ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКИЙ РЕГЕНЕРАНТ GI

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии, травматологии, общей хирургии, стоматологии, комбустиологии, пластической хирургии, косметологии, и может найти применение в качестве биопластического материала для замещения и стимуляции органоспецифического восстановления поврежденных тканей организма человека.

В последнее время интенсивно развивается направление биоинженерии по разработке универсальных матриц по органоспецифическому восстановлению повреждений тканевых структур организма человека для нужд регенеративной медицины. Однако в настоящее время подобных материалов не существует, наиболее близкими к этой категории являются средства на основе фибриновой матрицы, выполняющие роль гемостатиков.

Известен Тиссукол Кит (Справочник Видаль 2010: Лекарственные препараты в России, АстраФармСервис, 2010 г.) - двухкомпонентный фибриновый клей, состоящий из лиофилизированного концентрата клеящего белка для приготовления раствора Тиссукола в комплекте с раствором апротинина (бычьего) активностью 3000 единиц инактивации кининогенинов (ЕИК) и лиофилизированного тромбина 4 или тромбина 500 (человеческого) в комплекте с раствором хлорида кальция 40 ммоль/л. Один мл готового раствора Тиссукола содержит коагулирующих белков 75-115 мг (в т.ч. фибриногена 70-110 мг и фибронектина плазмы 2-9 мг), фактора XIII 10-50 ЕД и плазминогена 40-120 мкг. Один мл готового раствора тромбина содержит 4 или 500 ME тромбина согласно Первому международному стандарту. Выпускается в наборах для приготовления по 0,5; 1; 2 и 5 мл растворов Тиссукола и тромбина для нанесения с применением системы дуплоджект. Раствор, образующийся в результате смешивания двух компонентов набора, превращается в белую эластичную массу, плотно прилипающую к тканям (имитируются основные этапы свертывания крови). Скорость формирования пленки зависит от концентрации тромбина. При концентрации тромбина 4 МЕ/мл этот процесс происходит за 30-60 с, при более высокой концентрации (500 МЕ/мл) завершается за несколько секунд. Высокую концентрацию тромбина используют для остановки кровотечений, а низкую - для склеивания тканей. В ходе заживления раны фибриновый слой полностью рассасывается.

Тиссукол Кит наносится тонким слоем на рану. Доза зависит от размеров поверхности и метода нанесения (1 мл раствора Тиссукола и 1 мл раствора тромбина достаточно для заклеивания не менее 10 см² площади поверхности, при распылении этого количества клея хватит для обработки от 25 до 100 см²). Двухкомпонентный клей готовят путем смешивания лиофилизированного Тиссукола с апротинином и добавления тромбина, смешанного с хлоридом кальция (для фиксации нервов используют апротинин с концентрацией 100 ЕИК/мл). Предварительно смешанные компоненты клея могут быть нанесены с использованием системы дуплоджект (с распылительной головкой, аппликационной иглой, аппликационным катетером), необходимо фиксировать склеенные части в течение 3-5 мин.

Основными недостатками Тиссукола Кит являются большой срок заживления ран, сложность подготовки обрабатываемой раны, т.к. перед нанесением клея необходимо исключить контакт с растворами, содержащими спирт, йод, тяжелые металлы, и по возможности прикрыть все ткани, примыкающие к заклеиваемому участку, а также аллергические реакции (после повторного местного использования); при инъекции в ткань или сосуд - анафилактические реакции; при интраваскулярном введении - тромбоэмболия.

