Результат интеллектуальной деятельности: Штамм С/2014 вируса Мачупо - возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки, предназначенный для лабораторной оценки эффективности медицинских средств защиты в отношении данного возбудителя

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии, а именно к получению вариантов возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний, предназначенных для исследований по оценке эффективности медицинских средств защиты (МСЗ) в отношении данных патогенов, и представляет собой адаптированный к морским свинкам штамм С/2014 вируса Мачупо - возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки (БГЛ).

Изобретение может быть использовано в вирусологических и иммунологических исследованиях для выявления эффективности медицинских средств защиты в отношении БГЛ.

Боливийская геморрагическая лихорадка (БГЛ) является особо опасной вирусной инфекцией человека, вызывающей тяжелое острое поражение различных органов и тканей с выраженным геморрагическим синдромом, и характеризующаяся высокой летальностью.

Периодически появляющиеся эпидемические вспышки БГЛ [1], а также широкое развитие транспортных и пассажиропотоков делают возможным завоз возбудителя инфекции с больными людьми или инфицированными животными не только в страны Америки, но Европы, и Азии. Ряд вирусологических лабораторий разных стран, в том числе и России, проводят исследования с аренавирусами, при этом сообщается о случаях внутрилабораторных заражений. Так, во время вспышки БГЛ в 1971 году в г.Качабамба при вскрытии больного второй генерации инфекции заразился патологоанатом, который умер, и у него был выделен возбудитель БГЛ - вирус Мачупо, штамм DA [2, 3].

Вирус Мачупо входит в семейство Arenaviridae, род Arenavirus, антигенную группу аренавирусов Нового Света (комплекс Такарибе). Вирус Мачупо вместе с близкородственными вирусами Хунин, Сабиа и Гуанарито составляет группу В аренавирусов Нового Света. По морфологическим, биологическим, молекулярно-генетическим и антигенным характеристикам он наиболее близок к вирусу Хунин, эпидемиологически – предположительно является арбовирусом. Основным природным резервуаром вируса Мачупо являются полусинантропные грызуны Calomus callosus, в частности, - большой вечерний хомячок (Calomus callosus musculinus). Вирус был выделен от грызунов и от больных людей. [3, 4-6].

В случае интродукции этого возбудителя на неэндемичные территории не исключено развитие эпидемии [7]. В связи с этим актуальной является проблема изучения медико-биологических аспектов противоэпидемической защиты от этого экзотического заболевания, включающая разработку средств экспресс диагностики, профилактики и лечения, а также оценку эффективности средств и методов специфической и неспецифической защиты персонала, контактирующего с этим возбудителем, как в клинических, так и лабораторных условиях.

Оценку эффективности защитных препаратов невозможно проводить без наличия адекватной патогенетической модели. Основой обоснования такой модели являются сравнительная оценка клинического течения заболевания, динамика иммунологических и вирусологических показателей и установление сходства и отличий с аналогичным заболеванием человека. Для изучения патогенеза, иммуногенеза, биохимических, метаболических и других реакций в процессе развития заболеваний, вызванных аренавирусами, традиционно используют низших приматов.

При лабораторном изучении биологических свойств аренавирусов Мачупо и Ласса было установлено, что эти возбудители вызывают зависимую от вводимой дозы гибель низших приматов [8-10].

В связи с тем что проведение работ с этими лабораторными животными, инфицированными возбудителями I группы патогенности, связано, во-первых, с высоким риском для персонала лабораторий, во-вторых, с высокими экономическими затратами при проведении исследований на предварительных этапах, сотрудниками ФГБУ «48 ЦНИИ» МО РФ было предложено использовать для предварительного доклинического изучения эффективности защитных препаратов в отношении аренавирусных геморрагических лихорадок в качестве лабораторной модели мелких лабораторных животных – морских свинок [10, 11].

Анализ данных литературы свидетельствует о том, что заболевание у этих животных протекает со слабой или неопределяемой вирусемией, без внешних геморрагических проявлений и заканчивается гибелью [4], уровень которой варьирует от 20 до 80% и не зависит от дозы вводимого вируса.

