Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ ВОСПАЛИТЕЛЬНО-ДЕСТРУКТИВНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ПАРОДОНТАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ ПРИ ПАРОДОНТИТЕ

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для диагностики интенсивности воспалительно-деструктивных изменений пародонтальных тканей при пародонтите.

Сегодня в стоматологическую практику все больше внедряются инновационные методы лечения, основанные на последних научных достижениях медицины, с использованием аппаратуры и методов терапии, разработанных с учетом патогенеза и этиологии воспалительных заболеваний пародонта. Однако обменные процессы, протекающие в пародонте в норме и тем более, при воспалении, изучены все еще недостаточно.

Заболевания пародонта имеют выраженный воспалительно-деструктивный характер. Чаще всего люди заболевают генерализованным пародонтитом, который различается скоростью, агрессивностью и глубиной протекания деструктивных процессов в тканях пародонта, с вовлечением костной ткани альвеолярного отростка при запущенных стадиях заболевания. Пародонтит может стремительно прогрессировать и за короткий срок привести к выпадению всех или части зубов (Боровский Е.В., Грошиков М.И., Патрикеев В.К., Барышева Ю.Д., Лемецкая Т.И. Терапевтическая стоматология. Учебник для студентов медицинских вузов. Москва, Изд. «Медицина», 1982. С. 329-331)

В ходе исследований последних лет доказано, что одним из важнейших процессов, определяющих активность, уровень и прогноз развития воспалительно-дистрофических явлений в пародонте является белковый и минеральный обмен. Нарушение в данном виде обменных реакций значительно влияет на клиническую картину заболевания и определяет специфику медикаментозного лечения в комплексной терапии больных с генерализованным пародонтитом (Справочник по стоматологии. Под редакцией академика АМН СССР А.И. Рыбакова. Москва, Изд. «Медицина», 1993. С.93-96).

Воспаление десны и тканей пародонта характеризуется разрушением коллагена - основного белка соединительной ткани, что, без сомнения, приводит к увеличению в слюне уровня такой аминокислоты как 4-гидроксипролин, свойственной исключительно коллагену (Вавилова Т.П. Биохимия тканей и жидкостей полости рта. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008, с. 215).

Пролин и его метаболит гидроксипролин, входят в состав коллагена - основного белка соединительной ткани и потому клинический анализ является важным в диагностике заболеваний, связанных с патологией коллагена, к которым относится и пародонтит.

Однако в специальной стоматологической литературе по диагностике воспалительных заболеваний пародонта нам удалось найти лишь ограниченное число данных об использовании в качестве маркера этих заболеваний величины концентрации гидроксипролина в слюне, носящих, в основном, теоретический характер (Дутов А.А. и др. ВЭЖХ анализ пролина и 4-гидроксипролина в биологических жидкостях. Сорбционные и хроматографические процессы. 2013. Т.13. Вып.2. - С.229-237).

Известно, что диагностику заболеваний пародонта проводят, основываясь на субъективной оценке состояния пародонта самим пациентом, например, кровоточивость десен во время чистки зубов или болевые ощущения при приеме пищи.

Постановка окончательного диагноза основывается на анализе ряда объективных показателей - глубины пародонтальных карманов, наличия кровотечения, гноетечения, зубного налета и зубного камня. Также важным является рентгенологическое исследование, при котором определяется резорбция альвеолярных межзубных перегородок, убыль части костной ткани альвеолярных отростков челюстей.

Однако при постановке диагноза «пародонтит» уточнения его степени тяжести, как например, легкой, средней или тяжелой, основанной на анализе вышеприведенных данных оказывается недостаточно для адекватной терапии.

Врачу необходимо понимать динамику воспалительного процесса, чтобы соразмерно оценивать эффективность проводимой терапии.

С этой целью выделяют низкую, среднюю и высокую интенсивность воспалительно-деструктивных изменений пародонтальных тканей (ИВДИ). Данный показатель на качественном уровне показывает, в какую сторону смещается интенсивность патологического процесса, помогая врачу определить самый рациональный и правильный вид стоматологической помощи. Наиболее распространены способы диагностики ИВДИ с использованием химических реагентов и специфических биохимических маркеров.

