×
10.07.2019
219.017.b1d3

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЙСТВИЯ ВЕЩЕСТВ НА КОМПЛЕМЕНТ (ВАРИАНТЫ)

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
№ охранного документа
02162602
Дата охранного документа
27.01.2001
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения прямого воздействия на функциональную активность компонентов комплемента различных веществ, в том числе лекарственных препаратов. Способ позволяет определять действие вещества на комплемент по ингибированию связывания активированного компонента C4 системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода. Проводят сорбцию в лунках микропанели сначала активатора компонента C4, в качестве которого используют активированный субкомпонент Cls или комплекс IgG с компонентом Cl. Затем в лунки микропанели вносят сыворотку крови человека в различных разведениях в качестве источника компонента C4, содержащую в серии экспериментов определенные концентрации тестируемого вещества, а в контрольной серии - не содержащую ингибитор. Проводят инкубацию. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента C4 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к C4 - фракции иммуноглобулинов G, ковалентно связанных с ферментом. Сравнивая данные о количестве связавшегося компонента C4 в присутствии и в отсутствие ингибитора определяют константу ингибирования тестируемым веществом связывания активированного компонента C4. По величине константы ингибирования судят о действии вещества на комплемент. Способ позволяет получить индивидуальные константы ингибирования, прост, обладает высокой воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования радиоактивности. 2 с.п. ф-лы.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения прямого воздействия на функциональную активность компонентов комплемента различных веществ, в том числе лекарственных препаратов, в частности к способам определения ингибирующего действия веществ на компонент C4 комплемента в момент его активации.

Изобретение может быть использовано в медицине для определения механизма действия лекарственных веществ, для поиска потенциальных лекарственных веществ, изучения побочного действия лекарственных препаратов и воздействия экологически вредных веществ на организм.

В литературе имеются сведения о прямом влиянии различных лекарственных или диагностических препаратов на систему комплемента в крови больного, что может иметь своим результатом либо отрицательное побочное действие лекарственных препаратов, либо положительный эффект, возможно, что такое взаимодействие с системой комплемента в последнем случае и является механизмом лечебного действия препарата. Наиболее яркими примерами в этом отношении является действие лекарственных препаратов апрессина (гидралазина), купренила (пеницилламина) и каптоприла на компонент C4 комплемента человека [1-3] . Помимо лекарственных средств прямое действие на систему комплемента могут оказывать вещества эндогенной природы, собственные метаболиты организма, оказывающие регуляторное влияние, а также экзогенные вещества, в том числе загрязняющие окружающую среду, т.е. экологически вредные.

Как было показано в литературе [2], терапевтический эффект купренила, связанный с препятствием отложению иммунных комплексов, в частности в суставах, обусловлен его действием на компонент C4 комплемента системы комплемента в момент его активации. Тот же механизм в случае гидралазина [1] и каптоприла [51, т. е. действие на C4 и подавление способности комплемента обрабатывать иммунные комплексы может приводить к побочному действию этих препаратов. Известна способность гидралазина вызывать лекарственную волчанку.

Для определения способности веществ взаимодействовать с компонентом C4 комплемента известен способ, основанный на ингибировании связывания радиоактивно меченного компонента C4 с сефарозой с иммобилизованным активированным субкомпонентом Cls [1- 3]. Недостатками этого способа является необходимость получения чистых препаратов функционально активного компонента C4 и активного субкомпонента Cls и применения радиоактивности. С использованием этого способа авторы определили константы скорости реакции взаимодействия веществ с активированным C4, но не получили индивидуальных констант ингибирования, которые могли бы служить количественной характеристикой эффективности ингибирующих веществ. Кроме того, на основе этого способа трудно создать простую в обращении тест-систему, позволяющую характеризовать ингибирующие вещества в стандартных условиях.

Нами на основе иммуноферментного метода разработан способ, позволяющий определять ингибирование различными веществами функциональной активности компонента C4, состоящей в связывании активированного компонента C4 с естественной мишенью - иммуноглобулином или альбумином. Преимуществами предложенного метода является возможность получения индивидуальных констант ингибирования, простота определения, хорошая воспроизводимость результатов и отсутствие необходимости использования радиоактивности.

