Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТИ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в селекции и агрохимии для повышения защитно-приспособительных механизмов и сохранения продуктивности при действии разных видов стрессов.

Протекторное действие селена и кремния обусловлено оптимизацией пигментного фонда и снижением уровня свободно радикальных процессов до наступления стрессовой ситуации, что позволяет переносить действие неблагоприятных факторов с меньшими повреждениями и быстрее восстанавливать физиологические функции после их окончания. С помощью метода изотопной индикации установлено, что протекторное действие селена и кремния обусловлено также сохранением поглотительной деятельности корневой системы растений в период стрессового влияния и активизацией поглощения азота и включения его в белки надземной массы в период восстановления после перенесенного стресса.

Известен способ предпосевной обработки семян сельскохозяйственных культур путем выдерживания их в водном растворе тетрагидраттетраборатаммонийдиформамида, что обеспечивает повышение энергии прорастания и всхожести семян (RU 2539488).

Известен способ стимуляции всхожести семян зерновых культур, включающий предпосевную обработку семян водным раствором бисэтан-1,2-дикарбонатэтилендиаммония (RU 2482678).

Известен способ стимуляции всхожести семян, включающий предпосевную обработку семян водным раствором трис(2,2-дихлорциклопропилметил)бората (RU 2474118).

Известен способ обработки посадочного материала путем замачивания семян перед посевом в водном растворе комплексонатов магния и цинка с иминодиянтарной кислотой (RU 2552056).

Известен способ улучшения адаптивной реакции растений на изменение условий окружающей среды с использованием жидкой минеральной композиции для опрыскивания листьев следующего состава: общий аммиачный азот N (%) 0,08-2%, калий, выраженный в K₂O (%) 3-6%, магний, выраженный в MgO (%) 0,4-0,8%, натрий, выраженный в Na₂O (%) 1-2%, кальций, выраженный в СаО (%) 0-0,5%, общие фосфаты, выраженные в SO₃ (%) 3-6%о, общий фосфор, выраженный в Р₂О₅ (%) 0%, хлориды Сl (%) 1-2%, бикарбонаты (в % НСО₃) 1,2-3,0%, бор (%) 0,1-0,2%, медь (%) 0,018-0,03%, марганец (%) 0,00005-0,006%, йод (%) 0,02-0,04%, цинк (%) 0,00005-0,006%, железо 0,0002-0,003, вода до 100% (RU 2519233) (взят за прототип). Процентное содержание выражено в массовых процентах относительно общей массы композиции. В изобретении указаны три формулы композиций, каждая из которых находится в вышеприведенных интервалах. Различные ингредиенты добавляют в водопроводную воду при окружающей температуре, затем раствор тщательно перемешивают до получения стабильной жидкой композиции. После этого жидкую композицию фильтруют для удаления нерастворившихся твердых веществ, чтобы получить готовую к использованию концентрированную прозрачную композицию формулы (I). Изобретение касается также использования жидкой минеральной композиции для опрыскивания листьев, представляющей собой концентрированную композицию формулы (I), включая композицию формулы (II), которую разбавляют в объеме воды, 50-10000-кратном ее объему, предпочтительно 100-5000-кратном ее объему, для усиления адаптивной реакции растений на изменение условий окружающей среды.

Известные способы обработки семян требуют или большое количество микроэлементов, или для их приготовления необходимы дорогие препараты, или разработаны для снижения негативного влияния одного из видов стрессов.

Данное изобретение основывается на наличии общей неспецифической реакции растений - развитии окислительного стресса - при действии любых абиотических стрессов: засухи, засолении, УФ-радиации, гербицидов, затоплении, что позволило предположить существование единого способа снижения их негативного влияния. Селен и кремний входят в состав различных подсистем антиоксидантной защиты, что стало основанием для проведения исследований по их раздельному и совместному применению. Селен является элементом ферментного блока, кремний участвует в синтезе специфических промежуточных антиоксидантных соединений. Преимущество применения кремния связано с тем, что он повышает сопротивляемость к стрессам и не оказывает токсического действия на растения, животных и человека.

Повышение адаптивного потенциала растений достигается применением селена и кремния, протекторное действие которых обусловлено снижением степени развития окислительного стресса, оптимизацией пигментного комплекса - увеличением содержания хлорофилла b и каротиноидов, защищающих структуры фотосинтетического аппарата от повреждений свободными радикалами, а также сохранением поглотительной способности корневой системы во время стресса, активацией поглощения азота и использования его на синтез белков в период репарации. Растения, семена которых обработаны микроэлементами, лучше подготовлены к возможному действию стрессовых факторов, поэтому переносят стресс с меньшими повреждениями и лучше восстанавливаются после его окончания.

