Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ЛАБОРАТОРНОЙ УЛЬТРАЗВУКОВОЙ ДИАГНОСТИКИ РАННИХ СТАДИЙ ЖЕРЕБОСТИ

Изобретение относится к ветеринарии и способам диагностики беременности самок сельскохозяйственных животных, в том числе и ранних сроков беременности кобыл. Изобретение может использоваться при неинвазивном ультразвуковом исследовании крови самок животных. Способ можно реализовывать как самостоятельный метод диагностики, так и в качестве дополнительного к традиционным ветеринарным клиническим методам в связи с его простотой и дешевизной. Актуальной задачей является повышение эффективности и снижение трудоемкости ранней диагностики беременности кобыл.

Из уровня техники известен способ диагностики беременности с 1,5-месячного срока после «отбоя» методом ректального обследования [1]. Недостатком данного способа является высокая трудоемкость и сложность его проведения. Также известен способ диагностики беременности коров [2] на основе радиометрического измерения температуры внутренних органов. Недостатками данного способа являются сложность его проведения и необходимость использования дорогостоящего оборудования: СВЧ-модулятора, радиотермографа и антенн-аппликаторов, что требует высокой квалификации оператора.

Известны также методы лабораторной диагностики беременности продуктивных животных, однако простых в исполнении, достоверных методик диагностики ранних стадий жеребости или стельности крайне мало. Ранняя диагностика жеребости у кобыл в борьбе за повышение процента жеребости имеет большое значение, позволяя в соответствии с результатами диагноза либо прекратить случку кобылы зажеребевшей, но проявляющей ложную охоту, либо продолжать случку, применяя меры к недопущению оставления кобылы неоплодотворенной.

Другой метод раннего распознавания жеребости кобыл - анализ мочи на содержание гормона фолликулина, предложенный проф. В. Цондаком - основан на появлении в моче у жеребых кобыл большого количества оварийного гормона фолликулина. Метод сложен, высокозатратен и требует использования специального оборудования, лабораторных животных и тест-наборов.

Метод распознавания жеребости по уровню прогестерона в плазме крови кобылы осуществим на 18-25-е сутки после осеменения. (В течение беременности высокий уровень этого гормона поддерживается желтым телом. Но если оплодотворения не произошло, то на 2-ой неделе происходит обратное развитие желтого тела, что приводит к стремительному упадку концентрации прогестерона, а к началу 3-ей недели содержание минимально.) Исследованием на прогестерон можно с уверенностью выявить только бесплодие- концентрация гормона ниже 1 нг/мл. Точность определения жеребости существенно ниже (90%), поэтому при концентрации гормона более 1 нг/мг ставится условный положительный диагноз.

С середины второго месяца вплоть до 5-го в крови жеребой кобылы присутствует гонадотропин, гормон, образующийся только в эндометрии жеребой матки и отвечающий за работу половых органов во время беременности. Наилучшие диагностические результаты получаются при взятии крови на третьем месяце жеребости. Точность метода доказана для сроков больше 100 дней с момента оплодотворения. Определить концентрацию эстрогенов можно пробой Кубони (визуальная оценка флуоресценции) или радиоиммунологическим анализом.

Следовательно, к существенным недостаткам большинства методов лабораторной диагностики жеребости можно отнести наличие разных по достоверности результатов в разные недели исследования, а также необходимость точно знать дату покрытия.

Наиболее близким решением к заявляемому и принятым за прототип является способ диагностики беременности у коров [3]. Способ включает в себя аускультацию шумов маточных артерий, их последующий компьютерный анализ с построением амплитудно-частотной характеристики шумов и наглядным представлением этих шумов в графическом виде. Согласно изобретению, проводят аускультацию кровеносных сосудов малого таза и полученные результаты сравнивают с эталонными. При наличии на амплитудно-частотной характеристике пиков в районе 200 Гц и 2000 Гц, превышающих более, чем на 4 дБ основную кривую амплитудно-частотной характеристики, делают заключение о наличии беременности со сроком 2-3 месяца.

Недостатком данного прототипа является техническое ограничение (оборудование и программное обеспечение), ограничение минимального срока стельности при его установлении и узкая направленность изобретения - только самки КРС; следовательно, способ не применим для лошадей. При этом существенными отличиями заявленного изобретения от указанного аналога являются: обработка проб амплитудно-модулированной акустической волной, проведение только лабораторной диагностики методом световой микроскопии, использование для исследования малого объема крови и возможность определения ранний стадий (до месяца) жеребости.