Известен способ диагностики заболеваний пародонта путем определения содержания гликогена на поверхности десен (проба Шиллера-Писарева). Для этого слизистую оболочку десны окрашивают раствором Люголя. По изменению цвета в различных зонах после окрашивания судят о наличии воспалительного Процесса (Диагностика, лечение и профилактика стоматологических заболеваний. Яковлева В.И., Трофимова Е.К., Давидович Т.П., Просвиряк Г.П. - 2-е изд., перераб. и доп. - Мн.: Выш.шк., 1994. - С.28).

Известен также способ оценки метаболизма коллагена (патент на изобретение RU 2214596), относящийся к клинико-диагностическим исследованиям, основанный на определении содержания в слюне свободного и белково-связанного оксипролина в динамике заживления гастродуоденальных язв.

Способ оценки метаболизма коллагена включает забор биологической жидкости, выделение из нее свободного и белково-связанного оксипролина экстракцией этиловым спиртом и центрифугированием, где свободный оксипролин выделяют из надосадочной жидкости. Для выделения белково-связанного оксипролина, используют гидролизат гидроксид бария с последующей ионообменной хроматографией. Концентрацию оксипролина определяют колориметрически при длине волны 540 нм в кювете 0,5 см путем добавления реактива Эрлиха. В качестве биологической жидкости используют слюну обследуемого человека в количестве 4 мл. Добавляют к ней 16 мл этилового спирта, перемешивают, центрифугируют в течение 15 мин при скорости 3000 об/мин. Выделение белково-связанного оксипролина осуществляют на хроматографической колонке диаметром 3 мм, высотой заполнения ионообменной смолой КРС-8п 6 мм, со скоростью движения нейтрализата, равной 0,2 мм в минуту. Оксипролин элюируют 1 мл 1н. раствора соляной кислоты, после чего солянокислый элюат нейтрализауют 5н. раствором гидроксида натрия, при этом оценку распада коллагена и процесса его биосинтеза проводят по возрастанию концентрации свободного или белково-связанного оксипролина соответственно.

Известен способ диагностики воспалительных заболеваний тканей пародонта (патент на изобретение RU 2329509), сущность которого в определении содержания кальция, фосфора, активности щелочной фосфатазы, общей и тетратрезистентной кислой фосфатазы в смешанной нестимулированной слюне. Однако способ является более трудоемким и дорогостоящим, требующим специального оборудования.

Технический результат предлагаемого способа заключается в повышении точности диагностики с минимальными затратами времени за счет определения концентраций свободного оксипролина в слюне, что является объективной оценкой стадии воспалительного процесса в полости рта, причем выполняется на оборудовании, которое имеется в любой клинической лаборатории.

Наиболее близким по сути и выбранным в качестве прототипа стал «Способ диагностики заболеваний тканей пародонта на разных стадиях» (патент на изобретение RU 2581921; Алексахина Е.Л. Томилова И.К.).

В известном способе концентрацию свободного оксипролина в слюне пациентов, которые обратились на прием к стоматологу, в том числе и с жалобами на кровоточивость десен и подвижность зубов, авторы определяли спектрофотометрически с помощью модифицированного метода С.С. Тетянец, который используется для определения свободного оксипролина в сыворотке крови (С.С. Тетянец. Метод определения свободного оксипролина в сыворотке крови. Лабораторное дело, 1985, N 1, стр. 61-62).

Для проведения анализа свободного 4-гидроксипролина 0,25 мл ротовой жидкости авторы наливали в пробирки, прибавляли 1 мл абсолютного этанола, центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. Всю надосадочную жидкость переносили в мерные центрифужные пробирки. При перемешивании добавляли 0,25 мл раствор хлорамина Т в ацетатном буфере (1:4). Добавляли 0,25 мл изопропилового спирта. Через 4 мин приливали 0,75 мл реактива Эрлиха. Общий объем раствора доводили этиловым спиртом до 2,5 мл. После перемешивания пробирки закрывали пробками и термостатировали при 60°С 30 мин. Затем охлаждали до 20°С.