Одним из атрибутов изучения эффективности защитных препаратов является необходимость достаточно точного определения заражающих доз экспериментальных лабораторных животных, выраженных в ИД₅₀ (ЛД₅₀) для данного вида животных при данном способе инфицирования.

Целью настоящего изобретения является получение штамма С/2014 вируса Мачупо – возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки, предназначенного для лабораторной оценки эффективности медицинских средств защиты в отношении данного возбудителя.

Техническим результатом настоящего изобретения является:

- возможность определения и расчета величины ЛД₅₀ для возбудителя БГЛ, выраженной в БОЕ (бляшкообразующая единица), в экспериментах на модельных лабораторных животных – морских свинках;

- возможность точного расчета инфицирующих доз, выраженных в ЛД₅₀ для морских свинок при заражении лабораторных животных в экспериментальных исследованиях МСЗ;

- возможность получения статистически достоверной информации об эффективности разрабатываемых МСЗ в отношении возбудителя БГЛ.

Указанный технический результат достигается за счет способности полученного штамма С/2014 вируса Мачупо вызывать у морских свинок зависимую от вводимой дозы гибель.

Сущность изобретения заключается в том, что для получения нового варианта штамма вируса Мачупо – возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки, проводили шесть последовательных пассажей через печень морской свинки исходного природного штамма Carvallo, являющегося прототипным штаммом вируса Мачупо. В результате адаптации возбудителя к морским свинкам новый вариант С/2014 вызывает у данных животных гибель, зависимую от дозы вируса.

Новизна изобретения, уровень промышленного применения

Изготовленная культура С/2014 вируса Мачупо - возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки, характеризуется биологической активностью: 1⋅10⁶ БОЕ⋅мл^-1 при титровании на культуре клеток Vero B, 5,0⋅10⁷ ЛД₅₀·мл^-1 при титровании на морских свинках; средним размером негативных колоний (2,3±0,5) мм; отсутствием бактериальной и грибковой микрофлоры; величиной ЛД₅₀·для низших приматов, выраженной в БОЕ – от 0,01 до 0,1; величиной ЛД₅₀·для морских свинок, выраженной в БОЕ – от 0,03 до 0,3.

Подлинность культуры С/2014 вируса Мачупо подтверждена в полимеразной цепной реакции. Адаптированный к морским свинкам вариант С/2014 вируса Мачупо – возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки, вызывает 100% гибель животных при подкожном введении 8 ЛД₅₀ вируса.

Полученному адаптированному к морским свинкам варианту штамма

Carvallo присвоено название «Штамм С/2014 вируса Мачупо - возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки, предназначенный для лабораторной оценки эффективности медицинских средств защиты в отношении данного возбудителя». Штамм С/2014 вируса Мачупо - возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки, относящийся к семейству Arenaviridae, род Arenavirus, депонирован в «Коллекцию штаммов вирусов геморрагических лихорадок I группы патогенности (со статусом национальной коллекции)» ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России за номером НКВ-25 (Приказ начальника ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России №226 от 11 марта 2017 г.).

Проведенные исследования позволили подтвердить ранее установленную возможность получения адаптированных к морским свинкам отдельных штаммов фило- и аренавирусов (сохраняющих высокий уровень вирулентности для адекватных животных).

Использование этих штаммов позволяет получать статистически достоверную информацию об эффективности разрабатываемых МСЗ по отношению к данным возбудителям.