Целью предлагаемого изобретения является определение в лабораторных условиях жеребости на основе анализа мазка крови, когда по наличию визуально определимых особенностей состояния форменных элементов крови, по морфологическим особенностям лейкоцитов, при оптимальных условиях воздействия модулированным ультразвуком низкой терапевтической интенсивности, с частотой генерации 0,88 МГц, на живую систему in vitro, определяется состояние самки животного.

Поставленная цель осуществляется путем нахождения оптимальных условий ультразвукового (УЗ) воздействия, направленно приводящего к изменению состояния лейкоцитов только жеребых кобыл - избирательной микро-, макро- и гиперагрегации лейкоцитов - в то время как у нежеребых кобыл морфология и распределение лейкоцитов в поле зрения микроскопа остаются без особенностей, в пределах нормативных показателей.

Задачей заявляемого изобретения является:

- создание способа экспресс-диагностики наличия/отсутствия ранних сроков жеребости при помощи определения цитологических изменений в мазках крови и особенностей клеточного ответа на действие акустических (УЗ) волн низкой терапевтической интенсивности in vitro;

- выявление закономерностей взаимодействия клеток крови жеребых и небеременных животных с ультразвуком безопасного диапазона: минимальной из применяемых терапевтической интенсивности и предельно низкого времени экспозиции.

- расширение арсенала способов диагностики беременности у лошадей.

Способ позволяет регистрировать ухудшение гематологических показателей и строения клеток крови кобыл, а, следовательно, диагностировать наличие или отсутствие жеребости по изменению цитоморфологии, вызванному действием ультразвука на клетки крови.

Техническим результатом заявленного изобретения является:

1) повышение надежности диагностики наличия беременности на начальной стадии, когда клиническая картина еще не выражена;

2) универсальность - возможность определения любой стадии беременности для всех видов животных;

3) быстрое получение результатов лабораторной диагностики на отечественном оборудовании, без больших затрат на биологический материал (достаточно 3 мл крови) и затрат на стоимость обработки;

4) быстрая и дифференцированная диагностика по мазку крови после УЗ воздействия на пробу крови in vitro;

5) возможность использования только простого и доступного в любой ветеринарной клинике метода световой микроскопии;

6) для регистрации наблюдаемых при микроскопии изменений не требуется специфических знаний цитологии и клеточной морфологии, настолько очевидна картина в поле зрения микроскопа.

Указанный технический результат достигается за счет того, что на образцы крови объемом от 3 до 5 мл, помещенные в кювету, воздействуют стоячей амплитудно-модулированной ультразвуковой волной частотой генерации 0,88 МГц, интенсивностью 0,05 Вт/см² и частотой модуляции из диапазона 10-20 Гц, в течении 15-20 с. Образцы крови обрабатывают в абсолютно одинаковых условиях, поддерживают постоянную температуру образцов в кюветах с проточным охлаждением, а также проводят анализ морфологического состояния клеток методами световой микроскопии. При агрегации лейкоцитов, появлении признаков деформации и лизиса ядра и цитоплазмы и при одновременном полном отсутствии изменений в морфологии эритроцитов (отсутствии признаков клеточной деструкции) диагностируют наличие беременности.

Заявленный способ осуществляется следующим образом.

Воздействовали ультразвуком in vitro. Экспозиция УЗ: время от 15 с до 20 с, I_SATA - средняя по пространству и времени интенсивность - 0,05 Вт/см², с несущей частотой 0,88 МГц, частота модуляции из диапазона 10-20 Гц. Отечественные терапевтические аппараты: УЗТ- 1-01Ф; Ультразвук Т-5 и УЗТ-1.02С. Амплитудная модуляция со скважностью 2, модулятор Г3-112 (или любой аналогичный генератор). Объем образов крови 3-5 мл. Кровь брали из периферических вен: вены Сафена и подкожной вены предплечья. Образцы крови лошадей озвучивались в абсолютно одинаковых условиях (площадь излучателя, охлаждение, циркуляция жидкости). Ультразвуковое воздействие на клетки крови, находящейся в кювете, термостатируемой с помощью водяного ультратермостата, осуществлялось с помощью терапевтического излучателя. Стенки кюветы выполнены из пластика или пластмассы, но могут быть изготовлены из любых акустически прозрачных материалов. В качестве охлаждающей жидкости применялась непрерывно циркулирующая дистиллированная вода (т.н. «проточное охлаждение»). Результат воздействия УЗ на клетки сразу же наблюдали в световой микроскоп.

