Результат интеллектуальной деятельности: ПОСЕВНОЙ МИЦЕЛИЙ БАЗИДИОМИЦЕТА И СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к способам приготовления посевного мицелия базидиомицетов, используемых для культивирования базидиомицетов, как в погруженных условиях, так и на поверхности субстратов с целью получения биологически активных веществ из мицелия или плодовых тел базидиомицета.

Известно, что базидиомицеты являются источником биологически активных веществ, в частности, белков, витаминов, незаменимых аминокислот, липидов, полисахаридов и др.

В связи с этим большое внимание уделяется разработке технологий искусственного выращивания (культивирования) базидиомицетов как в погруженных условиях, так и на поверхности различных субстратов.

Образование базидиомицетами ценных стабильных биологически активных веществ зависит от вида используемых базидиомицетов и технологии культивирования, в частности, способа приготовления посевного мицелия.

Известен способ приготовления посевного мицелия базидиомицетов путем их культивирования на стерильной питательной среде, содержащей 20% отвар картофеля, глюкозу или сахарозу в количестве 20 г/л и 15 г агара при 24°С в течение 14 дней (WO 2004/097007, 11.11.2004).

Недостатком описанного способа является длительность процесса приготовления посевного материала.

Известен способ получения посевного мицелия базидиомицетов, предусматривающий приготовление стерильной жидкой питательной среды, содержащей, г/л воды: пшеничную муку - 10-40, картофельный отвар - 50-200 и стимулятор роста, в качестве которого используют суточную культуру бактерий Azospirillum. Приготовленную питательную среду засевают базидиомицетом, культивируют при 26°C в течение 3-х дней, а затем в полученную мицелиальную биомассу вносят суспензию бактерий Azospirillum из расчета 10 мл суспензии на 200 мл среды, и затем осуществляют совместное культивирование базидиомицета и вышеуказанных бактерий в течение 14 дней (RU 2249614 C2, 21.03.2003).

Недостатком описанного способа является длительность процесса приготовления посевного мицелия (17 дней) и его трудоемкость, поскольку необходимо дополнительно готовить питательную среду для бактерий и осуществлять их культивирование и подсев бактерий в среду, используемую для приготовления посевного мицелия.

Известен способ получения зернового посевного мицелия при выращивании плодовых тел съедобного базидиального гриба Pleurotus ostreatus, заключающийся в инокуляции зернового субстрата маточным мицелием, выращенным методом погруженного культивирования на жидких питательных средах (UA 36655 A, 16/04/2001). В способе приведен состав двух жидких питательных сред для выращивания маточного мицелия. Среда 1 содержит (г/л): крахмал кукурузный - 40, кукурузный экстракт - 30, (NH₄)₂SO₄ - 1, KH₂PO₄ - 0,6, K₂HPO₄ - 0,6, MgSO₄×7 H₂O - 0,3, вода водопроводная - до 1 л. Среда 2 содержит (г/л): крахмал кукурузный - 40, кукурузный экстракт - 15, экстракт ячменно-солодовый - 15, (NH₄)₂SO₄ - 2, KH₂PO₄ - 0,6, K₂HPO₄ - 0,6, MgSO₄×7 H₂O - 0,3, вода водопроводная - до 1 л. Процесс приготовления зернового посевного мицелия Pleurotus ostreatus включает выращивание культуры гриба на жидком пивном сусле (4°Б) в стационарных условиях при 24-26°C в течение 7-8 суток, последующий пересев культуры гриба на одну из вышеприведенных питательных жидких сред и культивирование на качалке при 200 об/мин, температуре 24-26°C в течение 3-4 суток, засев полученной погруженной культурой стерильного зернового субстрата и выращивание мицелия при 24-26°C. Полное обрастание зернового субстрата мицелием наступает через 6-8 суток.

Недостатком описанного способа является длительность процесса приготовления посевного мицелия и узкие рамки его применения, т.к. способ предназначен для приготовления посевного мицелия только одного вида базидиомицета и только для процесса получения его плодовых тел.