Таблица 1 – Некоторые характеристики культуры штамма C/2014 вируса Мачупо

Пассажная история Уровень накопления в клетках GMK–АН-1(Д), БОЕ⋅мл-1 Уровень накопления в клетках Vero B, БОЕ⋅мл-1 Морфология негативных колоний Средний размер негативных колоний, мм, ±σ Соответствие дифференциальной кривой размеров негативных колоний нормальному распределению* Количество физических частиц за 1 БОЕ Величина ЛД50 для низших приматов, выраженная в БОЕ Величина ЛД50 для морских свинок, выраженная в БОЕ Характеристика заболевания инфицированных морских свинок Средний срок жизни до гибели** 1 пассаж хомячки+1 пассаж белые мыши сосунки +1 пассаж культура клеток GMK–АН-1(Д) +6 пассажей морские свинки 1⋅107 БОЕ⋅мл-1 1⋅106 БОЕ⋅мл-1 Круглые, четкие, ярко выраженные 2,3±0,5 Соответствует 30 0,01-0,1 0,03-0,3 Лихорадка с 4 по 14 сутки после заражения. Максимальный подъем температуры у всех животных до 41,5°С Гибель 100% морских свинок с 6-х до 14 суток Примечания 1 * Коэффициенты асимметрии и эксцесса достоверно не отличаются от таковых для нормального распределения, диаметр ≈ 70% от общего числа негативных колоний в диапазоне от Х-σ до Х+σ; 2 ** Средняя продолжительность жизни морских свинок, инфицированных культурой 6 пассажа, зависит от вводимой дозы. При подкожном введении культуры штамма С/2014 в дозах 8-10 ЛД50 МСПК показатель составляет 13,9±0,5 суток, в дозе 1000 ЛД50 МСПК – 7,5±1,5 суток.

Пример выполнения

Адаптированный к морским свинкам штамм вируса Мачупо получен в ФГБУ «48 ЦНИИ» МО РФ в результате проведения шести последовательных пассажей исходного штамма Carvallo через печень данных животных. Некоторые характеристики исходного штамма представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Характеристики исходного штамма Carvallo вируса Мачупо

Известно, что адаптация вируса к определенному виду биологического объекта при определенном способе инфицирования способна привести либо к усилению патогенных свойств возбудителя для используемого вида, либо, при большом количестве пассажей, к утрате этих свойств и получению штаммов с пониженной вирулентностью. В этой связи необходимо рассмотреть соответствующие характеристики для культур штамма, прошедших 4 и 6 пассажей через печень морских свинок. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Некоторые характеристики вариантов штамма Carvallo вируса Мачупо, прошедших 4 и 6 пассажей через печень морских свинок

Показатель Характеристика показателя для культуры Примечание 4 пассажа 6 пассажа Пассажная история 1 пассаж хомячки+1 пассаж белые мыши сосунки+1пассаж культура клеток GMK –АН-1(Д)+4 пассажа морские свинки 1 пассаж хомячки+1 пассаж белые мыши сосунки+1пассаж культура клеток GMK –АН-1(Д)+6 пассажей морские свинки - Уровень накопления в клетках GMK–АН-1(Д) 1⋅107 БОЕ⋅мл-1 1⋅107 БОЕ⋅мл-1 - Уровень накопления в клетках Vero (В) 1⋅106 БОЕ⋅мл-1 1⋅106 БОЕ⋅мл-1 - Морфология негативных колоний Круглые, нечеткие Круглые, четкие, ярко выраженные - Средний размер негативных колоний, мм, ±σ 1,7±0,5 2,3±0,5 - Соответствие дифференциальной кривой размеров негативных колоний нормальному распределению Соответствует Соответствует Коэффициенты асимметрии и эксцесса достоверно не отличаются от таковых для нормального распределения, диаметр ≈ 70% от общего числа негативных колоний в диапазоне от -σ до +σ Количество физических частиц за 1 БОЕ 250 30 - Величина ЛД50 для низших приматов, выраженная в БОЕ НД 0,01-0,1 - Величина ЛД50 для морских свинок, выраженная в БОЕ - 0,03-0,3 Для культуры 4 пассажа гибель от 40 до 80% животных вне зависимости от инфицирующей дозы (величина коэффициента корреляции между используемой инфицирующей дозой и долей погибших животных для культуры 4 пассажа 0,75; для культуры 6 пассажа>0,95 Характеристика заболевания инфицированных морских свинок У заболевших животных лихорадка с 6 по 11 сутки после заражения Лихорадка с 4 по 14 сутки после заражения. Максимальный подъем температуры у всех животных на уровне 41,5°С - Средний срок жизни до гибели Спорадическая гибель животных на 12–27 сутки после заражения. Гибель 100% животных с 6-х до 14 суток Средняя продолжительность жизни морских свинок, инфицированных культурой 6 пассажа, зависит от вводимой дозы. При подкожном введении вируса Мачупо в дозах 8-10 ЛД50 МСПК, показатель составляет 13,9±0,5 суток, в дозе 1000 ЛД50 МСПК – 7,5±1,5 суток

Как следует из данных, представленных в таблице 3, в результате проведенных исследований был получен адаптированный к морским свинкам вариант штамма Carvallo вируса Мачупо, вызывающий 100% гибель животных при подкожном введении 8 ЛД₅₀ вируса.