Способ применения: "ТахоКомб" следует наносить на хирургические раневые поверхности в стерильных условиях. Перед наложением пластины "ТахоКомба" раневая поверхность должна быть максимально вычищена (например, от крови, дезинфицирующих и других жидкостей). Кроме того, рекомендуется очистить хирургические перчатки и инструменты от крови и жидкости для того, чтобы избежать их склеивания с пластиной "ТахоКомба". Сторону, покрытую факторами свертывания и помеченную желтым цветом, наложить на раневую поверхность и прижимать в течение 3-5 минут. При нанесении пластины на достаточно влажные раневые поверхности дополнительного увлажнения пластины не требуется. В случае применения на сухие раневые поверхности пластину следует увлажнить физиологическим раствором для достижения полного соединения с сухими участками раневой поверхности. Увлажненную пластину следует использовать немедленно! Размер и количество пластин зависят от величины раневой поверхности. Края раны должны быть перекрыты пластиной на 1-2 см. Если для закрытия раневой поверхности требуется более одной пластины, то при наложении на рану их края должны перекрывать друг друга. Стерильными ножницами можно вырезать пластины требуемого размера как до, так и после наложения на раневую поверхность. Неиспользованные фрагменты пластины подлежат уничтожению.

Недостатком "ТахоКомба" является то, что его введение требует чрезвычайной аккуратности и сопряжено со значительными трудностями, так как при работе инструментами легко повреждается клеящая поверхность (Scheyer M., Zimmerman G. Tachocomb used in endoscopic surgery // Surg. Endosc. - 1996. - №5. - P.501-503).

Кроме того, коллаген животных, использующийся при изготовлении "ТахоКомба", может служить причиной иммунологических реакций (Keefe J. et al. Clinical use of injectable bovine collagen: a decade of experience // Clin. Mater. - 1992. - Vol.9. - №3-4. - P.155-162).

Количество и качество фибриновых волокон в Тиссукол Кит и "ТахоКомб" может приводит к созданию настолько плотной структуры, что это затрудняет ангиогенез, а значит и общее заживление [Byrne, D.J. et al Br. J. Surg. 1991:78:841.] Кроме того, матрица фибринового клея зарубежных аналогов является биологически пассивной, поскольку не обладает способностью активно привлекать недифференцированные клетки. Хотя отсутствие этой способности не влияет на гемостатическую активность фибринового сгустка, это может привести к продлению периода заживления и неправильному восстановлению тканей. Также при введении препаратов на основе плазмы всегда существует опасность заражения инфекционными заболеваниями за счет переноса возбудителей.

Прототипом изобретения является «Биологический адгезивный клей» - клеевая композиция для остановки кровотечения и восстановления биологической целостности тканей (Патент РФ №2224540, 27.02.2004), которая содержит криопреципитат, полученный путем рефрижераторного центрифугирования при скорости 2500-3000 об/мин в течение 1-1,5 ч, доза которого содержит VIII фактор с активностью от 150 до 220 ед., тромбин с активностью от 160 до 700 ед. в 7-15 мл изотонического раствора хлорида натрия и 3-10 мл 10% хлорида кальция или глюконата кальция.

Композицию получают следующим образом.

1. Для получения криопреципитата карантинизированную (в течение 6 месяцев) свежезамороженную плазму (донорская или АУТО) размораживают при комнатной температуре до вида "мокрого сахарного песка", в количестве 300 мл, затем плазменную субстанцию центрифугируют в рефрижераторной центрифуге в течение 1-1,5 ч при скорости 2500-3000 об/мин. Надосадочную часть плазмы (супернатант) и среднюю фракцию плазмы (концентрат нативной плазмы) через замкнутую систему перегоняют в пластикатные контейнеры. Осадочную часть плазмы с белесым осадком (криопреципитат) оставляют в основном мешке и вновь замораживают. Полученный криопреципитат содержит VIII фактор с активностью от 150 до 220 ед. Хранят криопреципитат при температуре от 28°С до 73°С.

2. Одну дозу криопреципитата, содержащую 160 ед. антигемофильного глобулина (VIII фактор), оттаивают при комнатной температуре в условиях встряхивания до образования однородной массы (чтобы не было образования комков).

3. Тромбин, взятый с активностью в количестве 240 - 700 ед., растворяют в равных количествах в двух пробирках, содержащих 10 мл изотонического раствора NaCl и 5 мл 10% CaCl₂ или 5 мл 10% глюконата соответственно, затем смешивают.

