Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ СОСТОЯНИЯ ПЛОДА ПРИ ПРЕЖДЕВРЕМЕННОМ РАЗРЫВЕ ПЛОДНЫХ ОБОЛОЧЕК С 24 ДО 33 НЕДЕЛЬ БЕРЕМЕННОСТИ

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, а также к неонатологии, и может быть использовано для прогнозирования состояния плода при преждевременном разрыве плодных оболочек с 24 до 33 недель беременности.

Известно, что в настоящее время каждый десятый ребенок рождается преждевременно (Ю.П. Скрипниченко, И.И. Баранов, З.З. Токова. Журнал: Проблемы репродукции. 2014, стр 11.), из них почти треть умирает, а среди выживших высок процент инвалидизации (43,8%) (С.P. Howson, М.V. Kinney, and J.Е. Lawn, Eds., "March of dimes, PMNCH, save the children, WHO. Born too soon," The Global Action Report on Preterm Birth, WHO., Geneva, Switzerland, 2012). Преждевременный разрыв плодных оболочек при недоношенной беременности в 30% возникает вследствие инфекционного заражения женщины (Сидельникова В.М., Сухих Г.Т. Невынашивание беременности. М: МИА 2010; 536.), однако не все инфицированные женщины и носительницы условно-патогенной флоры рожают внутриутробно инфицированных детей, так как плацентарный барьер является хорошей естественной защитой на пути проникновения инфекции (Долгих Т.И., Тирская Ю.И., Белкова Т.Н. Расчет клинико-экономической эффективности модифицированного алгоритма обследования беременных на внутриутробные инфекции. Клиническая лабораторная диагностика. 2012; 9: 9.) Кроме того, воздействие инфекции значительно снижается с увеличением срока беременности. Но, несмотря на то, что при угрозе преждевременных родов в сроке беременности 32 и более недель, вероятность инфекционных осложнений у плода ниже, нежели в 22-23 недели, для плода и здоровья будущего ребенка чрезвычайно важна каждая неделя внутриутробной жизни и поэтому акушерам необходимы критерии, позволяющие исключать развитие внутриутробных инфекционных осложнений (хорионамнионита, септицемии, неонатального сепсиса и др.) и пролонгировать беременность или, напротив, родоразрешать не утяжеляя состояние плода и матери. Необходимо отметить, что четких критериев диагностики и прогноза ВУИ, тактики ведения беременности и времени родоразрешения при преждевременном разрыве плодных оболочек до 34 недель гестации в настоящее время не существует.

Известен способ прогнозирования акушерской патологии (Крымшокалова З.С., Авруцкая В.В., Шомахова З.С., Друккер Н.А., Погорелова Т.Н., пат. РФ №2339954, МПК G01N 33/68, опубликовано 27.11.2008). Сущность способа: в сыворотке крови женщины в первом триместре беременности определяют содержание фактора роста плаценты и сосудисто-эндотелиального фактора роста. Рассчитывают коэффициент их соотношения. При его величине, равной 2, прогнозируют синдром задержки роста плода (СЗРП). При величине, равной 3, прогнозируют гестоз, при его величине, равной 4, - преждевременные роды. Использование способа позволяет повысить точность прогнозирования развития тяжелых акушерских патологий различного генезе на ранних сроках гестации, что дает возможность своевременно скорректировать акушерскую тактику.

Недостатком данного способа является тот факт, что упомянутые маркеры позволяют оценить факторы, определяющие рост плаценты, но не учитывают такие факторы, как наличие преждевременного разрыва плодных оболочек, наличие инфекционных агентов, а также воспаления, способного оказать существенное влияние на состояние плода. Таким образом, данный способ не позволяет провести комплексную оценку состояния плода до родов, особенно у женщин с преждевременным разрывом плодных оболочек в 24-33 недели беременности.

Известен способ прогнозирования перинатальной патологии у беременных с хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями (Тареева Т.Г. и соавт. пат РФ №2256914, МПК G01N 33/49, G01N 33/53, опубликовано 20.07.2005), который осуществляют путем определения способности лейкоцитов крови беременной к продукции у-интерферона, определения антител к у-интерферону и аутоантител к белкам ОБМ и S-100.