Способ осуществляется следующим образом: проводят сорбцию в лунках микропанели сначала активатора компонента C4, каковым являются активированный субкомпонент Cls или комплекс IgG с компонентом C1, при этом мишенью для связывания активированного компонента C4 в первом случае служит бычий сывороточный альбумин, а во втором - иммуноглобулин, затем в лунки микропанели вносят сыворотку крови человека в качестве источника компонента C4, содержащую ряд определенных концентраций тестируемого ингибитора в серии экспериментов, и проводят инкубацию. Для контроля исходной активности компонента C4 проводят эксперимент без ингибитора. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента C4 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к C4 - фракции иммуноглобулинов G, ковалентно связанных с ферментом, и сравнивая данные о количестве связавшегося компонента C4 в присутствии различных концентраций ингибитора и в контроле без ингибитора определяют константу ингибирования связывания активированного компонента C4, характеризующую ингибирующую способность тестируемого вещества. Величина константы ингибирования, имеющая размерность концентрации, численно равна той концентрации тестируемого вещества, при которой функциональная активность компонента C4 - его способность ковалентно связываться с мишенью снижается вдвое. Эффективным ингибитором комплемента могут считаться вещества, для которых константа ингибирования, определенная этим способом, лежит в области реальных концентраций этих веществ в крови.

Способ основан на способности активированного компонента C4 ковалентно связываться с мишенью, расположенной в непосредственной близости от активатора, или с нуклеофильной группой конкурирующей молекулы ингибитора.

В качестве вещества, способного взаимодействовать с системой комплемента, выбрана салициловая кислота - известное противовоспалительное и антиревматическое средство. Действующим началом самого распространенного лекарства, аспирина, является салициловая кислота, в которую в результате гидролиза в организме превращается аспирин. Полученные по этому способу (двумя методами) константы ингибирования практически совпадают и соответствуют по порядку величин терапевтическим дозам препаратов.

Пример 1. Определение действия салициловой кислоты на комплемент. Растворяют иммунохимически чистый IgG или IgM в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, в концентрациях белка 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4oC. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCI, 0,15 мМ Ca2+ и 0,5 мМ Mg2+ (VBS2+), по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл VBS2+ по 10 мкл сыворотки морской свинки и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, затем содержимое лунок удаляют вытряхиванием. В другой микропанели с круглодонными лунками готовят серии двукратных разведений свежей сыворотки крови человека в VBS2+, общий объем в лунке 50 мкл. Затем во все лунки каждой серии вносят по 50 мкл раствора изучаемого ингибитора в определенной для каждой серии концентрации, а в контроле 50 мкл буфера без ингибитора, содержимое лунок этой микропанели переносят в первую микропанель. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37oC, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCI и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента C4 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37oC и двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно- фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата C4 рассчитывают по стандартной кривой для каждой концентрации ингибитора. Константу ингибирования Ki, определяют по линейному уравнению l/z = [1]/(zoKi) + l/z[4], где [1] - конечная концентрация ингибитора в лунках данной серии, z - активность компонента C4, определенная при данной концентрации ингибитора, a zо - активность компонента C4 в отсутствие ингибитора, строя график зависимости l/z от [1]. При этом точка пересечения графика с осью абсцисс соответствует значению - Ki Для салициловой кислоты получено значение Ki = (0,46±0,05) мг/мл или Ki = (3,32±0,38) мМ. Поскольку эта концентрация салициловой кислоты лежит в области значений, реально достижимых в крови при применении ее качестве лекарственного средства, можно считать, что она эффективно действует на комплемент.

