Результат интеллектуальной деятельности: Многокомпонентный двухслойный биоактивный материал с контролируемым антибактериальным эффектом

Изобретение относится к области медицинской техники, а именно к антибактериальным биосовместимым наноструктурным тонкопленочным материалам, применяемым в качестве покрытий при изготовлении медицинских имплантатов, которые используются при замене поврежденных участков костной ткани человека: имплантаты для челюстно-лицевой хирургии и хирургии позвоночника, искусственные сочленения, фиксаторы, ортопедические и дентальные имплантаты и др. Материалы для имплантатов должны соответствовать ряду требований: высокие механические свойства, износостойкость, коррозионная стойкость, биосовместимость, био- и антибактериальная активность.

Известен способ получения биоактивного покрытия с антибактериальным эффектом путем электроискровой обработки поверхности имплантата из токопроводящего материала (RU 2580627, опублик. 10.04.2016). Материал покрытия состоит из биоактивной добавки (гидроксилапатит, и/или трикальцийфосфат, и/или оксид кальция, и/или диоксид титана) - 5-40 вес. %, антибактериальной металлической добавки (Ag и/или Сu) - 0,5-5 вес. % и биосовместимого металла (Ti, и/или Zr, и/или Hf, и/или Та). Электроискровая обработка подложки проводится в жидкости или газе.

Недостатком данного способа является необходимость использования только проводящих материалов подложки, что ограничивает область применения покрытия. Также при электроискровой обработке антибактериальные добавки могут вступать во взаимодействие с материалом подложки или биоактивной добавкой и образовывать интерметаллидные фазы (например TiAg и AgCa₃), что усложнит выход антибактериальных компонентов. При этом сами антибактериальные добавки Ag и Сu могут быть цитотоксичными и снижать биоактивность материала [P.V. Asha Rani, G. Low Kah Mun, M.P. Hande, S. Valiyaveettil ACS Nano, 3, p.279-290 (2009)].

Известен способ получения многослойного покрытия, состоящего из последовательно чередующихся 20-30 слоев и нанесенного на эти слои углеродного нанопокрытия толщиной 1 мкм. Один из чередующихся слоев многослойного покрытия содержит титан и углерод с постепенным увеличением содержания углерода в каждом последующем слое от 14 до 25 вес. %, а внешний слой состоит из твердого аморфного алмазоподобного углерода (RU 2571559, опублик. 20.12.2015). Многослойное покрытие получают путем многостадийного дугового и импульсно-дугового распыления соответствующих катодов. Содержание углерода изменяют путем увеличения напряжение смещения от 800 до 1500 В, а слой алмазоподобного углерода наносят импульсно-дуговым распылением графитового катода в условиях конденсации алмазоподобной пленки.

Основным недостатком данного способа получения покрытий является многостадийность и сложность изготовления покрытия. Наличие в нижнем слое покрытия соединений титана с углеродом делает возможным осаждение покрытий только на титановые подложки, что ограничивает область их применения.

Известно изобретение, относящееся к нерастворимым биоматериалам, на поверхности которых находятся наночастицы висмута со средним размером 500 нм или менее (RU 2669808, опублик. 16.10.2018). Наночастицы наносят на поверхность биостабильной основы после предварительной диспергации в растворителе. Данное изобретение обеспечивает эффективное подавление роста бактерий, долговременный антибактериальный эффект и отсутствие образования биопленки.

Главным недостатком этого изобретения является то, что висмут относится к тяжелым металлам, он может всасываться в кровь пациента, накапливаться в организме и приводить к серьезным осложнениям [A. Atwal, G. С.S. Cousin Brit J Oral Max Surg, 54, p.111-112, (2016)].

Известно изобретение (RU 2465015, опубл. 27.10.12), которое представляет из себя покрытие для стержневых и спицевых чрескостных имплантатов из нержавеющих хромоникелевых сталей, состоящее из смеси оксидов металлов (Cr, Ni, Fe, Ti) с добавлением меди в качестве антибактериального компонента при процентном соотношении оксидов металлов и меди соответственно 95-98% и 2-5%. Антибактериальное оксидное покрытие получают в несколько этапов: поверхность материала предварительно обрабатывают абразивом, затем проводят термическое оксидирование до толщины оксидного слоя 40-50 мкм и открытой пористости 30%. Антибактериальный компонент вводят на заключительном этапе методом электрохимического внедрения из коллоидной смеси с частицами металла.