Задачей заявленного способа является ускорение процесса приготовления посевного мицелия без снижения его жизнеспособности и биосинтетической активности за счет использования разработанных составов питательных сред. Разработанные составы питательных сред являются универсальными для нескольких видов базидиомицетов.

Поставленная задача решается за счет того, что согласно изобретению приготовление посевного мицелия базидиомицета ведут в два этапа, первый из которых осуществляют засевом маточной культуры базидиомицета на стерильную агаровую питательную среду, содержащую жидкую основу и 5-25 г агар-агара на 1 л основы, а второй - на стерильную жидкую питательную среду, содержащую источник углерода и азота в количествах, соответственно равных 10-35 и 7-75 г/л воды, и минеральные соли - дигидрофосфат калия и сульфат магния в количествах, соответственно равных 2,0-3,0 и 0,2-0,4 г/л воды, культивирование на первом этапе осуществляют при температуре 22-30°С до полного зарастания поверхности среды мицелием, а на втором - при температуре 24-30°С до максимального образования пеллет. В качестве жидкой основы сред, применяемых на 1 этапе культивирования, можно использовать водный отвар зерен пшеницы или водный отвар клубней картофеля. Приготовление отвара зерен пшеницы заключается в том, что навеску зерен, взятую из расчета 30-150 г на 1 л воды, следует кипятить в течение 30 минут, взвесь охладить, фильтровать через лавсан или бязь и использовать полученный отвар. Навеску очищенных и нарезанных кубиками 1×1×1 см целесообразно брать из расчета 150-300 г на 1 л воды. Приготовление отвара клубней картофеля можно проводить таким же образом, как приготовление отвара зерен пшеницы. В приготовленные отвары можно вносить кукурузный экстракт в количестве 5-60 г на 1 литр отвара. В отвар клубней картофеля следует добавлять глюкозу в количествах 15-25 г/л. Рекомендуется pH приготовленных сред перед стерилизацией довести до 5,8-6,2.

На втором этапе культивирования в качестве источника углерода в жидкой питательной среде можно использовать вещество, выбранное из группы: глюкоза, сахароза, меласса, растительное масло или их смесь, а в качестве источника азота - соевая мука, пшеничная мука, кукурузная мука, овсяная мука или ржаная мука или их комбинация.

Жидкую питательную среду перед стерилизацией следует выдерживать в течение 8-12 часов при комнатной температуре.

Для активации роста базидиомицета в агаровую и жидкую питательные среды целесообразно вводить арахидоновую кислоту в количествах 1,0-5,0·10^-5 г/л жидкой основы среды, используемой на 1 этапе культивирования, или воды (второй этап).

С целью улучшения качества посевного мицелия и сокращения длительности его приготовления в агаровую и жидкую питательные среды перед стерилизацией следует дополнительно вносить сухую измельченную биомассу базидиомицета в количестве 10-30 г/л жидкой основы среды, используемой на первом этапе культивирования, или воды, используемой при приготовлении сред второго этапа культивирования. Дополнительное внесение порошка биомассы базидиомицета можно осуществлять только в агаровую питательную среду или в жидкую питательную среду или в обе питательные среды. В качестве биомассы базидиомицета можно использовать его мицелий или плодовые тела. Биомасса может принадлежать тому же виду базидиомицета, который используют при приготовлении посевного мицелия, или другому виду.

После второго этапа культивирования базидиомицет можно пересевать на свежеприготовленную жидкую питательную среду того же состава и дополнительно культивировать до максимального образования пеллет.

Из базидиальных грибов следует использовать базидиомицет, выбранный из группы Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P.Karst, Hypsizygus ulmarius (Bulliard:Fr.) Redhead, Trametes versicolor (L.:Fr.) Pilat.

Приготовленный посевной мицелий базидиомицета целесообразно гомогенизировать.

Гомогенизацию готового посевного мицелия можно осуществлять в гомогенизаторе в течение 2-6 минут или в колбах с отбойниками на ротационной качалке в течение 2-10 минут при 200-250 об/мин.

В том случае, когда культивирование базидиомицета на производственной среде осуществляют в биореакторе, гомогенизацию готового посевного материала целесообразно проводить непосредственно в нем в процессе засева производственной среды при включенной мешалке на 350-550 об/мин в течение 0,05-5 мин.