Авторы подчеркивают, что в заявляемом ими способе используется величина объективного показателя концентрации свободного оксипролина в слюне, который позволяет диагностировать воспалительный процесс на объективной основе. Результаты исследований приведены в таблице, где показано, что концентрации свободного оксипролина в слюне пациентов изменяются в определенных авторами пределах. Пациентам со здоровыми тканями пародонта соответствует интервал концентраций свободного оксипролина <0,80 мг/л; пациентам с острым катаральным гингивитом - 0,80-1,00 мг/л; пациентам с хроническим гингивитом - 1,01-1,50 мг/л; пациентам с пародонтитом >1,50 мг/л.

Преимущества прототипа: способ позволяет повысить точность диагностики с минимальными затратами времени за счет определения концентрации свободного оксипролина в слюне, что является объективной оценкой стадии воспалительного процесса в полости рта, причем выполняется на оборудовании, которое имеется в любой клинической лаборатории.

Недостатки прототипа: способ не позволяет определить стадию патологического процесса и главное, его направление, поскольку используемые авторами биохимические маркеры (концентрация свободного оксипролина в слюне) отражают итоговые изменения резорбции и костеобразования, которые могут быть направлены в ту или иную сторону, но не отражают их направленности - усиливается заболевание или пациент выздоравливает.

Поставлена задача: повысить точность диагностики интенсивности воспалительно-деструктивных изменений пародонтальных тканей (ИВДИ) за счет определения концентрации белково-связанного и свободного гидроксипролина в слюне для объективной оценкой степени тяжести патологического процесса.

Для решения поставленной задачи использованы маркер формирования костной ткани (белково-связанный гидроксипролин в ротовой жидкости) и маркер деструкции кости (свободный гидроксипролин в ротовой жидкости).

Содержание гидроксипролина в биологических жидкостях является важнейшим показателем метаболизма коллагена. При некоторых воспалительных и воспалительно-деструктивных заболеваниях, сопровождающихся нарушением синтеза коллагена, поперечные связи в фибриллах коллагена разрушаются, что увеличивает содержание легкорастворимых форм коллагена. В этой связи у больных с хроническим пародонтитом на фоне нарушения метаболизма соединительной ткани, увеличивается содержание в ротовой жидкости свободной фракции гидроксипролина и уменьшается содержание его белково-связанной фракции. Таким образом, свободный гидроксипролин является маркером деструкции, белково-связанный - маркером репарации (восстановления).

Использование данных биохимических маркеров позволяет оценивать интенсивность воспалительно-деструктивных изменений пародонтальных тканей (ИВДИ), у пациентов в зависимости от поставленного диагноза: пародонтит легкой, средней или тяжелой степени клинических проявлений, оценивая либо патологические изменения, либо эффект проводимой противовоспалительной терапии в динамике лечения.

Метод осуществляли следующим способом.

Сбор ротовой жидкости производили натощак. За 10 минут до забора ротовой жидкости больным рекомендовали тщательно прополаскивать рот теплой водой, специальные механические средства для очистки полости рта перед забором ротовой жидкости не использовались.

При анализе использовали принцип, основанный на определении оптической плотности хромогена, полученного в результате конденсации продуктов окисления гидроксипролина с парадиметиламинобензальдегидом). Собранная ротовая жидкость каждого пациента центрифугировалась. В центрифужную пробирку добавляли 0,5 мл 5%-й трихлоруксусной кислоты и 0,5 мл 5%-й хлорной кислоты. Затем проводили центрифугирование при 3000 об/мин 6 минут. Надосадочную жидкость распределяли по 0,75 мл в две пробирки для определения свободной (пробирка №1) и белково-связанной фракции гидроксипролина (пробирка №2).