При снижении продукции у-интерферона менее 16 МЕ/мл, аутоантител к ОБМ и S-100 менее (-) 40 усл. ед. для каждого показателя и повышения антител к у-интерферону более 20 усл. ед. прогнозируют перинатальную патологию. Предлагаемый способ не требует хирургического вмешательства для получения спинномозговой жидкости. Своевременное проведение адекватных лечебно-профилактических мероприятий беременным, у которых при использовании предлагаемого способа прогнозировалась перинатальная патология, позволило авторам сократить частоту тяжелых форм внутриутробной инфекции с 26,7% до 11,9%, частоту перинатальной патологии инфекционного характера с 25,2% до 13,3%. В целом данный способ позволяет прогнозировать патологию инфекционного генеза до родов, но не позволяет оценить общее состояние плода, к тому же уровни цитокинов и аутоантител отличаются значительной индивидуальной вариабельностью, способной оказать серьезное влияние на достоверность получаемых результатов.

Известен способ ранней диагностики внутриутробного инфицирования (Ангалева Е.Н. и соавт., пат. РФ №2110800, МПК G01N 33/53, G01N 33/48, опубликовано 10.05.1998). У женщин во II триместре беременности производят забор крови, в которой определяют наличие (СРБ) иммунологическим методом преципитации в капилляре и плацентарного альфа-1-микроглобулина (ПАМГ-1) методом "ПАМГ-фертитест", основанном на применении моноклональных антител. Для бактериологического и цитологического исследований берут мазки из цервикального канала шейки матки и заднего свода влагалища. В мазках отмечают проявления воспалительной реакции, вызванной различной специфической и неспецифической микрофлорой. И при уровне ПАМГ-1 ≥30 нг/мл, отсутствии СРБ и неинфицированных половых органов диагностируют плацентарную недостаточность неинфекционного генеза, а при уровне ПАМГ-1 ≥30 нг/мл, наличии СРБ и инфицированных половых органов диагностируют внутриутробное инфицирование (плацентарную недостаточность инфекционного генеза).

Авторами предложен метод диагностики плацентарной недостаточности инфекционного генеза, маркерами которой являются плацентарный альфа-1-микроглобулин (ПАМГ-1), C-реактивный белок и проявления воспалительной реакции, вызванной различной специфической и неспецифической микрофлорой, которые свидетельствуют о внутриутробном инфицировании с реакцией СРБ на бактериальную флору, а не ВУИ плода и новорожденного, которая реализуется в 12-14% всех случаев внутриутробного инфицирования и обусловлена возбудителями медленно протекающих, персистирующих инфекций со сложным жизненным циклом, в том числе внутриклеточной формой существования, что затрудняет выбор правильной тактики ведения беременности, срока и метода родоразрешения при ПРПО.

Известен способ прогноза исхода беременности у женщин из группы риска по внутриутробному инфицированию плода (Останин А.А. и соавт., пат. РФ №2238559, МПК G01N 33/48, опубликовано 20.10.2004). Сущность способа: во втором триместре беременности у женщин из группы риска по внутриутробному инфицированию оценивают комплекс клинико-лабораторных показателей матери/плода. Учитывают течение беременности, осложненное развитием гестоза средней или тяжелой степени (ДК=+6.3), не осложненное развитием гестоза (ДК=-7,5); наличие УЗИ-маркеров пренатальной патологии плода (ДК=+2,9); чистоту влагалищных мазков 3-6 степени (ДК=+1,8); количество сегментоядерных нейтрофилов в материнской крови ≥70% (ДК=+7,9), ≤65% (ДК=-2,9); лейкоцитоз в плодовой крови ≥4,5*10⁹/л (ДК=+6,8), ≤3,0*10⁹/л (ДК=-6,9); абсолютный лимфоцитоз в плодовой крови ≥3,0*10⁹/л (ДК=+4,1); абсолютное содержание СБЗ⁺ Т-клеток ≥1,9*10⁹/л (ДК=+5,4), ≤1,2*10⁹/л (ДК=-3,7) и уровень IgA в крови плода ≤0,3 г/л (ДК=+2,5), ≥0,4 г/л (ДК=-5,5); относительное количество HLA-DR⁺ моноцитов и HLA-DR⁺ лимфоцитов в крови плода соответственно ≥88 и 30% (ДК=-6,2) и (ДК=-4,0). При суммарной величине положительных диагностических коэффициентов (Σ ДК=+13 и выше) прогнозируют развитие неблагоприятного перинатального исхода, а при суммарной величине отрицательных диагностических коэффициентов (Σ ДК=-17 и ниже) - благоприятный исход беременности.

