Способ выявления ДНК сальмонелл (Salmonella spp.) в биологическом материале животных, продуктах питания и кормах животного и растительного происхождения

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний а именно к средствам диагностики инфекции у животных, как в практике ветеринарной службы, так и для научных исследований.

Известен способ определения микроорганизмов рода Salmonella, включающий отбор биоматериала в виде клоакальных смывов или патологического материала сельскохозяйственных птиц, выделение ДНК, выявление геномной ДНК микроорганизма рода Salmonella в ПЦР с использованием специально подбранных праймеров (патент RU 2360004, кл. C12Q 1/68, G01N 33/569, 2009 г.).

Наиболее близким является способ молекулярно-генетической идентификации генома возбудителя ДНК сальмонелл с помощью полимеразной цепной реакции включающий выделение ДНК из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя ДНК сальмонелл олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измерение специфического сигнала и сигнала контроля по каналам соответствующих красителей и интерпретацию результатов (патент RU 2410440, кл. C12Q 1/68, G01N 33/569, 2011 г., стр. 28).

Однако в известном способе последовательность непосредственно читается по электрофореграмме. Длина фрагмента, который может быть расшифрован этим методом, ограничивается разрешающей способностью метода гель-электрофореза, кроме того - ограниченные функциональные возможности.

Общим недостатком известных технических решений является отсутствие возможности получения достоверной диагностики выявления генома возбудителя сальмонелл (Salmonella spp.)

Техническим результатом является получение достоверной диагностики возбудителя ДНК сальмонелл (Salmonella spp.) в биологическом материале, продуктах питания и кормах животного и растительного происхождения.

Технический результат достигается тем, что в способе выявления ДНК сальмонелл (Salmonella spp.) в биологическом материале, продуктах питания и кормах животного и растительного происхождения включающий выделение ДНК сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома сальмонелл (Salmonella spp.) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измерение специфического сигнала и сигнала контроля по каналам соответствующих красителей и интерпретацию результатов согласно изобретению проводят флуоресцентную детекцию, измеряют по каналу JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала ДНК сальмонелл (Salmonella spp.), а по каналу FAM/Green сигнал внутреннего контрольного образца, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, а интерпретацию результатов проводят на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотид-ных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК сальмонелл (Salmonella spp.) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

- прямой праймер

- обратный праймер

- зонд

- прямой праймер

- обратный праймер

- зонд.

Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики возбудителя ДНК сальмонеллы в биологическом материале, продуктах питания и кормах животного и растительного происхождения проводят реакцию в одной ПЦР-пробирке (one-tube) с использованием специфичных для участка генома сальмонелл (Salmonella spp.) олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага Т4: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики сальмонелл (Salmonella spp.) как в практике ветеринарной службы, так и для научных исследований, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Сущность изобретения поясняется чертежами, где представлены скриншоты графиков, на фиг. 1 - представлен канал FAM/Green сигнал внутреннего контроля, на фиг. 2 - канал JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала ДНК сальмонелл (Salmonella spp.), фиг. 3 - количественные данные таблица количественных данных для Cycling A.Yellow (Salmonella spp.) и A. Green (ВКО).

Способ выявления ДНК сальмонелл (Salmonella spp.) в биологическом материале, продуктах питания и кормах животного и растительного происхождения осуществляется следующим образом

Предварительно сорбционным методом выделяют ДНК генома возбудителя сальмонелл (Salmonella spp.) и для исследования используют следующий материал:

- Цельная кровь. Кровь забирается в пробирку с 6% ЭДТА из расчета 50 мкл раствора ЭДТА на 1 мл крови, закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают.

- Фрагменты паренхиматозных органов отбирают в стерильный контейнер;

- Фекалии весом 5 г отбирают в стерильный пластиковый контейнер;

- Плацента и плодовые оболочки от абортировавших животных отбирают в стерильный контейнер;

- Молоко, отбирают в объеме 10-30 мл в стерильную посуду;

- Продукты питания отбирают в стерильные контейнеры;

- Куриные эмбрионы, яйца;

- Мясо птицы, свинина, продукты переработки, субпродукты;

- Корма животного и растительного происхождения;

- Клеточные культуры.

Затем проводят постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции с добавлением внутреннего положительного контроля, в качестве которого используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл и проводят 45 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК сальмонелл (Salmonella spp.) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

- прямой праймер

- обратный праймер

- зонд

- прямой праймер

- обратный праймер

- зонд.

Далее накопление флуоресцентного сигнала измеряют по каналам: JOE(HEX)/Yellow для специфического сигнала; FAM/Green для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.

Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов.

Выбор последовательности и расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов.

Праймеры, специфичные для сальмонелл (Salmonella spp.) были отобраны на основе митохондриальной последовательности ДНК генома сальмонелл (Salmonella spp.) (Salmonella enterica strain DA34833 chromosome, complete genome, код доступа: CP029595.1, участок между 1313797 и 1313904). Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд SalP (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров BBrF1 и BBrR1). Для гашения самопроизвольной флуоресценции на 3'-конце олигонуклеотидного зонда прикреплен гаситель BHQ-1 Зонд был помечен красителем HEX. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.

