Способ лечения дефектов роговицы с помощью аутологичного тромбофибринового сгустка

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для лечения пациентов с глубокими дефектами роговицы различной этиологии. Данная проблема признана одной из важнейших социально-экономических и этических проблем современного мира. По данным ВОЗ (2006), роговичная слепота составляет 4-5% среди всех причин слепоты во всем мире. По данным регионов Российской Федерации, за 2010 год, роговичная слепота составляет 5,9% от всех слепых и слабовидящих России. В структуре роговичной слепоты РФ 9% приходится на язвы роговицы, 21% - это пациенты с рубцами и помутнениями роговицы, больные с ожоговой болезнью глаз составляют от 6 до 38,4% среди всех глазных повреждений, и более 40% пациентов, имеющих заболевания роговицы, становятся инвалидами по зрению.

Уровень техники

Традиционная консервативная терапия пациентов с повреждениями роговицы предполагает применение антибактериальных препаратов, препаратов нуклеинового ряда, декспантенола, солкосерила для ускорения репаративных процессов в роговице. Хирургическое лечение включает поверхностную кератэктомию, с последующим укрытием дефектаамниотической мембраной [Макаров П.В., Кугушева А.Э., Слепова О.С., Ченцова Е.В., Хазамова А.И. // Российский офтальмологический журнал - N2, 2015. С. 41-44]. Однако такое лечение не всегда сопровождается восстановлением ткани роговицы, в связи с чем продолжается поиск наиболее эффективного способа лечения язвенных дефектов роговицы. Кроме того, применение антибактериальных и противовирусных препаратов оказывает угнетающее действие на процессы репарации и регенерации, учитывая механизм их действия, заключающийся в нарушении процессов синтеза ДНК, что в конечном итоге нередко приводит к необходимости хирургического лечения, включая пересадку роговицы.

Альтернативным методом лечения является применение аутологичных препаратов крови, содержащих факторы роста для ускорения процессов репарации тканей глаза (цельная аутокровь, лейкотромбоцитарная масса, богатая тромбоцитами плазма). Наиболее перспективным является применение богатой (или обогащенной) тромбоцитами плазмы (БоТП или plateletrichplasma - PRP). На протяжении многих лет она успешно используется для купирования воспаления и ускорения регенерации различных тканей [Foster Т.Е., Puskas B.L., Mandelbaum B.R., Gerhardt М.В., Rodeo S.A. Platelet-rich plasma: from basic science to clinical applications. Am J Sports Med. 2009, vol. 37, №11, pp. 2259-2272].

При лечении повреждения роговицы главной задачей является купирование воспалительной реакции, усиление и ускорение репарации, чего можно добиться посредством применения биологически активных пептидов, содержащихся в гранулах тромбоцитов человека. Известно, что альфа-гранулы тромбоцитов содержат более 30 цитокинов и факторов роста, которые способствуют улучшению репаративных процессов в тканях. Факторы роста, высвобождаемые из активированных тромбоцитов, инициируют и модулируют заживление ран [Nurden А.Т., Nurden P., Sanchez M., Andia I.,etal. Platelet sand wound healing. // Front. Biosci., 2008, 13, 3532-3548].

Известен способ лечения герпетических эрозий роговицы с помощью БоТП (патент RU 2653260,05.07.18). Способ лечения проводят в два этапа. Первый этап включает 3 недели, на протяжении которых проводят противовирусную, антибактериальную, репаративную терапию. На втором этапе лечения после курса противовирусной терапии, инсталлируют богатую тромбоцитами плазму 6 раз в день в сочетании с субконъюнктивальной инъекцией богатой тромбоцитами плазмы 1 раз в неделю. Длительность лечения составляет от 3 до 5 недель. При такой форме применения БоТП отсутствие клинического эффекта в ряде случаев может быть связано с недостаточной концентрацией цитокинов в месте повреждения роговицы за счет смывания или разбавления БоТП слезной жидкостью.

