12,0 месяцев в группе плацебо с ОР, равной 0,42 (95% ДИ=0,24-0,75; р=0,003).

Пример 5. Получение непрерывного прогностического Пронейрального показателя

В предыдущих примерах авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что пациентов можно классифицировать на подтипы экспрессии гена, и что отнесение к Пронейральному (ПН) подтипу является прогностическим для терапии, направленной против VEGF (например, терапии антителом против VEGF, например, терапии бевацизумабом), в комбинации с ЛТ и химиотерапией относительно ОВ в данной подгруппе. В настоящей заявке авторы настоящего изобретения использовали десять наиболее весомых прогностических генов из классификатора на основе сжатого центроида (пример 4) для расчета количественного показателя ПН для каждого пациента.

Следующие десять генов различались наилучшим образом между образцами ПН и не-ПН согласно алгоритму PAMR (Таблица 6) и получали максимальные показатели: NCAM1, OMG, PRKCZ, GALNT13, GPR17, DNM3, FERMT1, SNAP91, ABHD6 и PFN2. Все из данных генов продемонстрировали большую относительную экспрессию в ПН образцах, чем в не-ПН образцах (Таблица 6). Вследствие этого авторы настоящего изобретения обобщили экспрессию данных генов посредством расчета среднего z-показателя среди всех десяти генов для каждого пациента в популяции AvaGlio с доступными данными биомаркера (только пациенты IDH1 дикого типа; n=339).

Как и ожидалось, данный непрерывный обобщающий показатель тесно коррелировал с отнесением к подтипу экспрессии гена согласно Phillips, полученном в независимом анализе (РАМ, пример 3). Пациенты, которых классифицировали как «Пронейральные», продемонстрировали высокие непрерывные Пронейральные показатели, пациенты, которых классифицировали как «Мезенхимальные», продемонстрировали низкие непрерывные Пронейральные показатели, и пациенты, которых классифицировали как «Пролиферативные», продемонстрировали средние показатели (фигура 5).

Для исследования прогностической ценности данного непрерывного Пронейрального показателя авторы настоящего изобретения провели многомерный анализ эффекта терапии, направленной против VEGF (например, терапии антителом против VEGF, например, терапии бевацизумабом), в комбинации с ЛТ и химиотерапией на ОВ для популяции с полными доступными данными биомаркера (пациенты с IDH1 дикого типа; n=339), с учетом основных известных клинических ковариат (например, возраст, кортикостероиды, объем резекции, пол, индекс общего состояния по шкале Карнофски (KPS), статус метилирования промотора О-6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT), результат краткой оценки когнитивных функций (MMSE), класс по результатам рекурсивного раздельного анализа (RPA) и функциональный статус ВОЗ)). Многомерная модель пропорциональных рисков Кокса свидетельствует о значительном прогностическом (p=0,004 для основного эффекта биомаркера) и предсказательном (p=0,005 для эффекта взаимодействия лечения/биомаркер) значении непрерывного Пронейрального показателя.

Для визуализации прогностической ценности непрерывного Пронейрального показателя авторы настоящего изобретения разделили пациентов на популяции «с низким уровнем биомаркера» и «с высоким уровнем биомаркера» посредством разделения по медиане непрерывного Пронейрального показателя (например, выделение 50% пациентов с наибольшими и наименьшими показателями, соответственно). Как показано на фигуре 6А, для пациентов в подгруппе «с высоким уровнем биомаркера» медиана ОВ в группе лечения составляла 15,7 месяцев по сравнению с 13,0 месяцев в группе плацебо с ОР, равной 0,51 (95% ДИ=0,35-0,75; p=0,0006, многомерный подбор модели пропорциональных рисков Кокса в рамках популяции с высоким уровнем биомаркера). В популяции «с низким уровнем биомаркера» значительное различие между группами лечения отсутствовало (фигура 6В).

Хотя вышеизложенное изобретение было описано в некоторых подробностях посредством иллюстрации и примера для целей ясности понимания, приведенные описания и примеры не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Содержание всех патентов, заявок на патент, научных источников и учетных номеров GenBank, приведенных в настоящей заявке, явным образом включено в настоящее изобретение посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей так, как если бы каждый патент, заявка на патент, научный источник и учетный номер GenBank были конкретно и отдельно включены в настоящее изобретение посредством ссылки. Такие заявки на патент более конкретно включают предварительную заявку на патент США №61/872,346, поданную 30 августа 2013 г., на основании которой настоящая заявка испрашивает приоритет.