Недостатком этого изобретения является токсичность антибактериального компонента входящего в состав материала (Сu) в отношении клеток костной ткани, а также низкий уровень антибактериальной активности металла. Подложкой для данного покрытия являются нержавеющие стали, а метод плазменного электролитического окисления применим только к проводящим подложкам. Эти факторы ограничивают область применения изобретения.

Наиболее близким к заявляемому изобретению являются многокомпонентные биоактивные нанокомпозиционные покрытия с антибактериальным эффектом (RU 2524654, опубл. 27.07.14) на основе карбонитрида титана с введением дополнительных элементов. Данные покрытия имеют высокие механические, трибологические и антикоррозионные свойства, а также обладают био- и антибактериальной активностью. В качестве биоактивных компонентов вводят Si, Са, Р, О, K и Мn, а в роли антибактериального компонента выступает Ag в концентрации от 0.3 до 0.8 ат. %. Отношение суммарных концентраций основных элементов (Ti, С, N) к дополнительным (Ag, Са, Zr, Si, О, Р, K, Мn) варьируется от 1.2 до 20.

Недостатком данного изобретения является использование серебра в качестве антибактериального компонента, так как этот металл позволяет сохранять биосовместимость и биоактивность материала только в определенном диапазоне концентраций. Известно, что при превышении концентрации серебра ваше некоторого порогового значения материал может становиться токсичным [P.V. AshaRani, G. Low Kah Mun, M.P. Hande, S. Valiyaveettil ACS Nano, 3, p.279-290 (2009)]. Длительность антибактериального эффекта, обеспечиваемого серебром, сложно контролировать.

Прототипом заявленного изобретения являются многокомпонентные наноструктурные покрытия для медицины (RU 2281122, опубл. 10.08.06) на основе карбонитрида титана легированные дополнительными элементами, улучшающими механические и трибологические свойства покрытия, а также обеспечивающими биоактивность и биосовместимость. Отношение суммарных концентраций основных (Ti, С, N) элементов в покрытии к суммарным концентрациям дополнительных (Са, Zr, Si, К, Мn, О, Р) элементов варьируется от 1.2 до 20, а концентрации компонентов составляют, ат. %: Ti 30-50, С 15-40, N 0.5-30, О 5-25, Са 0-7, Zr 0-20, Si 0-30, Р 0-1.5, Мn 0-1.0, К 0-1.0.

Основным недостатком данного покрытия является отсутствие у него антибактериальных свойств и низкая биоактивность материала.

Предлагаемое изобретение предназначено для решения технической задачи, которая заключается в создании биоактивного, антибактериального покрытия не токсичного к клеткам костной ткани, обладающего комплексом высоких механических, трибологических и коррозионных свойств и применяемого для модифицирования поверхности металлических, полимерных и костных имплантатов.

Технический результат, который достигается в предлагаемом изобретении, заключается в обеспечении в двухслойном материале высокого уровня био- и антибактериальной активности в заданном временном диапазоне при отсутствии токсичности и при сохранении высоких механических свойств, износо- и коррозионной стойкости.

Указанный технический результат достигается за счет введения в материал на основе титана дополнительных компонентов в определенных соотношениях, в том числе, биоактивной добавки (В) в концентрации от 8 до 15 ат. %, а также формирования дополнительного антибактериального растворимого тонкопленочного слоя необходимой толщины, содержащего бор и кислород. Основу материала составляет многокомпонентное нанокомпозиционное покрытие толщиной до 1 мкм, предназначенное для металлических, полимерных и костных имплантатов, которое изготовлено на основе карбонитрида Ti(C,N) и диборида титана ТiВ₂ с введением дополнительных неметаллических элементов (Са, Р, С, О, N, В), улучшающих механические и трибологические свойства, а также обеспечивающих биоактивность и биосовместимость покрытия. Внешний слой покрытия толщиной от 50 нм до 500 нм изготавливается на основе аморфных соединений кислорода с бором (В₂О₃, ВО_х) в соотношении В/О от 0.5 до 1, которые обеспечивают антибактериальную активность в заданном промежутке времени и не являются токсичными в отношении клеток костной ткани.