Известен способ лечения эрозивных и других повреждений роговицы с помощью аутологичного тромбофибринового сгустка, который фиксируют амниотической мембраной (Alio J.L., Arnalich-Montiel F, Rodriguez AE. The role of "eye platelet rich plasma" (E-PRP) for wound healing in ophthalmology. // Curr Pharm Biotechnol. 2012 Jun; 13(7): 1257-65]. Для получения сгустка у пациента производят забор 40-60 мл венозной крови непосредственно перед операцией, после одноступенчатого центрифугирования отбирали плазму, ближайшую к эритроцитам, избегая слоя лимфоцитов. Концентрация тромбоцитов в БоТП в 2-3 раза выше, чем в цельной крови. Один миллилитр полученной БоТП помещали в каждую лунку 4-луночного планшета с плоским дном и добавляли 50 мкл 10% хлорида кальция для активации, затем инкубировали при t37°C в течение 30 минут. Через 30 минут формировался сгусток БоТП, готовый к наложению на дефект поверхности роговицы с фиксацией его под амниотической мембраной.

При таком способе лечения, также отмечены единичные случаи низкой клинической эффективности, что, вероятно, связано с использованием при приготовлении сгустка БоТП с низкой концентрацией функционально полноценных тромбоцитов, а также преждевременной элиминацией из сгустка короткоживущих рост-стимулирующих цитокинов. Кроме того, при образовании сгустка используется активатор свертывания (хлорид кальция), что приводит к необходимости вскрытия пробирки, а также к увеличению риска контаминации посторонней микрофлорой. Недостатком способа является также отсутствие стандартизации плазмы по количеству функционирующих тромбоцитов и в связи с этим неоднозначность получаемого эффекта у различных больных.

Задачей изобретения является дальнейшее совершенствование способа лечения дефектов роговицы с использованием сгустка и сыворотки, полученных из БоТП.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является сокращение сроков заживления поврежденной поверхности роговицы, улучшение качества ее заживления, формирование помутнения меньшей интенсивности при глубоких повреждениях.

Технический результат достигается за счет использования тромбофибринового сгустка, сформированного из аутоплазмы, полученной из нестабилизированной крови и обработанной путем одноэтапного центрифугирования, выдержанной при комнатной температуре и характеризующийся содержанием функционально полноценных тромбоцитов в концентрации не менее 240*10⁹/л и фиксации его амниотической мембраной, а также за счет дополнительного субконъюнктивального введения по лимбу в 4-х квадрантах аутологичной сыворотки и проведения тарзорафии.

Важным аспектом является форма препарата, которая позволяет обеспечить целевую концентрацию цитокинов в течение длительного времени. С этой точки зрения использование БоТП в виде сгустка сопровождается медленным выходом из клеток рост-стимулирующих и противовоспалительных цитокинов. Таким образом, можно получить более длительное, постепенное терапевтическое воздействие непосредственно в зоне повреждения роговицы пациента.

Использование терапевтически значимого уровня биологически активных факторов в зоне повреждения в виде тромбофибринового сгустка (БоТП), характеризующегося содержанием функционально полноценных тромбоцитов (с гранулами) в определенной концентрации обеспечивает наиболее полноценный эффект в зоне повреждения роговицы.

Субконъюнктивальное введение по лимбу в 4-х квадрантах аутологичной сыворотки оказывает стимулирующее влияние на клетки лимбальной зоны, а вместе с тем усиление процессов регенерации роговицы. Сочетание эффекта от присутствующего на поверхности роговицы тромбофибринового сгустка и введенной аутологичной сыворотки обеспечивает усиление лечебного эффекта.

Тарзорафия действует как дополнительная биологическая повязка, препятствующая смещению сгустка и защищающая переднюю поверхность глаза от внешних воздействий, что также вносит свой вклад в получение адекватного клинического эффекта.

На первом этапе пациента из кубитальной вены забирают кровь в объеме 2 мл в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА для подсчета количества и морфофункционального статуса тромбоцитов. Определение относительной и абсолютной концентрации полноценных тромбоцитов проводят по патенту RU 2485502, 20.06.13. На основании полученных данных рассчитывают требуемое количество крови, необходимое для получения БоТП. Затем у пациента из вены забирают кровь в стерильную «сухую» пробирку без консерванта, охлаждают и транспортируют в течение 30-60 минут в лабораторию. Получение тромбофибринового сгустка и сыворотки проводят с соблюдением правил асептики и антисептики в стерильных условиях. Плазму получают путем одноэтапного центрифугирования из охлажденной нестабилизированной крови. Затем с сохранением стерильности из пробирки отбирают надосадочную плазму с тромбоцитами. Плазму с тромбоцитами помещают в стерильную емкость выдерживают при комнатной температуре (18-25°С) до формирования геля. Полученный гель готов к применению. Разделение на сгусток и сыворотку происходит самостоятельно вследствие констрикции сгустка в момент применения. Полученную сыворотку можно далее использовать.