Предлагаемый способ позволяет повысить стрессоустойчивость зерновых культур и оценить эффективность приемов, снижающих негативное действие стрессов.

Техническим результатом является расширение арсенала способов предпосевной обработки семян от негативного действия стрессов.

Технической задачей является повышение адаптивного потенциала зерновых культур посредством предпосевной обработки семян селеном и кремнием при действии различных стрессов и сохранение продуктивности растений в этих условиях.

Сущность предложенного способа заключается в следующем.

Семена зерновых культур перед посевом обрабатывают растворами солей селена и кремния (0,01% Na₂SeO₃ и 0,15% Na₂SiO₃⋅9H₂O) при совместном применении. Обработка семян селеном и кремнием осуществляется путем смачивания их соответствующими растворами в количестве равном 5% от веса обрабатываемых семян.

Для оценки эффективности способа повышения устойчивости зерновых культур под влиянием стрессового фактора контрольный вариант семян обрабатывают водой.

Для разработки способа повышения стрессоустойчивости зерновых культур проводились лабораторные и вегетационные опыты, в которых изучались особенности реакции растений на абиотические стрессы различной природы.

В лабораторном опыте семена растений проращивают в рулонной культуре. Фильтровальную бумагу стерилизуют при прокаливании, нарезают на полосы шириной 15 и 5 см. Семена растений в количестве 75 штук раскладывают на фильтровальную бумагу и покрывают полосой бумаги шириной 5 см. Каждую полосу сворачивают в рулон и помещают в стакан, содержащий 75 мл воды, и ставят в термостат с температурой 20-21°С. При достижении растениями возраста двух дней часть рулонов с проросшими семенами оставляют расти на воде - контрольный вариант (без стрессового воздействия), остальные переносят в стрессовые условия на три дня. Затем пятидневные проростки выдерживают на свету 45 минут и определяют фотосинтетические пигменты и малоновый диальдегид (МДА), как показатели стрессоустойчивости растений.

Для определения содержания фотосинтетических пигментов в листьях растений отбирают растительные пробы (Гавриленко и др., 1975). Навески из листьев по 0,2 г, измельченные ножницами, помещают в фарфоровую ступку и растирают с 25 мл 90% ацетоном. Для количественного определения экстракт наливают в кювету (d=1 см) спектрофотометра. Вторая кювета заполняется чистым растворителем. Кювету помещают в кюветную камеру спектрофотометра (Helios Omega UV-VIS) и определяют оптическую плотность (D) при длинах волн, соответствующую максимум определяемых пигментов.

Содержание хлорофилла определяют по формуле по Вернера (90% ацетон):

С_а=12,21D663-2,81D646;

C_b=20,13D646-5,03D663,

где C_a, С_b - концентрация хлорофиллов а, b, мг/л.

Затем вычисляли содержание пигментов в растительном материале, мг/г сырой массы:

где С - концентрация пигментов, мг/л; V - объем вытяжки, мл (25 мл); Р - навеска растительного материала, г.

Уровень свободно радикальных процессов оценивают по накоплению МДА, содержание которого определяют по реакции с тиобарбитуровой кислотой на спектрофотометре (Полесская и др., 2006). Содержание МДА (мМ/г сырой массы) определяют по формуле:

U₁ - объем гомогената, взятый на определение, мл;

U₂ - конечный объем смеси, мл; U₃ - общий объем смеси, мл;

Р - навеска, г; 1 - длина кюветы, см;

ε - коэффициент экстинкции 156 мМ^-1⋅см^-1;

10 коэффициент перевода.

Стрессоустойчивость оценивают по сравнению с контролем (без стрессового воздействия). Чем больше процент отклонения от контрольного варианта (без стрессового воздействия), тем больше повреждений в растениях под действием стресса и ниже стрессоустойчивость растений.

Для оценки протекторного действия селена и кремния при совместном их применении использовался метод изотопной индикации. Определяли поглотительную способность корневой системы и ассимиляцию поступившего азота (¹⁵N). Для этого перед началом стресса и после его окончания вносили в сосуд меченый азот в виде Ca(¹⁵NO₃)₂ с обогащением 95АТ%. Через короткие экспозиции (1, 3 и 7 сутки) отбирали растительные пробы для оценки поглотительной способности корневой системы и ассимиляции поступившего азота (¹⁵N) в растительный белок. Образцы анализировали на изотопном масс-спектрометре Delta V Advantaqe.