У морских свинок, инфицированных адаптированным вариантом штамма Carvallo вируса Мачупо, регистрировали лихорадку с 4 по 14 сутки после заражения. Максимальный подъем температуры у всех животных фиксировали на уровне 41,5°С. У животных регистрировали проявления геморрагического синдрома. Гибель 100% животных отмечали с 6-х до 14 суток. При введении адаптированного к морским свинкам возбудителя срок их гибели зависел от вводимой дозы. Средняя продолжительность жизни морских свинок после подкожного введения вируса Мачупо в дозах 8-10 ЛД₅₀ МСПК, составила, в среднем, 13,9±0,5 суток, в дозе 1000 ЛД₅₀ МСПК – 7,5±1,5 суток [11]. Другие характеристики полученного варианта достоверно не отличались от таковых для штамма Carvallo.

Для получения культуры адаптированного варианта штамма, предназначенной для сохранения генотипа возбудителя, проводили высушивание сублимационным методом 10% суспензии печени погибших морских свинок с исходной биологической активностью 3,0⋅10⁷ БОЕ⋅мл^-1 на 10% растворе сахарозы с добавлением 10% желтка свежего куриного яйца.

Высушивание и паспортизацию данной культуры адаптированного варианта вируса Мачупо проводили по общепринятым методикам [12].

Биологическая активность высушенной культуры адаптированного штамма при титровании на монослойной культуре клеток GMK-AH-1(Д) по БОЕ составила 1,0⋅10⁶ БОЕ⋅мл^-1. Бактериальная и грибковая микрофлоры в сухом материале, оцененные с использованием тиогликолевой среды, отсутствовали.

Для исследований стабильности свойств адаптированного варианта необходимо было оценить биологические свойства данной культуры после ее освежения.

Морским свинкам массой 180-250 г внутрибрюшинно вводили по 1 мл 1:10 (10 животных) и 1:100 (10 животных) разведения хранящейся при температуре не выше минус 18°С культуры адаптированного варианта штамма Carvallo. Уход за инфицированными животными и работу с ними осуществляли с соблюдением «Правил работ с использованием экспериментальных животных» [13].

Hаблюдение за инфицированными животными вели ежедневно, отмечая клинические проявления заболевания. На 7 и 10 сутки после инфицирования четырех морских свинок (по две особи на каждый срок) умерщвляли, вводя внутримышечно препарат «Zoletil», брали пробы крови и печени и оценивали в динамике накопление вируса Мачупо в печени и крови животных. При вскрытии у морских свинок на 10 сутки после заражения отмечали увеличенную в размерах оливкового цвета печень, остальные органы были без изменений. Кроме того, у этих животных отсутствовала подкожно-жировая клетчатка.

Первые клинические признаки заболевания БГЛ у морских свинок, заключающиеся в частичном отказе от корма, проявлялись на 11 сутки после инфицирования, затем у животных отмечали: снижение реакции на внешние раздражители, адинамию, светобоязнь, резкое снижение массы тела, потускнение и взъерошенность шерсти; за 1-2 дня до гибели - ярко выраженную гипотермию (32°С).

У погибших животных с соблюдением правил асептики и антисептики отбирали также пробы крови и печени и оценивали специфичность гибели и уровень накопления вируса в пробах.

Клинические признаки заболевания БГЛ, доля погибших морских свинок (100%) после внутрибрюшинного заражения освеженной культурой адаптированного варианта (7 пассаж) в те же сроки после заражения, что и у животных, инфицированных материалом 6 пассажа, подтверждают, что снижения вирулентности вируса не произошло.

Пример 1. Определение величины ЛД₅₀ МСПК, выраженной в БОЕ

При изучении эффективности защитных препаратов необходимо точное определение заражающих доз для инфицирования экспериментальных лабораторных животных, как правило, выраженных в ЛД₅₀ для данного вида животных при данном способе инфицирования.