Способ позволяет оптимизировать тактику ведения беременных женщин, но инвазивен для плода и требует значительных затрат времени и средств на проведение длительных и дорогостоящих тестов. Кроме того, он не позволяет оценить состояние плода, позволяя дифференцировать только общий исход беременности.

Наиболее близким к заявленному способу по совокупности признаков является способ прогнозирования инфицирования новорожденных и родильниц (Набережнев Ю.И. и соавт., пат. РФ №2449277, МПК G01N 33/48, опубликовано 24.07.2012). У беременных женщин с преждевременным разрывом околоплодных оболочек на недоношенном сроке беременности (22-36 недель) под контролем ультразвукового исследования путем трансцервикальной вакуумной аспирации отбирают околоплодные воды, в которых бактериологическими и вирусологическими методами выявляют качественный и количественный состав наиболее часто встречаемых и этиологически значимых в инфицировании плодного яйца микроорганизмов, в число которых входят Streptococcus spp.; Peptostreptococcus spp.; Staphylococcus aureus; Gardenerella vaginalis; Peptococcus spp.; Capnocytophaga spp.; Stomatococcus spp.; Bactericides spp.; Enterococcus faecalis; Neisseria gonorrhea; Escherichia coli; Lactobacillus spp.; Clostridium spp., грамотрицательных неспорообразующих анаэробных бактерий и кокков, а также наиболее значимых вирусов: adenovirus; parvovirus; cytomegalovirus; Epstein-Barr virus; herpes simplex virus; influenza А. Обнаружение в околоплодных водах вышеуказанных бактерий и (или) вирусов свидетельствует об инфицировании микроорганизмов плода и матки именно этими типами.

Предложенные бактериологические и вирусологические методы качественного и количественного состава наиболее часто встречаемых и этиологически значимых в инфицировании микроорганизмов при ПРПО требует длительного времени на проведение исследования, кроме того, обнаружение бактерий и вирусов в околоплодных водах может свидетельствовать о нарушении плацентарного барьера для выявленных микроорганизмов, но не является критерием внутриутробного заболевания плода и новорожденного и не позволит правильно поставить диагноз ВУИ и определить необходимые лечебные мероприятия с момента рождения недоношенного ребенка.

Актуальным является разработка способа оценки состояния плода, обусловленного наличием внутриутробной инфекции, до родов у группы беременных женщин с преждевременным разрывом плодных оболочек (ПРПО) в 24-33 недели гестации с целью своевременного принятия лечебных мероприятий по отношению к новорожденному.

Назначением изобретения является разработка обладающего достаточной чувствительностью способа прогнозирования состояния плода при преждевременном разрыве плодных оболочек с 24 до 33 недель беременности, без клинических проявлений патогенной инвазии, путем исследования крови матери и околоплодных вод при их излитии на содержание альфа2-макроглобулина (а2-МГ), альфа1-антитрипсина (a1-AT) и лактоферрина (ЛФ).

Поставленное назначение достигается способом прогнозирования состояния плода при преждевременном разрыве плодных оболочек с 24 до 33 недель беременности, путем исследования крови матери и околоплодных вод при их излитии.

В сыворотке венозной крови матери и околоплодных водах на 24-33 неделе беременности при ПРПО определяют содержание лактоферрина (ЛФ) методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), уровни альфа2-макроглобулина (а2-МГ) и альфа1-антитрипсина (a1-AT) методом количественного иммуноэлектрофореза в пластинах агарозного геля с использованием исследовательских тест-систем. При концентрация в сыворотке крови беременных а2-МГ более 2,8 г/л, a1-AT более 3,4 г/л, в околоплодных водах а2-МГ более 48,4 мг/л, ЛФ более 4,5 мг/л прогнозируют внутриутробную инфекцию у плода, а при концентрации в сыворотке крови беременных а2-МГ менее 2,8 г/л, a1-AT менее 3,4 г/л, в околоплодных водах а2-МГ менее 48,4 мг/л, ЛФ менее 4,5 мг/л прогнозируют отсутствие внутриутробной инфекции у плода.