Делали мазки, окрашивали стандартным методом дифференциального окрашивания биопрепаратов [4] и проводили световую микроскопию (микроскоп «Микмед-5», объектив 100х/1,25, окуляр 10х/18). Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Достоверность различий средних значений определяли, используя парный t-критерий Стьюдента; достоверными считали различия при р<0,05. При апробации метода использовали 100 проб крови от кобыл со сроком беременности до 1 месяца и 10 контролей от нежеребых. Анализ результатов проводили на основе регистрации изменения морфологии клеток после УЗ воздействия (фиг. 1-6) и физиологического состояния интактных клеток крови (контроль, фиг. 7).

Отдельные примеры воздействия отработанными режимами приведены ниже.

Пример 1. Интенсивность действующего УЗ 0.05 Вт/см², частота модуляции 10 Гц, время обработки 18 с. На микрофотографии (фиг. 1) видно, что лейкоциты в микро- и макрогруппах, сохранны только сегментоядерные нейтрофилы, почти отсутствуют лимфоциты; много лейкоцитов с лизисом ядра и цитоплазмы.

Пример 2. Интенсивность действующего УЗ 0.05 Вт/см², частота модуляции 12 Гц, 15 с: лейкоциты в группах с лизированным ядром и цитоплазмой, у лимфоцитов деформация ядер (фиг. 2).

Пример 3. Интенсивность действующего УЗ 0.05 Вт/см², частота модуляции 14 Гц, 15-20 с: агрегация лейкоцитов, лизированы ЦПМ и ядро, нет границ ядра и ЦПМ. (фиг. 3).

Пример 4. Интенсивность действующего УЗ 0.05 Вт/см², частота модуляции 16 Гц, 17 с: группами лежащие клетки с признаками деформации и лизиса ядра и цитоплазмы (фиг. 4).

Пример 5. Интенсивность действующего УЗ 0.05 Вт/см², частота модуляции 20 Гц, 20 с: агрегация лейкоцитов, изменение формы и границ ядер (фиг. 5).

При УЗ воздействии теми же параметрами на кровь нежеребых кобыл агрегации не регистрировали. Наблюдали кариолизис и кариорексис отдельно лежащих лейкоцитов, а также анизоцитоз и пойкилоцитоз. (фиг. 6).

На последней фотографии (Фиг. 7) - показаны интактные клетки крови лошади, контрольные образцы.

Для подтверждения беременности использовали данные проведенного позже ректального обследования и данные журналов искусственного осеменения.

Таким образом, проведенные исследования достоверно показывают наличие закономерных изменений. Наиболее ценными, в диагностическом отношении, признаками является повышенная агрегация одновременно клеток белой крови и тромбоцитов, что может быть использовано для ранней диагностики беременности животных. Вероятно, выявленные особенности связаны с изменением вязкости крови жеребых животных на ранних сроках и, безусловно, общим изменением биохимического состава крови.

Использование заявляемого изобретения позволит сократить сроки диагностики беременности на 30-90 дней, снизить затраты на диагностику на 50000 рублей на 10 голов, увеличить количество обследуемых животных и значительно снизить трудоемкость определения жеребости.

В заявленном способе проводится глубокая и быстрая диагностика жеребости. Показано, что в большинстве случаев получаемые эффекты воспроизводимы на практически всех тестируемых объектах. Результаты демонстрируют возможности и направления использования подобных методик в ветеринарной медицине. Таким образом, предлагаемый нами способ позволяет получить объективную, многокомпонентную, важную и достоверную информацию для диагностики.

Литературные источники:

1. Ветеринарное акушерство и гинекология, В.А. Акатов, Г.А. Кононов, А.И. Поспелов, И.В. Смирнов, 1977, С. 223.

2. Патент SU 1591207 А1. Способ диагностики беременности коров. Петросян В.И., Елкин В.А., Семиволос А.М., Чумаков Б.И., Кузьмин Ю.С.

3. Патент RU 2471421 С1, «Способ диагностики беременности у коров»/ Павлов А.В., Смертина Е.Ю., Петляковский А.В.

4. Клиническая гематология животных, А.А. Кудрявцев, Л.А. Кудрявцева. - М.: «Колос» 1974. - 399 с.