Для определения величины ЛД₅₀ МСПК, выраженной в БОЕ, проводят титрование одной и той же культуры штамма С/2014 вируса Мачупо на культуре клеток GMK–АН-1(Д) по методу негативных колоний под агаровым покрытием и на морских свинках при подкожном инфицировании.

Расчет биологической активности вируса, выраженной в ЛД₅₀ МСПК⋅мл^-1, проводят по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина [14]. Концентрацию вируса Мачупо в исследуемой пробе, выраженную в БОЕ⋅мл^-1, рассчитывают по формуле

A=а·bⁿ / с (1)

где:

А - количество БОЕ в 1 мл пробы, БОЕ⋅мл^-1;

a - средневзвешенное количество бляшек во флаконе, шт.;

bⁿ – кратность наивысшего разведения;

с – объем инокулята, вводимого во флакон, мл.

Величину а рассчитывают по формуле

а=( ₁+ ₂+...+ _n) / bⁿ (1/ b ₁+1/ b ₂+…+1/ b _n), (2)

где:

₁ … _n – среднее количество негативных колоний в разведениях 1…n;

b ₁…b _n – кратность разведения исследуемого материала;

₁ – среднее количество негативных колоний в каждом разведении определяют по формуле

_{I =} Ʃ а _I / N (3)

где:

а _I –количество негативных колоний в каждом определяемом флаконе;

N – количество флаконов.

Величину ЛД₅₀ МСПК (морские свинки при подкожном инфицировании), выраженную в БОЕ, определяют по формуле

ЛД₅₀ МСПК=А (МСПК) / А (БОЕ) (4)

где:

А (МСПК) – биологическая активность, выраженная в ЛД₅₀ МСПК⋅мл^-1;

А (БОЕ) - биологическая активность, выраженная в БОЕ⋅мл^-1.

Полученные показатели позволяют рассчитывать величину заражающей дозы при инфицировании лабораторных животных.

Пример 2. Определение защитной эффективности иммуноглобулина против БГЛ при введении по схеме экстренной профилактики

Испытуемых морских свинок случайным образом распределяют на 4 группы. В день проведения опыта животным 1 и 2 групп подкожно вводят по 0,5 мл БФР, животным 3 и 4 групп подкожно вводят культуру штамма С/2014 в дозе от 10 до 30 ЛД₅₀ МСПК на животное. Через 1 час животным групп 2 и 4 внутримышечно вводят 0,5 мл иммуноглобулина против БГЛ из сыворотки крови иммунизированных вирусом Мачупо лошадей. Наблюдение за инфицированными животными проводят в течение 30 суток. Типичные результаты эксперимента, обычно наблюдаемые при использовании иммуноглобулина против БГЛ с обратной величиной титра вируснейтрализующих антител более 1024, представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Определение защитной эффективности иммуноглобулина против БГЛ при введении по схеме экстренной профилактики

Группа, № Инфицирующая доза штамма С/2014, ЛД50 МСПК Схема введения иммуноглобулина против БГЛ n/N Доля выживших животных, процент, ±σ 1 - - 20/20 100-5 2 - +1 ч 20/20 100-5 3 20 - 0/20 0+5 4 20 +1 ч 15/20 75±5 Примечания 1) n/N – выжило n животных из общего числа животных в группе (N); 2) Значение ±σ (доли выживших животных рассчитывали по таблице 1 в кн. Генес В.С.[15].

Как следует из данных, представленных в таблице 3, 75% животных, которым был введен иммуноглобулин против БГЛ, были защищены от гибели при инфицировании культурой штамма С/2014 вируса Мачупо в дозе 20 ЛД₅₀ МСПК.

Пример 3. Определение противовирусной активности неспецифических медицинских средств защиты при экспериментальной БГЛ

В зависимости от количества испытуемых препаратов и схем их введения из стада животных случайным образом формируют потребное количество групп. Возможная схема проведения опыта представлена в таблице 5.