Пример 1. Лабораторные эксперименты проводили с использованием рулонной культуры в условиях осмотического стресса, индуктором которого являлся раствор сахарозы с осмотическим давлением 3 атмосферы. Изучали влияние разных концентраций биогенных элементов селена и кремния при раздельном и совместном применении с целью выбора оптимальной концентрации этих элементов по влиянию на морфометрические параметры ярового ячменя сорта Надежный. Изучали следующие концентрации селена: 0,01 и 0,02%; кремния: 0,015 и 0,15%.

Семена ярового ячменя перед посевом обрабатывали растворами солей селена (Na₂SеO₃) и кремния (Na₂SiO₃⋅9H₂O). Обработка семян осуществлялась путем смачивания их соответствующими растворами в количестве равном 5% от веса обрабатываемых семян. Для оценки эффективности предпосевной обработки семян (ПОС) биогенными элементами под влиянием стрессового фактора контрольный вариант семян обрабатывали водой.

В лабораторном опыте семена растений проращивали в рулонной культуре. При достижении растениями возраста трех дней часть рулонов с проросшими семенами оставляли расти на воде - контрольный вариант (без стрессового воздействия), остальные переносили в стрессовые условия на два дня.

Пятидневные проростки визуально делили на 3 группы по длине ростка. Стрессоустойчивость оценивали по сравнению с контролем (без стрессового воздействия). Чем больше процент отклонения от контрольного варианта (без стрессового воздействия), тем больше повреждений в растениях под действием стресса и ниже стрессоустойчивость растений. Результаты эксперимента представлены в таблице 1, 2.

На основании полученных данных были выбраны и исследованы концентрации селена и кремния для совместного действия: Se_0,01+Si_0,015, Se_0,01+Si_0,15, Se_0,02+Si_0,015, Se₀,₀₂+Si_0,15.

Результаты определения всхожести семян даны в таблицах 3, 4.

Таким образом, для проведения дальнейших исследований с целью повышения стрессоустойчивости культур была выбрана совместная концентрация селена и кремния Se₀,₀₁+Si_0,15, как наиболее оптимальная.

Пример 2. В лабораторном опыте оценивали влияние ПОС селеном и кремнием при раздельном и совместном применении на прорастание ячменя (Hordeum vulgare L.) сорта Hyp в условиях различного стрессового воздействия. Семена выращивали в темноте в рулонной культуре первые двое суток на воде, затем на растворах стрессоров - сахарозы (осмотический стресс), NaCl, Cd(NO₃)₂, диквата. Физиологический статус проростков оценивали после выдерживания на свету 45 минут.

Влияние осмотического, солевого стрессов, действие кадмия и гербицида оценивалось по накоплению малонового диальдегида и состоянию пигментного комплекса.

Неспецифическая адаптация, развивающаяся при любом стрессовом воздействии, выражается в развитии окислительного стресса, который приводит к нарушению и повреждению липидов мембран и накоплению продукта их распада - МДА. МДА рассматривают как критерий интенсивности протекания перекисного окисления липидов (ПОЛ) и повреждения мембран.

В оптимальных условиях ПОЛ поддерживается на постоянном уровне, благодаря многоуровневой антиоксидантной защите. Смещение равновесия является ответом на стрессовое воздействие. Прорастание семян, переход с роста в темноте к росту на свету сопровождается активизацией процесса свободно-радикального окисления и высокими значениями МДА. Селен и кремний, входя в состав системы антиоксидантной защиты, снижают уровень стрессовой нагрузки, что приводит к уменьшению содержания МДА (табл. 5).

В основе протекторного действия селена лежит функционирование ряда белков, активный центр которых содержит селеновые аминокислоты. Существует предположение об участии селена в регулировании активности ферментов и гормонов в синтезе защитных белков. Кремний относится к другому звену антиоксидантной защиты, предположительно связанному с изменением структуры соединений, элементом которых он является.

Действие всех изучаемых стрессов приводило к подавлению ростовых процессов, что связано с необходимостью использования белков на формирование антиоксидантов, обеспечивающих защиту от негативного воздействия.

Установлено, что разные типы стрессов влияли на эффективность действия селена и кремния. При раздельном применении протекторное действие селена выше при осмотическом и солевом стрессах, кремния - при действии кадмия. ПОС селеном совместно с кремнием снижает окислительный статус проростков при всех негативных воздействиях.

В оптимальных условиях прорастания все изучаемые варианты ПОС также приводят к снижению содержания МДА, что сопровождается повышением содержания хлорофилловых пигментов, в основном за счет оптимизации их антенной функции, увеличения содержания хлорофиллов в светособирающем комплексе фотосистемы.