Приготовленный заявляемым способом посевной мицелий базидиомицета сохраняет свою активность при выдерживании при 2-4°C в течение 10-14 суток.

Посевной мицелий базидиомицета, приготовленный по заявленному способу, является вторым самостоятельным объектом группы изобретений.

Технический результат, достигаемый в результате использования предложенных изобретений, заключается в сокращении длительности приготовления посевного мицелия базидиомицетов за счет подбора компонентов питательных сред и условий культивирования базидиомицетов. Использование предложенных изобретений позволяет расширить число видов базидиомицетов, посевной мицелий которых может быть выращен на разработанных составах сред.

Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, которые не охватывают весь объем притязаний заявителя, но и не ограничивают его.

Пример 1. Готовили отвар зерен пшеницы кипячением их в воде с последующим отделением жидкой фазы и введением в нее кукурузного экстракта и агара. Состав сред представлен в таблице 1. Затем готовые среды засевали мицелием базидиомицетов, указанных в таблице 1. Базидиомицет Ganoderma lucidum штамм Gl-3 культивировали при температуре 29°C, а базидиомицеты Hypsizygus ulmarius штамм Hu-2, Trametes versicolor штамм Tv-12 - при температуре 24°C.

Базидиомицеты выращивали на скошенных питательных агаровых средах №№1-1, 1-3, 1-4, 1-5, 1-7 в пробирках или на столбиках питательных агаровых сред №№1-2 и 1-6 в пробирках. Полное зарастание сред №№1-1, 1-3, 1-6 происходило за 6,5-8 суток, а сред №№1-2, 1-4, 1-5 и 1-7 - за 4-6 суток.

В таблице 1 представлен состав стерильных питательных агаровых сред на основе отвара зерен пшеницы, используемых на первой стадии приготовления посевного мицелия базидиомицетов.

Готовили жидкие питательные среды, состав которых представлен в таблице 2, среды №№2-1, 2-2, 2-5, 2-6 выдерживали при комнатной температуре в течение 8 часов, среды №№2-3 и 2-4 - в течение 12 часов, стерилизовали при 1,5 атм в течение 30 минут, охлаждали и засевали вышеприготовленным посевным мицелием.

В таблице 2 представлен состав стерильных жидких питательных сред, используемых на второй стадии процесса приготовления посевного мицелия.

Культивирование мицелия осуществляли при температуре 26°C в колбах на ротационной качалке при 200 об/мин до максимального образования пеллет, диаметр которых составил 2-6 мм.

Образование пеллет Ganoderma lucidum на среде №2-1 прошло за 3,5 суток, на среде №2-2 - за 3 суток, образование пеллет Hypsizygus ulmarius на среде №2-3 - за 2 суток, на среде №2-4 - за 3 суток, образование пеллет Trametes versicolor на среде №2-5 - за 3 суток, на среде №2-6 - за 3,5 суток. По визуальной оценке на средах с арахидоновой кислотой была выше однородность культур базидиомицетов по размеру пеллет и наполненность сред пеллетами.

Пример 2. Приготовление посевного мицелия Ganoderma lucidum.

Готовили стерильную агаровую среду из примера 1 №1-1 и стерильную агаровую среду, отличающуюся от среды №1 тем, что в нее дополнительно была введена арахидоновая кислота в количестве 1,0×10^-5 г/л отвара зерен пшеницы. Мицелий Ganoderma lucidum выращивали на скошенных средах в пробирках при 29°C. Полное зарастание поверхности среды №1-1 мицелием прошло за 7 суток, среды с дополнительно внесенной арахидоновой кислотой - за 5,5 суток. При этом более интенсивное развитие воздушного мицелия было отмечено на среде с арахидоновой кислотой.

Выращенным на среде с арахидоновой кислотой мицелием Ganoderma lucidum засевали приготовленную стерильную жидкую питательную среду №2-2 из примера 1. Культивирование на жидкой питательной среде проводили на ротационной качалке при 200 об/мин и температуре 29°C. Образование пеллет прошло за 2 суток.