Таблица 5 - Определение противовирусной активности неспецифических медицинских средств защиты при экспериментальной БГЛ

Группа, № Препарат Схема введения препарата Инфицирующая доза штамма С/2014, ЛД50 МСПК n/N Доля выживших животных, процент, ±σ 1 Верорибавирин Внутрибрюшинно: +1 час 100 мг; на 2-4 сутки по 38 мг дважды в сутки; на 5-7 сутки по 14 мг дважды в сутки 8 8/10 80±13 2 Перорально: +1 час 20 мг; на 2-10 сутки по 14 мг дважды в сутки 8 6/10 60±16 3 Виразол Перорально: +1 час 14 мг; на 2-10 сутки по 10 мг дважды в сутки 8 5/10 50±17 4 Верорибавирин Перорально: +1 час 20 мг; на 2-10 сутки по 14 мг дважды в сутки Не инфицированные 10/10 100-10 5 Виразол Перорально +1 час 14 мг; на 2-10 сутки по 10 мг дважды в сутки Не инфицированные 10/10 100-10 6 - Не вводили 8 0/10 0+10 Примечания 1) n/N – выжило n животных из общего числа (N) животных в группе; 2) Значение ±σ (доли выживших животных рассчитывают по таблице 1 в кн. Генес В.С.[15].

Источники информации

1. Ежемесячная информация о карантинных заболеваниях за рубежом / ProMED-mail.- 2013, №3/4.

2. Petera C.J., Kuehne R.W., Mercado R.R. et al. Hemorrhagic fever in Cochabamba, Bolivia, 1971 // Amer. J. Epidemiol. – 1974. – Vol.99, N 6. – P. 425-43.

3. Неэндемические и экзотические вирусные инфекции: этиология, диагностика, индикация и профилактика / Под ред. С. В.Борисевича, Е.Н.Храмова, А.Л.Ковтуна. - Москва, 2014 г., 235 с.

4. Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных / Под ред. академика РАН Д.К. Львова. – М., ООО «Изд-во «Медицинское информационное агентство», 2013. – 1200 с.; ил.

5. Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of viruses. Ninth Report of the International Соmmittee on Taxonomy of viruses / Edibors, King A.M.Q, Adams M.J., Carstens E.B. and Lefkowitz E.J // ELSEVIER. Academic Press. – 2012.

6. Aquilar P.V., Camaigo W., Vargas J. et al. Reemergence of Bolivian hemorrhagic fever, 2007-2008 // Everg. Infect. Dis. – 2009. – Vol.15, No 9. - P. 1526-1528.

7. Мельникова О.В., Титенко А.М., Андаев Е.И. Санитарная охрана территории от завоза и распространения особо опасных вирусных инфекций. Сообщение 6. Аргентинская и Боливийская геморрагические лихорадки. Пробл. особо опасных инф. 2010. - Вып.104, №2. – С.29-34.

8. Дворецкая В.И., Богатиков Г.В., Пшеничнов В.А., Евсеев А.А. Терапевтическая эффективность рибамидила и виразола при экспериментальной лихорадке Ласса у обезьян. // Вопр. вирусол., -1991, №1. – С.55-56.

9. Дворецкая В.И., Богатиков Г.В., Маркин В.А. и др. Химиотерапия экспериментальных геморрагических лихорадок Ласса и Эбола./Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний. Тезисы докл. Межведомств. науч. конф.26-28 марта 1991 г.// - Киров. 1991. - С.39-41.

10. Хмелев А.Л., Борисевич И.В., Пантюхов В.Б., Пирожков А.П., Сыромятникова С.И., Шатохина И.В., Мельников С.А., Шагаров Е.Е. Использование морских свинок для оценки эффективности гетерологичного иммунолобулина против Боливийской геморрагической лихорадки / Вопр. вирусол. – 2009, №4. – С.42-45.

11. Сыромятникова С.И., Хмелев А.Л., Пантюхов В.Б., Шатохина И.В., Пирожков А.П., Хамитов Р.А, Марков В.И., Борисевич И.В., Бондарев В.П. Химиотерапия Боливийской геморрагической лихорадки при экспериментальной инфекции у морских свинок / Вопр. вирусол. – 2009, №6. – С.37-41.

12. Здродовский П.Ф., Соколов М.И. Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней. – М.: Медицина, 1965.

13. Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных. / Под ред. академика Д.К. Львова. – М., ООО Изд-во «Мед. информ. агентство». – 2013. – 1200 с.; ил.

14. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. – Л.: Гос.изд. мед. лит., 1962. – 180 с.

15. Генес В.С. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. – М., 1967.