Способ выявления ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) у птиц

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у птиц.

Известен способ определения бактерий семейства Chlamydiaceae, (патент РФ 2486255, кл. C12Q 1/68, 2013 г.), включающий амплификацию бактериальной нуклеиновой кислоты в исследуемом материале путем проведения полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных прай-меров с последовательностями, не менее чем на 75% гомологичными последовательностям SEQ ID NO:1hSEQ ID Ж):2, и зонда с последовательностью, не менее чем на 75% гомологичной последовательности SEQ ID NO:3, содержащего на 5' и/или 3' концах метки, где в качестве меток зонда выступают флуоресцентные красители.

Также известен способ выявления хламидий в клинических образцах методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени (патент РФ №2241042, C12Q 1/68, 2004 г. - прототип), включающий выделение ДНК из биологического материала от инфицированных особей сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции - с добавлением внутреннего положительного контроля и проведением последовательно 45 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда, положительного и отрицательного контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией.

Общим недостатком известных технических решений является не достаточная чувствительность, что влияет на достоверность диагностики выявления ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci), являющийся возбудителем широкого спектра орнитозов.

Техническим результатом является получение достоверной диагностики возбудителя ДНК орнитоза (Сhlаmydophila psittaci) у птиц. Технический результат достигается тем, что в способе выявления ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) у птиц, включающем выделение ДНК из биологического материала сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции - с добавлением внутреннего положительного контроля и проведением последовательно не более 40 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда, положительного и отрицательного контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей для специфического сигнала и сигнала внутреннего контроля и интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, согласно изобретению биологический материал отбирают от инфицированных птиц, при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца - смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

при этом накопление флуоресцентного сигнала измеряют по каналам: JOE(HEX) /Yellow для специфического сигнала ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) и FAM/Green для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) присутствует и результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophilapsittaci) отсутствует и результат реакции - отрицательный.

Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики возбудителя ДНК орнитоза (Chlamydophila psittaci) птиц проводят реакцию в одной ПЦР-пробирке (one-tube) с использованием специфичных для участка генома орнитоза (Chlamydophila psittaci) олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага Т4: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, так как относится к средствам диагностики орнитоза (Chlamydophila psittaci) у птиц, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Сущность изобретения поясняется чертежами, где представлены скриншоты графиков, на фиг. 1 - представлен канал FAM/Green - для тестирования сигнала от внутреннего контрольного образца - ВКО; на фиг. 2 Канал JOE(HEX)/Yellow - для тестирования наличия ДНК орнитоза (Chlamydophila psittaci), фиг. 3 - таблица количественных данные для Cycling A.Green (ВКО) u для Cycling A.Yellow ((Chlamydophila psittaci)).

Способ выявления ДНК орнитоза (Chlamydophila psittaci) у птиц осуществляется следующим образом.

Предварительно выделяют ДНК генома возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) из биологического материала, взятый от инфицированных птиц по выбору: мазки со слизистых, фрагменты тканей и органов, моча сорбционным методом. Затем проводят постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции с добавлением внутреннего положительного контроля, в качестве которого используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, если концентрация копий нуклеотидных последовательностей отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов, далее проводят 45 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК орнитоза (Chlamydophila psittaci) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, если соотношение будет отклоняться в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Фрагмент генома ДНК орнитоза (Chlamydophila psittaci) и фрагмент генома бактериофага Т4 представлены следующими нуклеотидными последовательностями:

Далее по накоплению флуоресцентного сигнала измеряют по каналам: JOE(HEX) /Yellow для специфического сигнала ДНК орнитоза (Chlamydophila psittaci); FAM/Green для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, т.к. присутствует ДНК орнитоза, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, ДНК орнитоза отсутствует.

Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, что повышает чувствительность и специфичность, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов.

Выбор последовательности и расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов.

Праймеры, специфичные для ДНК Chlamydophila psittaci были отобраны на основе консервативного участка гена ompA (Uncultured Chlamydia sp.clone F09 major outer membrane protein (ompA) gene, partial cds, partial sequence, MH542161.1, участок между 44 и 217) и спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems). Выбранные участки ДНК были исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Термодинамический анализ выбранных праймеров был выполнен с помощью Vector NTI.

Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклео-тидный флуоресцентно-меченный зонд Ch-ps-Z (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Ch-ps-F и Ch-ps-R). Зонд был помечен красителем R6G. Для гашения самопроизвольной флуоресценции на 3'-конце олигонуклеотидного зонда прикреплен гаситель BHQ-1. Основные свойства рассчитанных олигонуклеоти-дов, определившие возможность их использования в ПЦР, были описаны с помощью программы "Oligo 6.0".