Пример 3. Приготовление посевного мицелия Trametes versicolor. Готовили стерильную агаровую среду, содержащую (г/л жидкой основы среды):

Кукурузный экстракт - 5 г,

Глюкоза - 20,

Агар-агар - 25,

Жидкая основа среды - до 1 литра.

В качестве жидкой основы среды использовали отвар клубней картофеля, приготовленный из расчета 150 г клубней на 1 л воды.

Кроме того, готовили стерильную агаровую среду, отличающуюся от вышеприведенной тем, что в нее был дополнительно перед стерилизацией внесен порошок сухого измельченного мицелия Trametes versicolor в количестве 10 г/л жидкой основы среды. Культивирование проводили при 26°C. Зарастание мицелием Trametes versicolor поверхности среды, не содержащей порошок биомассы базидиомицета, прошло за 7 суток, среды с дополнительно внесенным порошком мицелия Trametes versicolor - за 6 суток. По визуальной оценке воздушный мицелий базидиомицета был интенсивнее развит на среде, содержащей порошок мицелия. Мицелием Trametes versicolor, выращенным на агаровой среде с порошком мицелия базидиомицета, были засеяны колбы со стерильной питательной жидкой средой, содержащей (г/л воды):

Глюкоза - 22,

Соевая мука - 10,

Дигидрофосфат калия - 2,5,

Сульфат магния - 0,25,

Вода - до 1 литра.

Культивирование проводили на ротационной качалке при 180 об/мин при 26°C в течение 3 суток. Полученный посевной мицелий использовали при получении водорастворимых полисахаридов мицелия. Для этого приготовленным посевным мицелием засевали колбы со стерильной производственной средой, содержащей (г/л воды):

Глюкоза - 20,

Пептон - 10,

Дигидрофосфат калия - 2,0,

Сульфат магния - 0,2,

Вода - до 1 литра.

Посевной мицелий вносили в количестве 5%. Культивирование проводили на ротационной качалке при 180 об/мин при 26°C в течение 4 суток. По окончании процесса выращивания мицелий отделяли фильтрованием, высушивали при 60°C, измельчали. Содержание водорастворимых полисахаридов в воздушно-сухом мицелии Trametes versicolor, определенное с использованием фенолсернокислотного метода, составило 24%.

Пример 4. Получение средства с антибиотической активностью.

Мицелием Ganoderma lucidum, выращенным по примеру 1 на агаровой среде №1-2, засевали жидкую питательную среду №2-1 из примера 1, в которую перед стерилизацией вносили сухой порошок плодовых тел Pleurotus ostreatus в количестве 30 г/л воды. Выращивание проводили в колбах на ротационной качалке при 200 об/мин в течение 2 суток. Полученным посевным мицелием инокулировали стерильную производственную среду, содержащую (в г/л воды):

Сахароза - 20,

Пептон - 10,

Дигидрофосфат калия - 2,5,

Сульфат магния - 0,3,

Вода - до 1 литра.

Посевной мицелий вносили в количестве 2%. Культивирование осуществляли в биореакторе при 200 оборотах мешалки в минуту, температуре 26°C в течение 3 суток. По окончании процесса выращивания культуральную жидкость отделяли от мицелия фильтрованием и экстрагировали этилацетатом при соотношении объемов 1:2. Полученный экстракт отделяли от водной фазы и высушивали на вакуумном испарителе до сухого остатка. Сухой остаток растворяли в этаноле таким образом, чтобы сконцентрировать экстракт в 50 раз. Полученным концентратом пропитывали бумажные диски, высушивали их и помещали на газон тест-объекта в чашки Петри. В качестве тест-объектов использовали грамположительные и грамотрицательные бактерии, дрожжи и мицелиальные грибы. Полученное средство обладало антибиотической активностью в отношении Bacillus subtilis, Stahpylicoccus aureus, Micrococcus luteus, Comamonas terrigena, Pseudomonas aeuruginosa, Candida albicans, Aspergillus niger, Fusarium bulbigenum.