Пример 2. Определение действия салициловой кислоты на комплемент. Раствор 1 мкг/мл активированного субкомпонента Cls [5] в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4oC. Отмывают планшет вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Ca2+ и 0,5 мМ Mg2+ (VBS2+) и 0,3% бычьего сывороточного альбумина, по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В другой микропанели с круглодонными лунками готовят серии двукратных разведений свежей сыворотки крови человека в VBS2+, общий объем в лунке 50 мкл. Затем во все лунки каждой серии вносят по 50 мкл раствора изучаемого ингибитора в определенной для каждой серии концентрации, а в контроле 50 мкл буфера без ингибитора, содержимое лунок этой микропанели переносят в первую микропанель. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37oC, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента C4 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37oC и двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата C4 рассчитывают по стандартной кривой для каждой концентрации ингибитора. Константу ингибирования Ki, определяют по линейному уравнению l/z = [1]/(zoKi,) + l/z[4], где [1] - конечная концентрация ингибитора в лунках данной серии, z - активность компонента C4, определенная при данной концентрации ингибитора, a zo - активность компонента C4 в отсутствие ингибитора, строя график зависимости l/z от [1]. При этом точка пересечения графика с осью абсцисс соответствует значению - Ki. Для салициловой кислоты получено значение Ki, равное (0,39±0,07) мг/мл или (2,85± 0,50) мМ. Поскольку эта концентрация салициловой кислоты лежит в области значений, реально достижимых в крови при применении ее качестве лекарственного средства, можно считать, что она эффективно действует на комплемент.

Литература
1. Sim E., Law S.K.A. Hydralazin binds covalently to complement component C4. Dilfferent reactivity оf C4A and C4B gene products. FEBS Letters. 1985. V. 184. N 2. P. 323-327.

2. Sim E., Dodds A.W., Goldin A. Inhibition oh the covalent binding reaction of complement component C4 by penicillamine, an anti-rheumatic agent. Biochem. J. 1989. V. 259. P. 415-419.

3. Edmonds S., Gibb A., Sim E. Effect of thiol compound on human complement component C4. Biochem. J. 1993. V. 289. P. 801 - 805.

4. Козлов Л.В., Сизой М.Н., Зинченко А.А., ЛевковскийА.В. Ингибирование связывания и активация первого компонента комплемента человека. Действие синтетических пептидов, фрагментов иммуноглобулинов и некоторых белков. Биохимия. 1986. Т. 51. N 5. С. 707-718.

5. Козлов Л. В. , Шойбонов Б.Б., Иванов А.E., Зубов В.П., Антонов В.К. Ступенчатая диссоциация субкомпонентов C1, первого компонента комплемента человека, при активации на аффинном сорбенте. Биохимия. 1989. Т. 54. N 10. С. 1754-1760.

1.Способопределениядействиявеществнакомплемент,отличающийсятем,чтосорбируютвлункахмикропанелинеспецифическиеиммуноглобулиныGилиMчеловекаилиживотных,влункимикропанелейвносятцельнуюсывороткуморскойсвинки,проводятинкубацию,жидкоесодержимоелунокудаляют,затемвсериилуноквносятввыбранныхразведенияхсывороткучеловека,содержащуюопределеннуюдлякаждойсерииконцентрациютестируемоговещества,вконтрольнойсериитестируемоевеществоневносят,послеинкубациииудаленияжидкогосодержимоголуноквносятконъюгатферментасантителамипротивкомпонентаC4человекаисубстратэтогофермента,послечегопроводятопределениеколичествасвязавшегосякомпонентаC4попродуктуферментативнойреакциии,сравниваяданныеоколичествесвязавшегосякомпонентаC4вприсутствииопределенныхконцентрацийтестируемоговеществаивотсутствиетестируемоговещества,определяютконстантуингибированияэтимвеществомсвязыванияактивированногокомпонентаC4,повеличинеконстантысудятодействиитестируемоговеществанакомплемент.12.Способопределениядействиявеществнакомплемент,отличающийсятем,чтосорбируютвлункахмикропанелиактивированныйсубкомпонентCIsкомплементаисывороточныйальбумин,затемвсериилуноквносятввыбранныхразведенияхсывороткучеловека,содержащуюопределеннуюдлякаждойсерииконцентрациютестируемоговещества,вконтрольнойсериитестируемоевеществоневносят,послеинкубациииудаленияжидкогосодержимоголуноквносятконъюгатферментасантителамипротивкомпонентаC4человекаисубстратэтогофермента,послечегопроводятопределениеколичествасвязавшегосякомпонентаC4попродуктуферментативнойреакциии,сравниваяданныеоколичествесвязавшегосякомпонентаC4вприсутствииопределенныхконцентрацийтестируемоговеществаивотсутствиетестируемоговещества,определяютконстантуингибированияэтимвеществомсвязыванияактивированногокомпонентаC4,повеличинеконстантысудятодействиитестируемоговеществанакомплемент.2
Источник поступления информации: Роспатент