Содержимое пробирки №1 нейтрализовали 24% раствором NaOH в присутствие индикаторного раствора (до появления устойчивой слабопурпурной окраски). К содержимому пробирки №2 добавляли 0,5 мл дистиллированной воды, 0,5 мл 5%-й трихлоруксусной кислоты и 0,5 мл 57%-й хлорной кислоты, гидролизовали в водяной бане 6 часов при температуре 60°С. Далее добавляли 0,25 г активированного угля и центрифугировали при 3000 об/мин 6 минут. Прозрачную часть гидролизата нейтрализовали 24% раствором NaOH в присутствие индикаторного раствора (до появления устойчивой слабопурпурной окраски).

Далее во все пробирки добавляли 0,5 мл раствора хлорамина Б, 0,5 мл 57%-й хлорной кислоты и 0,5 мл пара-диметилбензальдегида. Смесь помещали в водяную баню на 20 мин при 60°С. Затем измеряли оптическую плотность содержимого пробирок №1-2 при 557 нм. Расчет концентрации фракций гидроксипролина производился по калибровочной кривой на спектрофотометрическом детекторе Shimadzu SPD-M20 (Shimadzu, Japan). Полученные данные обрабатывали с использованием статистической программы «SPSS for Windows 17.0», различия между группами сравнения определяли по критерию Манна-Уитни в доверительном интервале при р<0,05.

Результаты исследований показали, что концентрации свободного гидроксипролина и белково-связанного гидроксипролина в ротовой жидкости пациентов изменяются разнонаправленно.

Пациентам со здоровыми тканями пародонта соответствует интервал концентраций свободного гидроксипролина <1,0 мкг/мл; пациентам с низким ИВДИ - 1,1-1,8 мкг/мл; пациентам со средним ИВДИ - 1,81-2,5 мкг/мл; пациентам с высоким ИВДИ >2,5 мкг/мл.

Пациентам со здоровыми тканями пародонта соответствует интервал концентраций белково-связанного гидроксипролина <20,5 мкг/мл, пациентам с низким ИВДИ - 15,5-20,4 мкг/мл; пациентам со средним ИВДИ - 11,0-17,4 мкг/мл; пациентам с высоким ИВДИ >10,9 мкг/мл.

Установленные опытным путем изменения свободного гидроксипролина свидетельствуют о активации катаболизма и депрессии анаболизма тканей пародонта (например, вследствие прогрессирования заболевания и отсутствии адекватной противовоспалительной терапии).

Нарастание концентрации белково-связанного гидроксипролина, наоборот, свидетельствует об активации синтеза коллагена и интенсивной регенерации тканей пародонта (например, вследствие проводимой эффективной противовоспалительной терапии).

Таким образом, установлена четкая зависимость между степенью отклонения от нормы уровней содержания свободных и связанных фракций гидроксипролина в ротовой жидкости и наличием изменения в метаболизме тканей пародонта. Заявляемое количественное и качественное определение гидроксипролина может быть использовано при диагностике степени интенсивности воспалительно-деструктивных изменений пародонтальных тканей.

Результаты проведенного исследования подтверждены в клинических условиях. Клинические примеры.

1. Пациент З-н, 2001 г. р. обратился к врачу-стоматологу с целью санации полости рта и проведения профессиональной гигиены.

Жалобы: на наличие налета курильщика на зубах.

Объективно в полости рта: слизистая оболочка прикрепленной десны бледно-розового цвета, умеренно увлажненная.

При инструментальном исследовании полости рта выявлено небольшое количество зубного налета на язычной поверхности фронтальных и жевательных зубов. Зубодесневое соединение не нарушено. Патологических изменений на обзорной рентгенограмме не выявлено.

С помощью клинических индексов (КПУ=2,35, ИГРУ=0,3, РМА=0,1) проведена объективная оценка состояния зубов и десен.

Результаты исследования слюны:

Свободный гидроксипролин - 1,35 мкг/мл.

Белково-связанный гидроксипролин - 22,8 мкг/мл.

Резюме: признаки воспаления и деструкции костной ткани отсутствуют, здоров.