4. Криопреципитат и раствор тромбина смешивают непосредственно перед использованием.

Недостатком биологического адгезивного клея является длительное восстановление биологической целостности тканей, т.к не обогащен факторами роста. Также имеет низкое качество криопреципитата и низкую активность VIII фактора за счет длительного центрифугирования.

Техническим результатом предлагаемого органоспецифического регенеранта GI является повышение эффективности восстановления тканей поверхностных и глубоких ран организма.

Технический результат достигается тем, что в органоспецифическом регенеранте GI, включающем фибриновую матрицу с тромбином, криопреципитат, полученный из карантинизированной свежезамороженной донорской плазмы, 0,9% раствор натрия хлорида и 10% раствор кальция хлорида, фибриновая матрица наноструктурирована и включает тромболизат, обогащенный факторами роста и цитокинами, причем криопреципитат, тромболизат и тромбин человеческий в равных объемах при следующем количественном соотношении компонентов, мг:

криопреципитат - 1

тромболизат - 1

тромбин человеческий - 1

0,9% раствор натрия хлорида - 2

10% раствор кальция хлорида - 1.

На фиг.1 показана трехмолекулярно перекрещенная наноструктурированная фибриновая матрица органоспецифического регенеранта GI, на фиг.2 - образование сшивок макромолекул и формирование наноструктурированной фибриновой матрицы, на фиг.3 - биосовместимость органоспецифического регенеранта GI в культуре мезенхимальных стромальных стволовых клеток, увеличение 50х, на фиг. 4 - биосовместимость органоспецифического регенеранта GI в культуре мезенхимальных стромальных стволовых клеток, увеличение 100х, на фиг.5 - формирование дефекта бедренной кости, на фиг.6 - дефект в области верхней трети бедренной кости, на фиг.7 - рентгенография левой бедренной кости (контроль) на 40 день после операции, на фиг.8 - рентгенография правой бедренной кости (опыт) на 40 день после операции, на фиг.9 - органоспецифический регенерант GI, на фиг.10 - органоспецифический регенерант GI на инъекционной игле.

Образование сшивок макромолекул и формирование наноструктурированной фибриновой матрицы происходит по схеме, изображенной на фиг.2. В результате образуется наноструктурированная фибриновая матрица, имеющая ячеистое строение, размерный диапазон составляет от 10 до 100 нм.

Подобная трехмолекулярно перекрещенная наноструктурированная фибриновая матрица обеспечивает свободную миграцию клеток, врастание новых капилляров внутрь матрицы, достаточную механическую прочность и эластичность. В структуру матрицы введены факторы роста, усиливающие регенеративный потенциал биоматериала. Наноструктурированная фибриновая матрица органоспецифического регенеранта GI проницаема для газов (кислорода, углекислоты), что обеспечивает нормальный газообмен и создает оптимальные условия для протекания репаративных процессов. Данная матрица способна метаболизироваться в условиях раны, что исключает применение перевязок.

Органоспецифический регенерант GI получают следующим образом. Используется криопреципитат, полученный из карантинизированной свежезамороженной донорской плазмы; концентрат тромбоцитов, взвешенных в плазме и подвергшихся многократному замораживанию и размораживанию с целью получения плазмы, обедненной тромбоцитами, обогащенной факторами роста (тромболизат); тромбин человеческий (лиофильно высушенный) 5-500 ЕД; 0,9% раствор натрия хлорида; 10% раствор кальция хлорида.

Тромболизат готовят следующим образом. Полученный из крови концентрат тромбоцитов (в стерильном пластиковом контейнере) подвергается замораживанию на быстрозамораживателе с последующим размораживанием в специальном размораживателе. По истечении трехкратно повторяющихся циклов замораживания - размораживания плазма подвергается центрифугированию. Надосадочная жидкость перемещается в пустой пластиковый контейнер и повторно центрифугируется при тех же условиях. Плазму с уменьшенным содержанием тромбоцитов фильтруют через стерильный однослойный ватно-марлевый фильтр в условиях бокса, затем пропускают через стерильный бумажный фильтр и в заключение - через фильтр (Millipore IRELAND Ltd). Полученный тромболизат хранится при температуре ниже -25°С в течение 36 месяцев.