Пример 5. Получение мицелия Hypsizygus ulmarius с высоким содержанием липидов.

Готовили посевной мицелий Hypsizygus ulmarius, используя на первой стадии стерильную среду, содержащую (г/л жидкой основы среды):

Кукурузный экстракт - 60,

Глюкоза - 15,

Порошок мицелия Hypsizygus ulmarius - 15,

Агар-агар - 5,

Жидкая основа среды - до 1 литра.

В качестве жидкой основы среды использовали отвар клубней картофеля, приготовленный из расчета 300 г клубней на 1 л воды.

Второй этап получения посевного мицелия Hypsizygus ulmarius проводили на жидкой питательной среде, содержащей (г/л воды):

Глюкоза - 10,

Соевая мука - 10,

Кукурузная мука - 60,

Порошок плодовых тел Pleurotus ostreatus - 10,

Дигидрофосфат калия - 2,5,

Сульфат магния - 0,3,

Вода - до 1 литра.

Выращивание проводили в колбах на ротационной качалке при 180 об/мин, температуре 24°С в течение 2 суток. Приготовленный посевной мицелий Hypsizygus ulmarius в количестве 5% вносили в производственную среду, содержащую (г/л воды):

Глюкоза - 20,

Пептон - 15,

Дигидрофосфат калия - 2,5,

Сульфат магния - 0,3,

Вода - до 1 литра.

Культивирование осуществляли в колбах на ротационной качалке при 180 об/мин, температуре 24°С в течение 3 суток. По окончании процесса выращивания мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрованием, сушили при 50°C и измельчали. Определение общего содержания липидов в мицелии Hypsizygus ulmarius проводили согласно ГОСТ 28178-89, оно составило 48%.

Пример 6. Приготовленный по примеру 1 с использованием питательных сред №№1-1 и 2-2 посевной мицелий Ganoderma lucidum вновь пересевали на свежеприготовленную питательную среду №2-2 в биореактор. В процессе засева свежеприготовленной среды осуществляли гомогенизацию посевного мицелия путем включения мешалки на 350 об/мин в течение 5 минут. Культивирование базидиомицета осуществляли при температуре 26°C с подачей воздуха 1,5 объема / объем среды в минуту. Образование пеллет в биореакторе прошло за 2 суток. Полученный посевной мицелий был использован как для процесса получения биологически активных веществ в погруженных условиях, так и для выращивания плодовых тел на твердофазном субстрате.

Пример 7. Получение противоопухолевого средства.

Готовли 300 л производственной питательной среды для биореактора, содержащей 22 г/л смесь растительных масел (подсолнечное и соевое в соотношении 4:1) и соевую муку в количестве 26 г/л, дигидрофосфат калия - 2,0 г/л и сульфат магния - 0,2 г/л. Среду стерилизовали, охлаждали.

Посевной мицелий, приготовленный по примеру 6, гомогенизировали в процессе засева производственной среды при включенной мешалке на 500 об/мин в течение 1 мин, затем скорость мешалки устанавливали 200 об/мин. Культивирование осуществляли при температуре 28°C и подаче воздуха 1,5 объема/объем среды в минуту в течение 3 суток. Выход воздушно-сухой биомассы составил 25 г/л. Из погруженной культуры отделяли мицелий фильтрованием, выделяли из него полисахаридную фракцию общепринятым методом. Определяли противоопухолевую активность на взрослых самцах мышей-гибридов (C57B1/6×6DBA/2)F1 с перевиваемой солидной T-клеточной лимфомой Р388. Лечение начинали через 48 ч после прививки опухоли. Полисахаридную фракцию вводили перорально с помощью внутригастрального зонда ежедневно 1 раз в сутки в дозе 2 мк/кг в течение 14 суток. Массу опухоли рассчитывали по формуле M (мг)=(а×b×c)/2, где М - расчетная масса опухоли, a, b, c - 3 наибольших взаимоперпедикулярных диаметра опухолевого узла в мм. Торможение роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле: ТРО (%)=(М_к-М_о)/(М_к)×100, где М_к и М_о - средняя расчетная масса опухоли в контроле и опыте соответственно.