Новизна изобретения:

- На 24-33 неделе беременности при ПРПО определяют в сыворотке крови матери и околоплодных водах содержание лактоферрина (ЛФ) методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), уровни альфа2-макроглобулина (а2-МГ) и альфа1-антитрипсина (a1-AT) методом количественного иммуноэлектрофореза в пластинах агарозного геля с использованием исследовательских тест-систем.

- При концентрации в сыворотке крови беременных а2-МГ более 2,8 г/л, a1-AT более 3,4 г/л, в околоплодных водах а2-МГ более 48,4 мг/л, ЛФ более 4,5 мг/л прогнозируют внутриутробную инфекцию у плода.

- При концентрации в сыворотке крови беременных а2-МГ менее 2,8 г/л, a1-AT менее 3,4 г/л, в околоплодных водах а2-МГ менее 48,4 мг/л, ЛФ менее 4,5 мг/л прогнозируют отсутствие внутриутробной инфекции у плода.

Совокупность существенных признаков позволяет получить новый технический результат, заключающийся в более обоснованном прогнозировании состояния плода, способ обладает достаточной чувствительностью, специфичностью, позволяет своевременно оценить состояние плода и наличие внутриутробной инфекции, соответственно принять своевременные терапевтические меры и повысить шансы на выживание и выздоровление ребенка в неонатальном периоде. При этом предложенный способ не инвазивен для плода и не требует особых условий забора крови у матери. Уровень альфа2-макроглобулина, альфа1-антитрипсина и лактоферрина может быть определен в том же образце, что и другие показатели, определяемые при плановом лабораторном обследовании при выжидательной тактике ведения беременной женщины с преждевременным разрывом плодных оболочек.

Используемые в предлагаемом методе альфа2-МГ, альфа1-AT, ЛФ выбраны нами вследствие целого ряда присущих данным белкам свойств, позволяющих использовать их для комплексной оценки состояния плаценты и плода при наличии воспаления а также после анализа данных, опубликованных в открытой печати исследований, поскольку во время физиологически протекающей беременности происходит суппрессия адаптивного иммунитета, сопровождающаяся активацией врожденного иммунитета, значительную роль в защите плода от патогенов играют неспецифические белковые факторы защиты: пентраксины, компоненты комплемента, факторы свертывания крови, протеазы и их ингибиторы, транспортные белки. Среди них особое место занимают полифункциональные белки, обладающие иммуномодуляторными свойствами. В их числе - лактоферрин (ЛФ), обладающий мощным антибактериальным и противовирусным потенциалом, модулирующий синтез цитокинов, а также альфа-2-макроглобулин (а2-МГ) - основной транспортер цитокинов, модулирующий их синтез, активно участвующий в связывании, инактивации и презентации различных патогенов. При этом ЛФ синтезируется преимущественно локально и является чувствительным позитивным реактантом воспаления, а а2-МГ относится к поздним негативным реактантам, синтезируется в основном печенью и относится к маркерам патологической проницаемости физиологических барьеров.

При осуществлении теста используется иммуноферментный метод анализа, внедренный в большинстве лабораторных баз и не требующий дополнительного обучения персонала. Своевременная оценка состояния плода и наличия внутриутробной инфекции позволяет принять своевременные терапевтические меры и повысить шансы на выживание и выздоровление ребенка в неонатальном периоде.

Способ осуществляется следующим образом.

У женщин с преждевременным разрывом плодных оболочек (ПРПО) при сроке беременности 24-33 недели забирают текущие околоплодные воды и не менее 5 мл крови из локтевой вены, оставляют до образования кровяного сгустка. Образовавшийся сгусток выбрасывают, а в оставшейся сыворотке крови и околоплодных водах дополнительно определяют концентрацию лактоферрина, а2-МГ, a1-AT.

Содержание лактоферрина определялось методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), уровни альфа2-макроглобулина и альфа1-антитрипсина методом количественного иммуноэлектрофореза в пластинах агарозного геля с использованием исследовательских тест-систем, сконструированных в НИЛ иммунологии НГИУВ - филиал ФГБОУ ДПО РМАНПО. Концентрация альбумина - стандартным биохимическим методом (с бромкрезоловым зеленым).