Тромболизат улучшает заживление за счет различных факторов роста и цитокинов, секретируемых из α-гранул тромбоцитов. Основные цитокины, обнаруженные в тромболизате, включают трансформирующий фактор роста β (TGF-β), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF-I, IGF-II), фактор роста фибробластов (FGF), эпидермальный фактор роста, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста эндотелиальных клеток. Эти цитокины играют важную роль в процессах клеточной пролиферации, хемотаксиса, дифференциации и ангиогенеза. Биологическое действие специфических молекул, входящих в состав тромболизата, приведено в таблице.

Для приготовления криопреципитата «Органоспецифического регенеранта GI» используют ультрацентрифугирование, т.е. разделение частиц размером менее 100 нм в течение 15 мин при температуре +2°С+-2°С, со скоростью 4200 об/мин. Тем самым добиваются наноструктурирование фибриновой матрицы, благодаря чему она становится более прочной и эластичной. Использование ультрацентрифуги позволяет сократить время центрифугирования и тем самым исключить негативное воздействие на качество криопреципитата и увеличить активность VIII фактора до 70 ME. Хранится он при температуре ниже -60°С. Это позволяет материалу длительное время (в течение 36 месяцев сохранять свои первоначальные свойства).

Подготовленные компоненты (криопреципитат, тромболизат, раствор тромбина) используются в равных объемах.

В первый шприц набирается 1 мг размороженного криопреципитата; во второй шприц - 1 мг тромбина 5-500 ЕД, разведенного в 2 мг 0,9% хлористого натрия с добавлением 1 мг 10% раствора хлористого кальция; в третий шприц набирается 1 мг тромболизата.

Компоненты матрицы могут наноситься следующими способами.

1. Последовательное нанесение каждого из компонентов (тромболизат на раневую поверхность, затем криопреципитат и после тромбин).

2. Нанесение тромболизата на место повреждения. Затем одновременно наносится тромбин и криопреципитат с использованием системы дупложект (кассета для 2-х шприцев с общим плунжером) и аппликационной иглы (короткая тупая игла, в основании которой происходит перемешивание) или с использованием системы дупложект и распылительной головки (стерильная, одноразовая, набор включает стерильный фильтр, соединительный шланг и распылительные головки).

3. Нанесение тромболизата, смешанного с криопреципитатом, и тромбина на место повреждения с использованием системы дупложект.

В итоге на поврежденной поверхности образуется матовая желеобразная эластичная пленка, обладающая гемостатическим и регенераторным действием. Фибриноген, входящий в состав криопреципитата, подвергается ферментативному расщеплению ферментом тромбином, образующийся фибрин-мономер под действием активного XIII фактора свертывания крови полимеризуется и выпадает в осадок в виде белых нитей фибрин-полимера. Образующаяся фибриновая пленка закупоривает кровоточащие сосуды.

«Органоспецифический регенерант GI» улучшает заживление за счет различных факторов роста и цитокинов. Основные цитокины, обнаруженные в этой плазме, включают трансформирующий фактор роста β (TGF-β), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF-I, IGF-II), фактор роста фибробластов (FGF), эпидермальный фактор роста, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста эндотелиальных клеток. Эти цитокины играют важную роль в процессах клеточной пролиферации, хемотаксиса, дифференциации и ангиогенеза.

Исследование биосовместимости органоспецифического регенеранта GI проводили в культуре мезенхимальных стромальных стволовых клеток.

За время культивирования наблюдается активное увеличение плотности колоний за счет увеличения адгезивных клеток небольших размеров до 100% на периферии. В непосредственной близости от материала небольшие участки разрежение (Фиг.3)

Морфологическая картина хорошая, клетки малых размеров, с четкими и ровными краями, плотными межклеточными контактами, цитоплазма равномерная, без включений, ядра четкие с одним и более ядрышками (Фиг.4).