Диагноз: К 03.66 Зубной налет.

2. Пациент Ф-в, 1991 г. р. обратился к врачу-стоматологу с целью санации полости рта й профессиональной гигиены полости рта.

Жалобы: на неприятный запах изо рта, кровоточивость десен при чистке зубов и накусывании твердой пищи, зубной налет.

Объективно в полости рта: слизистая оболочка прикрепленной десны слабо гиперемированная, бледно-розовая, местами слегка гиперемирована, умеренно увлажнена.

При инструментальном исследовании полости рта выявлен мягкий и твердый наддесневой и поддесневой зубной налет на всех группах зубов верхней и нижней челюсти. При зондировании зубодесневой борозды пуговчатым зондом отмечается незначительная кровоточивость в области жевательной и фронтальной группы зубов. Глубина пародонтальных карманов 1-3 мм. Зубодесневое соединение нарушено во фронтальном участке зубов. На обзорной рентгенограмме выявлена убыль высоты межзубных альвеолярных перегородок во фронтальном участке нижней челюсти на 1/4-1/3 их высоты.

С помощью клинических индексов (КПУ=4,8, ИГРУ=1,75, РМА=4,4) проведена объективная оценка состояния зубов и десен.

Результаты исследования слюны:

Свободный гидроксипролин - 1,58 мкг/мл.

Белково-связанный гидроксипролин - 16,5 мкг/мл.

Заключение: обнаружены признаки воспаления с явлениями деструкции межзубных альвеолярных перегородок.

Диагноз: Хронический генерализованный пародонтит легкой степени тяжести, с низкой интенсивностью воспалительно-деструктивных изменений пародонтальных тканей.

3. Пациентка С-а, 1977 г. р. обратилась на прием к врачу-стоматологу.

Жалобы: на эстетический дефект во фронтальном участке, зубной налет, неприятный запах изо рта.

Объективно: слизистая оболочка прикрепленной десны цианотичная, отечная, умеренно увлажненная. При клиническом обследовании полости рта наблюдается наддесневой и поддесневой зубной камень в области 34, 33, 32, 31, 41, 42, 43, 44, 45 зубов, пигментированный налет на всех группах зубов. При зондировании пуговчатым зондом обнаружены пародонтальные карманы глубиной до 5 мм, рецессия десны 2-3 мм. Подвижность зубов 1 степени. На обзорной рентгенограмме выявлено разрушение кортикальной пластинки межзубных перегородок на 1/2-1/3 их высоты.

С помощью клинических индексов (КПУ=12,8, ИГРУ=2,3, РМА=4,4) проведена объективная оценка состояния зубов и десен.

Результаты исследования слюны:

Свободный гидроксипролин - 2,3 мкг/мл.

Белково-связанный гидроксипролин - 12,8 мкг/мл.

Заключение: обнаружены признаки воспаления с выраженными явлениями деструкции межзубных альвеолярных перегородок.

Диагноз: Хронический генерализованный пародонтит средней степени тяжести, со средней интенсивностью воспалительно-деструктивных изменений пародонтальных тканей.

4. Пациент В-в, 1979 г. р. обратился на прием к врачу-стоматологу с целью ортопедического лечения.

Жалобы: на отсутствие группы зубов, подвижность зубов, зубной налет, неприятный запах изо рта.

Объективно: слизистая оболочка прикрепленной десны гиперемированная, отечная, умеренно увлажненная.

При клиническом обследовании выявлен наддесневой и поддесневой зубной камень на всех зубах нижней челюсти, пигментированный налет на всех группах зубов верхней челюсти, при зондировании пуговчатым зондом выявлены кровоточащие пародонтальные карманы глубиной более 5 мм. В области пародонтальных карманов 35, 34, 33, 32, 31, 41, 42, 43, 44 при зондировании вместе с кровью выделяется гной. Подвижность зубов фронтальной группы 2 степени. На обзорной рентгенограмме наблюдается полное разрушение кортикальной пластинки межзубных перегородок, снижение высоты альвеолярной части нижней челюсти в области отсутствующих зубов жевательной группы на 5-7 мм.