Необходимое сочетание физических, механических, химических, трибологических и биологических свойств нижнего слоя покрытий достигается при следующих количественных соотношениях основных и дополнительных компонентов, ат.%:

Ti - 30-40

Са - 0.5-1.5

Р - 0.2-1

С - 15-30

O - 1-5

N - 20-35

В - 5-20

Антибактериальные свойства внешнего слоя покрытия обеспечиваются при следующем соотношении основных и дополнительных компонентов, ат. %.

В - 30-50

O - 45-60

N - 0.5-1.5

С - 2-20

Высокие механические свойства базового слоя покрытия в условии нагружения имплантата достигаются за счет создания нанокомпозиционной структуры на основе Ti(C,N) и ТiВ₂ с размером зерен 2-5 нм.

Формирование наноразмерной структуры внутреннего слоя покрытия также обеспечивается за счет введения в состав азота, который подавляет рост колонной структуры. Повышение концентрации азота в покрытии до 25 ат. % способствует образованию гранецентрированной кубической фазы Ti(C,N) в которой азот и углерод находятся в неметаллической подрешетке, а излишки углерода выделяются в виде аморфной составляющей.

За счет введения в состав нижнего слоя покрытия углерода в количестве от 15 до 30%, происходит образование алмазоподобных структур, обеспечивающих низкий коэффициент трения и высокую износостойкость.

Введение бора в состав нижнего слоя в количестве от 8 до 15 ат. % приводит к образованию фазы ТiВ₂, которая благоприятно сказывается на механических свойствах покрытия. Излишки бора приводят к формированию фазы BN, наличие которой также приводит к снижению коэффициента трения. Твердость нижнего слоя двухслойного покрытия составляет 20-24 ГПа, модуль упругости 215-230 ГПа, коэффициент трения не превышает 0.26.

В состав нижнего слоя были включены такие элементы как Са, Р и О, которые формируют аморфную фазу и способствуют улучшению биоактивности покрытия за счет образования гидроксил функциональных групп на поверхности. При помещении материала в биологическую среду растворяющиеся ионы кальция стимулируют рост на поверхности слоя апатита, который является основой костной ткани. Увеличение содержания Са, Р и О свыше заявляемого количества приводит к снижению механических и трибологических свойств покрытий, а также к разрушению актинового цитоскелета клеток и ухудшению адгезионных свойств поверхности. Более низкое содержание этих элементов относительно заявляемого диапазона приводит к замедлению формирование апатитового слоя на поверхности и снижению биоактивных свойств. Биоактивные свойства нижнего слоя также возрастают после введения бора в количестве 8-15 ат. %, который находится в фазе BN. Площадь распластывания клеток остеобластов увеличивается на 25%, количество клеток на 10-15%, а активность щелочной фотофазы на 10-20%. Эти данные свидетельствуют о том, что бор выступает в качестве биоактивного компонента.

Поверхность нижнего слоя многокомпонентных двухслойных биоактивных материалов имеет отрицательный заряд при рН от 4,5 до 9, поэтому ионы Са²⁺, которые находятся во внутренней среде организма и заряжены положительно, легко притягиваются к ней. Это приводит к сначала к формированию промежуточных, кальцийсодержащих фаз, а затем сплошного слоя гидроксиапатита.