Showing 1-6 of 6 items.
20.02.2019
№219.016.bd7a

Способ получения фракции антигенов вируса кори

Изобретение относится к области медицины, в частности к вирусологии и биотехнологии, и может быть использовано для получения новых иммуногенных и диагностических препаратов. Сущностью способа является заражение вирусом кори клеточной культуры Vero, пассирование вируса через клеточную культуру,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 02205022
Дата охранного документа: 27.05.2003
17.04.2019
№219.017.166f

Способ определения действия веществ на комплемент на стадии связывания субкомпонента c1q

Способ может быть использован в области медицины, в частности в иммунологии. Сорбируют в лунках микропанели неспецифический иммуноглобулин G, затем в лунки вносят в выбранных разведениях сыворотку человека, содержащую определенную для каждой серии концентрацию тестируемого вещества, в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 02190219
Дата охранного документа: 27.09.2002
29.04.2019
№219.017.474d

Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры человека в возрасте от 12 лет и старше

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности. Консорциум бифидобактерий и лактобацилл содержит Bifidobacterium bifidum 791, В. bifidum ЛВА-3, В.longum В379М, В.longum Я-3, В.adolescentis Г7513, В. adolescentis ГО-13, Lactobacillus plantarum 8-РА-3, Lactobacillus...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002180914
Дата охранного документа: 27.03.2002
29.04.2019
№219.017.4750

Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры детей в возрасте от 3 до 12 лет

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности. Консорциум бифидобактерий и лактобацилл Bifidobacterium bifidum 1, B.bifidum 791, B.breve 79-88, B.infantis 79-43, B.longum B379M, Lactobacillus plantarum 8-PA-3, L.fermentum 90-TC-4, Lactobacillus acidophilus K3ш24,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002180348
Дата охранного документа: 10.03.2002
29.04.2019
№219.017.4751

Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры детей в возрасте до 3-х лет

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности. Консорциум бифидобактерий и лактобацилл Bifidobacterium bifidum 1, B. bifidum 791, B.breve 79-119, B.breve 79-88, B.infantis 73-15, B.infantis 79-43, Lactobacillus plantarum 8-PA-3, L.fermentum 90-ТС-4, ГКНМ МНИИЭМ им....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002180915
Дата охранного документа: 27.03.2002
29.05.2019
№219.017.6a4e

Штамм bifidobacterium breve 79-88, используемый для приготовления лечебно-профилактических кисломолочных, неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок и бактерийных препаратов

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Bifidobacterium breve 79-88 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка. Штамм активно развивается в питательных средах разного состава с накоплением производственной биомассы в короткие, 16-24 ч, сроки культивирования и концентрацией...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002176270
Дата охранного документа: 27.11.2001
Showing 1-5 of 5 items.
01.03.2019
№219.016.caf3

Способ получения моноспецифических поликлональных антисывороток к антигенно родственным белкам

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения моноспецифических поликлональных антисывороток к близкородственным белкам при диагностике ряда заболеваний. Способ предусматривает иммунизацию животного путем однократного многоточечного введения в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 02215294
Дата охранного документа: 27.10.2003
04.04.2019
№219.016.fd32

Способ определения функциональной активности c1-ингибитора комплемента человека

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Способ обеспечивает снижение затрат для определения...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 02195662
Дата охранного документа: 27.12.2002
17.04.2019
№219.017.166f

Способ определения действия веществ на комплемент на стадии связывания субкомпонента c1q

Способ может быть использован в области медицины, в частности в иммунологии. Сорбируют в лунках микропанели неспецифический иммуноглобулин G, затем в лунки вносят в выбранных разведениях сыворотку человека, содержащую определенную для каждой серии концентрацию тестируемого вещества, в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 02190219
Дата охранного документа: 27.09.2002
09.06.2019
№219.017.7774

Способ оценки микробиоценоза влагалища

Изобретение относится к медицине, к области бактериологии и иммунологии. Сущность способа оценки микробиоценоза влагалища состоит в следующем: для исследования одновременно берут отделяемое и соскобный материал из влагалища, затем производят смыв из влагалища 5,0 мл 6,0% раствора полиглюкина,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002249821
Дата охранного документа: 10.04.2005
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0000215514
Дата охранного документа: 20.06.1968
+ добавить свой РИД