Общая плотность колоний на 26 сутки составляла 100%, за исключением участков расположения материалов (10-15% пластика). На 26 день клетки сняли раствором трипсин-версена, посчитали и проанализировали на проточном цитометре. Количество клеток с одной культуральной посуды (20.3 см²) составило 1, 500000 млн клеток. Количество удвоений 5,73 удвоений культуры, скорость удвоения 0,01 удв./час (0,220 удв./день).

Выводы по микроскопии.

На основании данных микроскопии, данных за токсичность материала нет. Клетки хорошо растут в присутствии материала. При совместном культивировании наблюдается оптимальная скорость роста, что очевидно связанно с наличием факторов роста и цитокинов. Также было выявлено изменение морфологической картины - на первых этапах культивирования клетки имели более четкую структуру, однородную цитоплазму, ровные края и отростки, размеры клеток были несколько меньше клеток в контроле. На последних этапах культивирования различия в морфологической картине не визуализировались.

Исследования проводили также на кроликах породы «Шиншилла» массой 3,5-4 кг, возрастом 2,5-3 года. Животным интраоперационно создавали модель костных дефектов в области верхней трети бедренной кости на обеих задних конечностях (фиг.5 - формирование дефекта бедренной кости, фиг.6 - дефект в области верхней трети бедренной кости). Диаметр дефектов был 2,5 мм, дефект носил сквозной характер.

В область дефекта правой бедренной кости (опыт) вводили биоматериал (нанесение тромболизата, смешанного с криопреципитатом, и тромбина на место повреждения с использованием системы дупложект), а область дефекта левой бедренной кости лечению не подвергалась (контроль). Рану послойно ушивали наглухо. На рану накладывали асептическую спиртовую повязку. Иммобилизацию конечности не проводили. Контроль заживления проводился с использованием рентгенографии бедренных костей с периодичностью 7 дней в течение двух месяцев (фиг.7 - рентгенография левой бедренной кости (контроль) на 40 день после операции, фиг.8 - рентгенография правой бедренной кости (опыт) на 40 день после операции). При макроскопической оценке области дефектов учитывали такие показатели как восстановление целостности кости, степень восполнения дефектов костей, размеры, цвет, однородность регенерата.

Для микроскопической оценки полученный при биопсии материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, промывали в проточной воде в течение 24 часов, декальцинировали в растворе трилона В. Далее материал обезжиривали, обезвоживали, заливали в гистомиксовые блоки. Из них изготавливали серийные срезы толщиной 5-6 мкм на всю глубину блока (45 стекол на 1 блок). Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван-Гизон.

Стимулирующий эффект материала прослеживается на всех этапах регенерации костной ткани. В основе стимуляции лежит ускорение дифференцирования клеточных элементов, а не элементарная мобилизация пролиферативных свойств клеточных элементов. Более активное течение остеогенеза проявляется ранним формированием костных балок.

Основным показателем эффективности материала является заметная активизация процессов перестройки костно-тканевого регенерата вплоть до более раннего созревания новообразованной костной ткани и ее органной перестройки.

Новизной разработанного органоспецифического регенеранта GI является то, что впервые использована наноструктурированная фибриновая матрица, обогащенная факторами роста и цитокинами (трансформирующий фактор роста β (TGF-β), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF-I, IGF-II), фактор роста фибробластов (FGF), эпидермальный фактор роста, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста эндотелиальных клеток). Данное сочетание обеспечивает высокую биосовместимость и репаративный потенциал органоспецифического регенеранта GI.

Таким образом, предлагаемый органоспецифический регенерант GI, по сравнению с прототипом, является эффективным регенерантом, обладает хорошими адгезивными свойствами, не требует тщательного высушивания поверхности перед нанесением и не несет риска заражения гемотрансмиссивными инфекциями.