Для получения нижнего слоя двухслойного многокомпонентного покрытия могут использоваться электроды и мишени, произведенные методом самораспространяющегося высокотемпературного синтеза (СВС). Технология СВС обладает рядом преимуществ: самоочистка продуктов горения от вредных растворимых и адсорбированных примесей в результате достижения высоких значений температуры (2500-3000°С) и скорости горения (2-10 см/с), развиваемых в волне горения СВС-систем; достижение высоких значений относительной плотности (97-99%) керамических материалов и тугоплавких соединений при сравнительно низких давлениях прессования; получение метастабильных состояний - пересыщенных твердых растворов; получение функциональных градиентных материалов [Левашов Е.А., Рогачев А.С., Курбаткина В.В., Максимов Ю.М., Юхвид В.И. Перспективные материалы и технологии самораспространяющегося высокотемпературного синтеза. Учебное пособие. ISBN 978-5-87623-463-6, 2011, Издательский дом МИСиС, 377 с].

Технологическим преимуществом нижнего слоя покрытия является наличие комплекса свойств, необходимых для Нижний слой покрытия имеет высокую твердость (20-24 ГПа), низкий модуль упругости (215-230 ГПа), низкий коэффициент трения (0.25-0.26), гидрофильные характеристики, биосовместимость, а также обладает повышенными биоактивными свойствами, о чем свидетельствует увеличенная на 10-20% активность щелочной фосфатазы. Слой обладает высокой твердостью и упругим восстановлением, что характеризует его как твердый и упругий материал способный выдерживать высокие переменные нагрузки. Низкий модуль Юнга покрытия способствует лучшей передачи нагрузки от имплантата к костной ткани, что препятствует остеопорозу.

После проведения операций по установке имплантов есть риск возникновения инфекций в окружающих имплантат тканях. Для лечения инфекций применяют антибиотики, однако, бактерии способны вырабатывать к ним резистивность. Поэтому способы придания антибактериальной активности материалу, основанные на использовании антибиотиков, не всегда эффективны. Применение известных металлов, обладающих бактерицидными характеристиками, может приводить к снижению биосовместимости материала. Известно, что хорошими антисептическими свойствами обладает ортоборная кислота (Н₃ ВО₃). Она легко образуется из растворимых оксидных соединений на основе бора (В₂O₃, ВО_х). Кроме того, бор как микроэлемент, положительно влияет на формирование костной ткани, что позволяет повысить биоактивные свойства материала.

Для обеспечения антибактериальных свойств материала используются соединения кислорода с бором: (В₂O₃, ВО_х) при соотношении основных компонентов В/О от 0.5 до 1, которые образуют аморфную фазу и являются верхним слоем двухслойного покрытия. Эти соединения активно взаимодействуют с водородом и водными растворами, что делает их легкорастворимыми и приводит к образованию борной кислоты (Н₃ ВО₃), обладающей выраженными антибактериальными свойствами.

Благодаря растворимости внешнего слоя, существует возможность контролировать продолжительность антибактериальной активности за счет изменения толщины антибактериального слоя и, следовательно, продолжительности его растворения с образованием борной кислоты.

Отличительной особенностью антибактериального действия соединений на основе бора является отсутствие токсичности в отношении окружающих имплантат тканей. Об этом свидетельствует увеличение количества клеток остеобластов МС3Т3-Е1 и площади их распластывания по отношению к контролю, а также состояние их актинового цитоскелета.

Технологическим преимуществом наличия внешнего слоя многокомпонентного двухслойного биоактивного материала является то, что он уже после 24 часов демонстрирует 100% антибактериальный эффект против бактерий и препятствует образованию бактериальных биопленок Максимальная длительность антибактериального действия указанного слоя ограничена только его толщиной, так как слой постепенно растворяется. Максимальная толщина антибактериального слоя определяется его способностью прочно удерживаться на поверхности подложки, в качестве которой может выступать либо, описанный выше биоактивный слой, либо материал металлических, полимерных и природных костных имплантатов. Минимальная эффективная толщина антибактериального слоя, способная обеспечивать бактерицидный эффект уже после 24 часов, составляет 50 нм.

Примеры конкретного осуществления изобретения.

Пример 1.