В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.

Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Fam. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.

Пример конкретного осуществления способа выявления ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) у птиц.

Для исследования используют от инфицированных возбудителем орнитоза (Chlamydophilapsittaci) птиц по выбору следующий материал:

Мазки и соскобы слизистых оболочек (ротоглотки, конъюнктивы, клоаки). Снимают с помощью стерильного зонда, зонд помещают в пластиковую микропробирку объемом 1,5 мл с 0,5 мл стерильного физиологического раствора;

- фрагменты тканей и паренхиматозных органов павших или вынужденно убитых птиц (миндалины, селезенка, легкие, печень, кусочки плодовых оболочек, аборт-плоды). Отбирают в стерильный контейнер; - помет птиц, массой не менее 0,5 г, в сухой стерильный контейнер.

Затем проводят подготовку проб. Соскобы со слизистых конъюнктивы и ротоглотки в физиологическом растворе исследуют без предварительной подготовки.

Исследуемые пробы тканей и органов гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, добавляют пятикратный объем стерильного физиологического раствора или фосфатного буфера и тщательно перемешивают. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и отстаивают в течение 5-7 мин после чего откручивают на миницентрифуге при 1,5-2,0 тыс. об/мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции ДНК.

Из помета птиц готовят 10% суспензию в физиологическом растворе, центрифугируют при 1,5 тыс об/мин в течение 5 мин, 100 мкл надосадочной жидкости используют для экстракции ДНК.

Далее осуществляют анализ, состоящий из трех этапов:

экстракция нуклеиновых кислот (НК);

проведение реакции ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;

учет результатов анализа. Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое-количество одноразовых пробирок объемом - 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) в качестве которого используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл.

Проводят одноэтапную ПЦР РВ в одной пробирке. Для проведения ПЦР используют наборы позволяющие специфически амплифицировать фрагмент генома возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) и ДНК внутреннего положительного контроля (бактериофага Т4) в мультиплексной полимеразной цепной реакции. Детекция продуктов амплификации осуществляется в режиме реального времени с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.

Наборы состоят из комплектов реагентов для проведения ПНР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2).

Наборы выпускаются в двух вариантах:

1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы);

2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы). Составы наборов приведены в Таблицах 1 и 2.

Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению «ПЦР-ОРНИТОЗ-ФАКТОР», набора реагентов для выявления ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. ТУ 21.10.60-107-51062356-2015. Для диагностики in vitro http://www. vetfaktor.ru/.

* Возможна легкая опалесценция

Вносят исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы вносят отрицательный контрольный образец (ОКО) (пробирку обозначают как ВК-).

Выделяют ДНК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.

Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С.

Подготавливают образцы к проведению ПЦР следующим образом.

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.

Успешное прохождение реакции контролируют, используя положительный контрольный образец (ПКО) (Chlamydophila psittaci), внутренний контрольный образец (ВКО) (Chlamydophila psittaci) и ДНК БУФЕР, где для внутреннего контрольного образца (ВКО) используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца (ПКО) используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК (Chlamydophila psittaci)n фрагмент генома бактериофага Т4 в соотношении 1:1, взятых по 5000 копий специфического фрагмента в 10 мкл (в соотношении 1:1).

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:

5 мкл ПЦР смесь Chlamydophila psittaci

10 мкл смеси ПЦР БУФЕР Chlamydophila psittaci

0,5 мкл TAQ POLYMERASE

Затем перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием. Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси. Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:

а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;

б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую вносят по 10 мкл ДНК соответствующей пробы;

в) в пробирку положительный контроль ПЦР (К+) - 10 мкл ПКО Chlamydophila psittaci.

Далее проводят реакцию ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.

Для проведения амплификации был использован прибор «Rotor-Gene Q»

Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора. Программируют прибор согласно инструкции производителя.

Далее проводят интерпретацию результатов анализа. Во всех пробах за исключением пробы - отрицательный образец - (К-) наблюдается кривая роста флуоресценции (фиг. 1, 3). В четырех пробах, включая клинический образец k88_3668 и положительный контрольный образец (+) в двух повторах, наблюдается кривая роста флуоресценции. В пробирке - отрицательный образец - (К-) - кривая роста флуоресценции отсутствует (фиг. 2, 3).

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору.

Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.

Для доказательства эффективности использования ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с применением разных видов контроля с различными формами материала бактериофага Т4: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом проводился сравнительный анализ чувствительности и специфичности заявляемого с прототипом. В результате исследований чувствительность и специфичность заявляемого способа на 1,5-2% выше, чем у прототипа.