В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.

Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Fam. Используя программу «0ligo 6.0» описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.

Пример конкретного осуществления способа выявления генома возбудителя сальмонелл (Salmonella spp.) в биологическом материале, продуктах питания и кормах животного и растительного происхождения состоит из нескольких этапов.

Подготовка исследуемых проб

- Пробы цельной крови, консервированной ЭДТА, культуры клеток используют для выделения ДНК без предварительной подготовки.

- Из фекалий (1-5 г) готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе. Взвесь фекалий декантируют в течение 5-10 минут. Отбирают 1 мл надосадочной жидкости и переносят в чистую пробирку 1,5 мл, центрифугируют при 5000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, в течение 5 мин. Экстракцию РНК из осветленного экстракта фекалий проводят по возможности, сразу. При необходимости хранения замораживают.

- Исследуемые пробы тканей, органов и продуктов (небольшие кусочки до 1 г весом) гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков или автоматических гомогенизаторов. Затем готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 600-1600 g (3000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 2 мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции ДНК.

- При исследовании куриных эмбрионов в скорлупе прокалывают отверстие и отбирают стерильным шприцем в пробирку объемом 1,5 мл 1,0-1,5 мл аллантоисной жидкости.

- Молоко в объеме до 10 мл центрифугируют при 3 тыс об/мин в течение 10-15 мин. Надосадочную жидкость осторожно отбирают, оставив над осадком примерно 0,2 мл жидкости. Осадок ресуспендируют в оставшейся надосадочной жидкости и 0,1 мл суспензии используют для выделения ДНК.

- Корм и пищевую продукцию тщательно гомогенизируют, готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе. Декантируют в течении 10 минут. Отбирают 1 мл надосадочной жидкости и переносят в чистую пробирку 1,5 мл, центрифугируют при 5000 об./мин на центрифуге «MiniSpin» (Eppendorf, Германия) в течение 5 мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции ДНК.

Проведение анализа

Исследование осуществляют с помощью набора реагентов «ПЦР-САЛЬМОНЕЛЛЕ3-ФАКТОР».

Анализ состоит из трех этапов:

- экстракция НК (на этом этапе дополнительно используют реактивы для экстракции, например набор «ДНК/РНК-С-ФАКТОР»);

- проведение ПЦР РВ;

- учет результатов анализа.

Экстракцию (выделение) НК из исследуемых проб проводят следующим образом.

Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательный контрольный образец (ОКО), по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) SALMONELLA в качестве которого используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, если концентрация копий нуклеотидных последовательностей отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов.

Вносят исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы вносят ОКО (пробирку обозначить как ВК-).

Выделяют ДНК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.

Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С.

Проводят одноэтапную ПЦР РВ в одной пробирке.

Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПНР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах:

1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы);

2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).Составы наборов приведены в Таблицах 1 и 2.

Наборы используют в соответствии инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-САЛЬМОНЕЛЛЕ3-ФАКТОР» для выявления ДНК сальмо-нелл (Salmonella spp.) в биологическом материале, продуктах питания и кормах животного и растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени ТУ 21.10.60-144-51062356-2017 (http://www.vetfaktor.ru/.).

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл. Успешное прохождение реакции контролируют, используя положительный контрольный образец (ПКО) сальмонелл (Salmonella spp.), внутренний контрольный образец (ВКО) сальмонелл (Salmonella spp.) и ДНК БУФЕР, где для внутреннего контрольного образца (ВКО) используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца (ПКО) используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК сальмонелл (Salmonella spp.) и фрагмент генома бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1, взятых по 5000 копий специфического та в 10 мкл (в соотношении 1:1).

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:

5 мкл ПЦР смесь сальмонелл (Salmonella spp.)

10 мкл смеси ПЦР БУФЕР сальмонелл (Salmonella spp.)

0,5 мкл TAQ POLYMERASE

Затем перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием. Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси. Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:

а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;

б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую вносят по 10 мкл ДНК соответствующей пробы;

в) в пробирку положительный контроль ПЦР (К+) - 10 мкл ПКО сальмонелл (Salmonella spp.)

Проводят реакцию ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.

Для проведения амплификации был использован прибор «Rotor Gene» Температурно-временной режим амплификации на «Rotor Gene», представлен в таблице 3.

Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора. Программируют прибор согласно инструкции производителя.

Далее проводят интерпретацию результатов анализа. Во всех пробах за исключением пробы - отрицательный образец - (К-) наблюдается кривая роста флуоресценции (фигура 1). В четырех пробах, включая клинический образец к88_3668 и положительный контрольный образец (+) в двух повторах, наблюдается кривая роста флуоресценции. В пробирке -отрицательный образец - (К-) - кривая роста флуоресценции отсутствует (фигура 2).

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору и в соответствии с Приложениями 1, 2, 3 и 4 Инструкции.

Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.

Для доказательства эффективности использования ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого технического решения с прототипом, в котором использовался метод ПЦР с электрофоретической детекцией. Оказалось чувствительность ПЦР с флуоресцентной детекцией при обнаружении ДНК сальмонелл на 3,5-4,3% выше, чем ПЦР с электрофоретической детекцией.