Нижний слой двухслойного покрытия может быть получен одновременным магнетронным распылением в одном технологическом цикле двух композиционных мишеней с фазовым составом TiC-CaO-Ti₃PO_x и TiB₂, произведенных методом СВС. Распыление мишени TiC-CaO-Ti₃PO_x осуществляли при токе 2 А, а мишени TiB₂ при токе 1.4 А. Нижний слой TiCaPCON-B двухслойного покрытия B₂O₃/TiCaPCON-11%В осаждали в газовой среде Ar+N₂ при парциальном давлении азота равном 15%. Получен слой следующего состава, ат. %:

Ti - 32

Са - 1

Р - 0.5

- 15

O - 4

N - 32.5

В - 15

В том же технологическом цикле после завершения процесса осаждения нижнего слоя покрытий производили нанесение внешнего соля. Внешний слой на основе соединений бора с кислородом многокомпонентного двухслойного покрытия получен путем ионного распыления мишени В₂O₃ при токе 70 мА и напряжении 2 кВ в среде Аr высокой частоты. Получен слой следующего состава, ат. %:

В - 33

O - 47

N - 2

С - 18

Для измерения физико-механических и трибологических свойств покрытия осаждали на подложки из титанового сплава марки ВТ 1-0. Для проведения структурных исследований, изучения био- и антибактериальной активности осаждение покрытий производили на подложки из кремния марки КЭФ-100.

Физико-механические и трибологические свойства нижнего слоя многокомпонентных двухслойного биоактивных покрытий определяли на следующих устройствах: Нанотвердомер (Nano-Hardness Tester, CSM Instruments, Швейцария); Скратч-тестер (Revetest, CSM Instruments, Швейцария); Машина трения (Tribometer, CSM Instruments, Швейцария); Оптический микроскоп AXIOVERT, оборудованный цифровой камерой и системой анализа изображения (Карл Цейс, Германия). Твердость и модуль упругости определялись по методу Оливера и Фара [G,M. Pharr, W.C. Oliver, F.R. Brotzen. J. Mater. Res. 3, 613 (1992)] с использованием индентора Берковича.

По кривым нагрузка - разгруженние рассчитывали величину упругого восстановления (We) используя формулу: We=(h_max-h_r)/h_max, где h_max -максимальная глубина проникновения индентора, a hr - остаточная глубина после снятия нагрузки. Коэффициент трения и скорость износа определяли по схеме "шарик - диск" при нагрузке 1 Н и линейной скорости 10 см/с. Испытания проводились в растворе, имитирующем внеклеточную жидкость по минеральному составу (SBF-раствор) и на воздухе. Контртелом являлся шарик диаметром 3 мм из спеченного Аl₂О₃.

Твердость полученного покрытия составила 20 ГПа, модуль упругости 213 ГПа, упругое восстановление 62%. Коэффициент трения, определенный в растворе, имитирующем внутреннюю среду организма, составлял 0.3. Величина краевого угла смачивания увеличивалась с 56° (измеренная через 1 ч выдержки образца на воздухе) до 73° (после 24 часов).

Для исследования биологических свойств покрытий in vitro были выбраны клетки остеобластов линии МС3Т3-Е1, которые культивировали на поверхности материала. Была исследована адгезия и распластывание клеток на поверхности подложки. Исследования показали, что площадь распластывания увеличивалась на 20% по сравнению с покрытием без бора. Иммуноморфологическое исследование актинового цитоскелета показало, что разрушения актинового цитоскелета клеток не происходит.

С помощью количественного колориметрического метода с использованием, в качестве раннего маркера дифференцировки, щелочной фосфатазы также проводилась оценка способности покрытий влиять на дифференцировку остеобластов МС3Т3-Е1 при их росте в дифференцирующей среде. Исследования показали, что остеобласты на поверхности покрытий TiCaPCON-B способны эффективно дифференцироваться и их количество возрастает на 15% по сравнению с образцом без бора. После двух недель культивирования МС3Т3-Е1 остеобластов количественный колориметрический анализ показал, что активность щелочной фотофазы на покрытии возросла на 25% по сравнению с контролем без бора.