Таким образом, предпосевная обработка семян селеном и кремнием при совместном их действии наиболее эффективно снижала негативное влияние различных абиотических стрессов, предупреждая деструкцию липидов мембран и активизируя формирование фотосинтетических пигментов в процессе деэтиоляции.

Пример 3. В условиях вегетационного опыта при изучении раздельного и совместного применения селена и кремния было также показано преимущество одновременной обработки семян этими элементами. Опыты проводили с яровым ячменем сорта Hyp. Стрессовым фактором в опыте являлась почвенная засуха, которая осуществлялась путем прекращения полива растений на VI этапе органогенеза и продолжалась до достижения растениями влажности устойчивого завядания (14% ПВ).

Вегетационный опыт проводили в почвенной культуре на дерново-подзолистой среднесуглинистой почве со средней обеспеченностью основными элементами питания (гумус 2,3%; Р₂О₅, К₂О - IV класс). Почву известковали по полной дозе Нг.

В опыте анализировали физиологическое состояние растений до начала стрессового воздействия. Определено, что уровень свободнорадикальных процессов был примерно в 2 раза ниже при применении микроэлементов, чем в контрольном варианте (без ПОС), о чем свидетельствует содержание МДА (табл. 6).

В растениях было повышено содержание хлорофилла а на 16-22%, хлорофилла b - до 36%, каротиноидов - до 25% в зависимости от варианта ПОС. То есть растения были подготовлены к возможному стрессовому воздействию. В связи с этим действие окислительного стресса было выражено слабее (табл. 7).

Содержание хлорофилла а возрастало, а необходимости в пигментах фотозащиты не было, содержание хлорофилла b и каротиноидов поддерживалось на уровне контроля. Содержание МДА, показателя стрессовой нагрузки также было ниже, чем в контроле. В большей степени эти закономерности были выражены в варианте с совместным применением селена и кремния, поскольку при их использовании были задействованы двойные механизмы антиоксидантной защиты и ферментативное звено, где присутствует селен и структурные изменения соединений кремния. Поэтому реализация заложившихся элементов продуктивности больше, соответственно меньше потерь продуктивности.

Для выяснения степени и механизма влияния стрессовых ситуаций на развитие зерновых культур и для определения действия микроэлементов на устойчивость растений к неблагоприятным условиям внешней среды использовали метод меченых атомов. Изучали влияние почвенной засухи при ПОС селеном и кремнием на процессы поглощения и дальнейшей ассимиляции нитратных форм азота. Ограничение водообеспечения оказывало существенное влияние на процессы поступления в надземные органы растений экзогенных нитратов. Активность корневой системы растений является одним из показателей физиологического состояния растений и определяется по способности поглощать меченый нитратный азот.

Общая засухоустойчивость растений зависит не только от способности противостоять негативному влиянию водного стресса во время самой засухи, но и от скорости восстановления физиологических процессов после ее окончания.

Для изучения протекторного влияния селена и кремния на снижение негативных последствий засухи при возобновлении оптимального полива растений вносили небольшое количество меченого нитратного азота (10 мг) при отливе растений (вместе с поливной водой). Анализ размеров обогащения стабильным изотопом азота вегетативных органов растений при коротких экспозициях после внесения меченого азота (от 1 до 3 и 7 суток) позволил оценить скорость восстановления процессов поглощения азота корневой системой зерновых культур после прекращения засухи в зависимости от ПОС селеном и кремнием.

Интенсивность поглощения азота (¹⁵N) в период действия стресса и после его окончания в период репарации может свидетельствовать об уровне реализации адаптивного потенциала в зависимости от применяемых агрохимических средств (рис.).

Показано, что ПОС селеном и кремнием способствовала лучшему поглощению ¹⁵N корнями ячменя и более активному включению меченого азота в белки надземной массы растений по сравнению с контрольным вариантом. Причем ПОС селеном и кремнием существенно стимулировала поглощение нитратов и включение его в белки на протяжении всего периода экспозиции после внесения метки.

Таким образом, протекторное действие селена и кремния обусловлено оптимизацией пигментного фонда, снижением уровня свободнорадикальных процессов до наступления стрессовой ситуации, сохранением поглотительной деятельности корневой системы в период действия стрессора, активизацией поглощения азота и включения его в белки надземной массы в период репарации. Все это позволяет переносить действие стрессовых факторов с меньшими повреждениями и быстрее восстанавливать физиологические функции после их окончания, что в конечном итоге сохраняет продуктивность растений или уменьшает ее потери.

* ∑ пигментов - ∑ хлорофиллов а, b, каротиноидов, мкг/100 г сырой массы;

** МДА - малоновый диальдегид, мкМ/г сырой массы