Способ осуществляют следующим образом.

Сначала получают аутологичную плазму путем одноэтапного центрифугирования из нестабилизированной крови. Инкубируют ее при комнатной температуре до образования геля. После констрикции, сгусток, характеризующийся содержанием функционально полноценных тромбоцитов в концентрации не менее 240*10⁹/л. размещают на роговице и фиксируют с помощью амниотической мембраны. Субконъюнктивально в 4-х квадрантах по лимбу вводят оставшуюся сыворотку в общем объеме 0,5 мл и проводят тарзорафию. При недостаточной эпителизации процедуру повторяют 1 раз в неделю до полной эпителизации.

Клинический пример.

Пациент В., 1975 года рождения, поступил в стационар с диагнозом: постожоговая персистирующая эрозия роговицы с субтотальной конъюнктивизацией, лимбально-клеточная недостаточность правого глаза. Проводили стандартное обследование: визометрию, ориентировочное пальпаторное измерение ВГД, биомикроскопию с флюоресцеиновой пробой. Из анамнеза: со слов ожог произошел в быту (кипятком). Находился на стационарном лечении по месту жительства, где проводили длительную консервативную терапию. Спустя 3 месяца после травмы пациент обратился в Институт с жалобами на отсутствие предметного зрения, ощущение инородного тела, слизистое отделяемое из глаза.

При поступлении Vis OD pr.l.certae OS 1,0. При осмотре глазная щель сужена. Отмечается инъекция сосудов конъюнктивы. Конъюнктивизация роговицы с расширенными, извитыми сосудами. В центре роговицы эрозия диаметром 5,5×5,0 мм, с неоднородной поверхностью. Передняя камера средней глубины, зрачок в центре, детали за флером. Глубжележащие структуры не визуализируются.

Учитывая, что пациенту проводилась длительная (в течение 3 месяцев) репаративная терапия с использованием кератопротекторов без видимого эффекта, принято решение о применении тромбофибринового сгустка. Информированное согласие на использование аутологичного тромбофибринового сгустка получено. Пациенту также проводилась противовоспалительная, дезинтоксикационная и репаративная терапия.

Накануне операции у пациента произвели забор 20 мл крови из кубитальной вены перед операцией. С сохранением стерильности, кровь транспортировали в ГБУЗ НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗМ при +4°С для получения персонифицированного биотрансплантата. Пробирки с кровью центрифугировали. Затем с сохранением стерильности из пробирки отобрали надосадочную плазму с тромбоцитами. Плазму с тромбоцитами поместили в стерильную емкость с круглым дном, герметично закрыли и выдержали при комнатной температуре до формирования тромбофибринового геля. При отделении геля от стенок пробирки произошла констрикция и разделение его на сгусток и сыворотку.

Полученный сгусток уложили на поверхность роговицы, затем сверху покрыли амниотической мембраной. Мембрану фиксировали по границе лимба циркулярным швом, по лимбу в 4-х квадрантах произвели инъекции аутологичной сыворотки в общем объеме 0,5 мл. После этого была выполнена временная латеральная тарзорафия.

Через 2 дня отметили уплощение сгустка по форме роговицы под амниотической мембраной.

На 5 сутки провели расшивание век. Амниотическая мембрана и остатки тромбофибринового сгустка были удалены для оценки эпителизации. При осмотре выявлено равномерное окрашивание флюоресцеином. Площадь эрозии сократилась до 4,0×4,0 мм, обрела более четкие границы.

Учитывая положительную динамику, но не полное закрытие дефекта, процедуру повторили. Пациент был выписан под амбулаторное наблюдение с необходимостью осмотра через 2 недели. При повторном осмотре, после снятия швов с век и удаления остатков амниотической мембраны с роговицы, наблюдали уменьшение инъекции глазного яблока, роговица была полностью эпителизирована, не окрашивалась флюоресцеином. Vis OD счет пальцев у лица эксцентрично.

Таким образом, предложенный способ обеспечивает сокращение сроков заживления поврежденной поверхности роговицы, улучшение качества ее заживления, формирование помутнения меньшей интенсивности при глубоких повреждениях.