В качестве тестовых культур микроорганизмов для изучения бактерицидной активности и бактериостатического эффекта внешнего соля многослойных покрытия были выбраны бактерии Escherichia coli K-261 (Е. coli K-261). Бактериостатическая активность оценивалась, как в отношении свободных бактерий, находящихся в биологической среде, так и в отношении образования бактериальной пленки на поверхности имплантата. Оценивалось изменение абсолютной концентрации бактерий во времени. Через сутки концентрация бактерий Е. coli K-261 в 1 мл раствора уменьшилась на 100%, то есть бактерии были полностью инактивированы. Биопленка на поверхности покрытия не образовывалась.

Пример 2

Был изменен режим осаждения нижнего слоя покрытия, а именно величина тока на магнетроне с мишенью TiB₂ была уменьшена с 1,4 до 1,2 А, а условия распыления мишени TiC-CaO-Ti₃PO_x остались прежними. Осаждение производили в газовой среде Ar+N₂ при парциальном давлении азота равном 15%. Был получен нижний слой покрытия следующего состава, ат. %:

Ti - 40

Са - 1

Р - 0.5

С - 19

O - 2

N-26.5

В - 11

Режим распыления мишени В₂O₃ был также изменен: ток составлял 50 мА, а напряжение 2.5 кВ; осаждение проводили в среде Аr высокой частоты. Состав полученного слоя был следующим, ат. %:

В - 40

O - 54

N - 1

С - 5

Нижний слой полученного покрытия имел твердость 24 ГПа, модуль упругости 231 ГПа, упругое восстановление 67%. Коэффициент трения, определенный в растворе, имитирующем внутреннюю среду организма, составлял 0.37. Краевой угол смачивания составлял 51° и 71° соответственно после выдержки образца на воздухе в течении 1 часа и 24 часов.

Разрушения актинового цитоскелета клеток МС3Т3-Е1 не происходило. Исследования in-vitro показали, что площадь распластывания клеток возрастала на 25%, а их количество увеличивалось на 10% по сравнению с образцом без бора. Эти данные свидетельствуют о том, что слой TiCaPCON-В является биосовместимым. Уровень активности щелочной фосфатазы данного слоя оказался не хуже, чем в контроле без бора, что свидетельствует о его биоактивных характеристиках. Внешний слой покрытия продемонстрировал высокую антибактериальную активность против Е. coli K-261; уже после 24 часов инкубирования количество бактерий уменьшилось на 90%

Пример 3

Ток магнетрона с мишенью TiB₂ был снижен до 1.0 А, остальные параметры осаждения остались прежними. Эксперименты проводили в газовой среде Ar+15%N₂. В результате был получен нижний слой двухслойного покрытия следующего состава, ат.%:

Ti - 35

Са - 1.5

Р - 1

С - 24

O - 5

N - 25

В - 8.5

Для получения внешнего слоя многослойного покрытия производили распыление мишени В₂O₃ при следующем режиме: ток - 90 мА и напряжение 2.5 кВ, газовая среда - Аr высокой частоты. Получен слой следующего состава, ат. %:

В - 47.5

O - 49

N - 0.5

C - 3

Нижний слой покрытия имел следующие механические свойства: твердость - 20 ГПа, модуль упругости - 218 ГПа, упругое восстановление -62%, коэффициент трения в растворе, имитирующем внутреннюю среду организма, составлял 0.18, а краевой угол смачивания 42° и 72° соответственно после выдержки образца на воздухе в течении 1 часа и 24 часов.

Покрытие продемонстрировало биоактивные свойства: площадь распластывания остеобластных клеток возрасла на 32%, в сравнении с контрольным образцом без бора. Слой покрытия также продемонстрировал способность поддерживать высокий уровень пролиферации клеток остеобластов в течение 7 дней. Активность щелочной фотофазы возрасла на 10%. Это свидетельствует о том, что бор выступает в качестве биоактивного компонента и способствует улучшению остеоиндуктивных свойств материала. Образец не оказал цитотоксического эффекта на клетки остеобластов; разрушение актинового цитоскелета клеток не наблюдалось. Антибактериальное действие внешнего слоя покрытия привело к снижению концентрации бактерий штамма Е. coli K-261 на 80% через 24 часа и полной их инактивации после 2 суток.