Состояние родившихся детей, наличие внутриутробной инфекции устанавливали клинико-лабораторными методами исследования в раннем неонатальном периоде и подтверждалось результатами гистологического исследования плаценты. Полученные данные по состоянию новорожденных сопоставлялись с определенными ранее уровнями ЛФ, а2-МГ, a1-AT.

Для статистической обработки полученных данных применяли программу "InStat 2.0" (GraphPad, США) - метод парного межгруппового сравнения показателей при помощи параметрического теста по критерию Стьюдента, после проверки нормальности распределения признаков по критерию Колмогорова-Смирнова.

При выявлении концентрации в сыворотке крови беременных а2-МГ более 2,8 г/л, a1-AT более 3,4 г/л, в околоплодных водах а2-МГ более 48,4 мг/л, ЛФ более 4,5 мг/л прогнозируют внутриутробную инфекцию у плода с вероятностью 75-80%, а при концентрации в сыворотке крови беременных а2-МГ менее 2,8 г/л, a1-AT менее 3,4 г/л, в околоплодных водах а2-МГ менее 48,4 мг/л, ЛФ менее 4,5 мг/л прогнозируют отсутствие внутриутробной инфекции у плода с вероятностью 75-80%.

Таким образом, нам удалось разработать достаточно эффективный способ прогнозирования состояния плода при преждевременном разрыве плодных оболочек с 24 до 33 недель беременности, без клинических проявлений патогенной инвазии, путем исследования крови матери и околоплодных вод при их излитии, позволяющий с достаточно высокой точностью прогнозировать состояние плода и наличие у него внутриутробной инфекции, что позволяет оптимизировать лечебную тактику новорожденных и своевременно начать лечение внутриутробной инфекции.

Клинические примеры.

Пример 1. Пациентка Г., 23 лет, первобеременная, первородящая. Соматически здорова. На учете в женской консультации с 8 недель беременности. Беременность протекала без осложнений. Проведено 2 биохимических и УЗИ скрининга в 12 и 18 недель. Риск врожденных пороков развития низкий. При сроке беременности 31 неделя появились жалобы на жидкие выделения из половых путей в объеме 300 мл, по УЗИ диагностировано выраженное маловодие, тест на подтекание околоплодных вод положительный. Начата антибактериальная терапия, пренатальная стимуляция легких плода дексаметазоном.

Уровень в сыворотке крови беременной а2-МГ 1,9 г/л, a1-AT 2,1 г/л, в околоплодных водах а2-МГ 28,3 мг/л, ЛФ 2,7 мг/л. Прогнозировалось рождение ребенка без внутриутробной инфекции.

Роды в 32 недели 6 дней, длительность родового акта 6 ч 5 мин. Безводный период 13 дней 3 часа. Родился мальчик 1900 гр., 41 см, 6/7 баллов по шкале Апгар за счет недоношенности. Период новорожденности без внутриутробной инфекции. По результатам гистологии: незрелая плацента.

Пример 2. Пациентка К., 28 лет, первобеременная, первородящая. Соматический анамнез: Анемия 1 ст. На учете в женской консультации с 11 недель беременности. Беременность протекала на фоне ОРВИ в 8 недель без повышения температуры тела. Проведен 1 биохимический скрининг в 14 недель. Риск врожденных пороков развития низкий. Проведено 2 УЗИ скрининга в 14, 24 недели. При сроке беременности 27 недель появились жалобы на жидкие выделения из половых путей в объеме 200 мл, по УЗИ диагностировано маловодие, тест на подтекание околоплодных вод положительный. Начата антибактериальная терапия, пренатальная стимуляция легких плода дексаметазоном.

Уровень в сыворотке крови беременной а2-МГ 3,6 г/л, a1-AT 3,8 г/л, в околоплодных водах а2-МГ 52,1 мг/л, ЛФ 5,2 мг/л. Прогнозировалось рождение ребенка с признаками внутриутробной инфекции.

Роды в 28 недель 1 день, длительность родового акта 7 ч 15 мин. Безводный период 11 дней 9 часов. Родилась девочка 1200 гр., 38 см, 4/6 баллов по шкале Апгар за счет недоношенности. Период новорожденности с пневмонией слева. По результатам гистологии: восходящая инфекция Пет, серозный хориоамнионит, незрелость плаценты.