С помощью клинических индексов (КПУ=18,9, ИГРУ=4,8, PMA=5,5) проведена объективная оценка состояния зубов и десен.

Результаты исследования слюны:

Свободный гидроксипролин - 2,8 мкг/мл.

Белково-связанный гидроксипролин - 9,5 мкг/мл.

Заключение: воспалительно-дистрофический процесс с выраженными явлениями деструкции межзубных альвеолярных перегородок.

Диагноз: Хронический генерализованный пародонтит тяжелой степени, с высокой интенсивностью воспалительно-деструктивных изменений пародонтальных тканей.

5. Пациентка А-ко, 1982 г. р. обратилась к врачу-стоматологу с целью профессиональной гигиены полости рта.

Жалобы: на кровоточивость десен во время чистки зубов и откусывании твердой пищи.

Объективно: слизистая оболочка прикрепленной десны слабо гиперемированная, умеренно увлажненная.

При клиническом обследовании полости рта выявлен наддесневой и поддесневой зубной камень на зубах 33, 32, 31, 41 42, 43 зубах. При зондировании зубодесневой борозды пуговчатым зондом отмечается кровоточивость. Зубодесневое соединение нарушено в области зубов фронтальной группы нижней челюсти. На обзорной рентгенограмме видимых патологических изменений в области вершин межзубных костных перегородок нет.

С помощью клинических индексов (КПУ=11,3, ИГРУ=1,6, РМА=3,1) проведена объективная оценка состояния зубов и десен.

Результаты исследования слюны:

Свободный гидроксипролин - 2,6 мкг/мл.

Белково-связанный гидроксипролин - 12,8 мкг/мл.

Заключение: обнаружены признаки воспаления без выраженных явлений деструкции межзубных альвеолярных перегородок.

Диагноз: Хронический генерализованный пародонтит легкой степени тяжести, со средней интенсивностью воспалительно-деструктивных изменений пародонтальных тканей. Прогноз - неблагоприятный.

6. Пациент Я-в, 1968 г. р. обратился к стоматологу с целью гигиены полости рта. Жалобы: на наличие зубных отложений, неприятный запах изо рта.

Объективно: слизистая оболочка прикрепленной десны гиперемированная, отечная, умеренно увлажненная.

При клиническом обследовании полости рта выявлен наддесневой и поддесневой зубной камень в области жевательных зубов нижней челюсти, пигментированный налет на всех группах зубов. При зондировании зубодесневой борозды отмечается кровоточивость, подвижность зубов 1 степени. Пародонтальные карманы глубиной 4-5 мм. На обзорной рентгенограмме наблюдается частичное разрушение кортикальной пластинки, резорбция вершин межзубных перегородок на 1/3-1/2 высоты.

С помощью клинических индексов (КПУ=8,5, ИГРУ=1,3, РМА=3,9) проведена объективная оценка состояния зубов и десен.

Результаты исследования слюны:

Свободный гидроксипролин - 1,65 мкг/мл.

Белково-связанный гидроксипролин - 20,8 мкг/мл.

Заключение: обнаружены признаки воспаления с явлениями деструкции межзубных альвеолярных перегородок.

Диагноз: Хронический генерализованный пародонтит средней степени тяжести, с низкой интенсивностью воспалительно-деструктивных изменений пародонтальных тканей. Прогноз - благоприятный.

Таким образом, полученные результаты имеют первостепенное значение для определения целесообразности начала/продолжения/отмены медикаментозного лечения: чем ниже значения показателей активности костного метаболизма и чем ниже значение плотности костной ткани по сравнению с критериями здорового пародонта (определяемые, например, рентгенологически, методом денситометрии), тем больше потребность в назначении специальных средств, усиливающих костный метаболизм.

В результате использования заявляемого способа удалось повысить эффективность диагностики интенсивности воспалительно-деструктивных изменений пародонтальных тканей во всех клинических случаях.