Торможение роста опухоли на 14 сутки составило 74%.

Пример 8. Получение плодовых тел Hypsizygus ulmarius на субстрате с использованием посевного мицелия, приготовленного по примеру 1 на средах №№1-5 и 2-3.

Готовили субстрат для выращивания Hypsizygus ulmarius, содержащий смесь, состоящую из опилок, измельченной соломы и бланшированного зерна в соотношении 1:2:0,5 и мела в количестве 5% от субстрата. Субстрат пастеризовали. Относительная влажность пастеризованного субстрата составила 65%.

Приготовленный по примеру 1 на средах №№1-5 и 2-3 посевной мицелий Hypsizygus ulmarius гомогенизировали в гомогенизаторе в течение 3 минут и равномерно засевали субстрат гомогенизированным посевным мицелием в количестве 1% от массы субстрата.

Засеянный субстрат фасовали по 10 кг в полиэтиленовые пакеты диаметром 30 см. Пакеты инкубировали в темноте при 24°C до полного зарастания субстрата мицелием. Этот процесс занял 9 суток. Затем на пакетах делали отверстия и изменяли условия микроклимата. Инкубирование осуществляли при 14-16°C, освещении и вентиляции до образования плодовых тел. Образование плодовых тел проходило в три волны. Урожай плодовых тел составил 35% от массы сырого субстрата. Таким образом, использование посевного мицелия, приготовленного заявленным способом, обеспечило высокий урожай плодовых тел при сжатых сроках его получения.

Пример 9. Получение биомассы Trametes versicolor, обладающей антиоксидантными свойствами.

Приготовленный посевной мицелий Trametes versicolor по примеру 1 на средах №№1-6 и 2-5 гомогенизировали в колбах с отбойниками на ротационной качалке при 220 об/мин в течение 7 мин. Гомогенизированный мицелий вносили в количестве 5% в стерильную приготовленную производственную питательную среду следующего состава (г/л):

Глюкоза - 20,

Пептон - 10,

Гидрофосфат калия - 1,

Сульфат магния - 0,5,

Хлорид калия - 0,5

Сульфат железа - 0,01,

Вода - до 1 л.

Культивирование осуществляли в колбах на ротационной качалке при 200 об/мин, температуре 24°C в течение 4 суток. По окончании процесса культивирования биомассу отделяли от культуральной жидкости фильтрованием, сушили при температуре 50°C, измельчали и экстрагировали 90% этанолом в соотношении 1 г порошка биомассы на 15 мл экстрагента в течение 24 ч. Жидкий экстракт отделяли центрифугированием и определяли его антиоксидантные свойства кулонометрическим способом. Антиоксидантная емкость экстракта в пересчете на кверцетин составила 201 мг/мл экстракта.

Пример 10. Получение водорастворимых полисахаридов мицелия Ganoderma lucidum.

Приготовленным по примеру 2 посевным мицелием Ganoderma lucidum засевали стерильную питательную производственную среду следующего состава (г/л):

Сахароза - 20,

Пептон - 10,

Дигидрофосфат калия - 3,0,

Сульфат магния - 0,3,

Вода до 1 л.

Посевной мицелий вносили в производственную среду в количестве 10%. Культивирование на производственной среде осуществляли в биореакторе с рабочим объемом 7 л при 26°C при 200 оборотах мешалки в минуту и подаче воздуха 1.5 объема/объем среды в минуту в течение 3,5 суток. По окончании процесса культивирования мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрованием, сушили при 60°C и измельчали. Содержание водорастворимых полисахаридов определяли фенолсернокислотным методом. Согласно полученным результатам мицелий Ganoderma lucidum содержал 25,2% водорастворимых полисахаридов.

Таким образом, данное изобретение позволяет сократить длительность приготовления посевного мицелия и получить жизнеспособный посевной мицелий, который, как показано, может быть использован как для погруженного культивирования, так и для твердофазного. Использование посевного мицелия для дальнейшего твердофазного культивирования позволяет увеличить урожайность плодовых тел, а для погруженного - увеличить выход и эффективность биологически активных соединений.