ИНАКТИВИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ПАРАГРИППА-3 КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств специфической профилактики парагриппа -3 (ПГ-3) крупного рогатого скота (КРС).

ПГ-3 (транспортная лихорадка КРС, параинфлюэнца-3) - остро протекающая контагиозная вирусная болезнь, главным образом телят, характеризующаяся поражением органов дыхания, но наиболее характерной является латентная форма парагриппозной инфекции. Часто осложняет течение других болезней, в сочетании с пастереллами обуславливают тяжелые формы респираторных инфекций у телят. ПГ-3 распространен повсеместно, практически во всех странах мира. Серологические исследования, проведенные в различных странах мира и в нашей стране, показали, что антитела к вирусу ПГ-3 обнаруживаются у 85-97% обследованных животных. Указанная инфекция возникает у КРС как в виде моноинфекции, так и в виде смешанных вирусных и вирусно-бактериальных инфекций, которые наносят значительный экономический ущерб из-за гибели и выбраковки животных, снижения продуктивности и нарушения воспроизводства.

Для специфической профилактики ПГ-3 применяют живые и инактивированные вакцины [1, 2].

Известна инактивированная вакцина против ПГ-3 КРС, содержащая антигенный материал из штамма гомологичного вируса, инактивант теотропин, аэросил, сапонин, гидроокись алюминия и тиомерсал в эффективных соотношениях [3].

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является инактивированная вакцина против ПГ-3 КРС, содержащая антигенный материал из штамма "ЗКСМ" гомологичного вируса, инактивант, адъювант и консервант в эффективных соотношениях [4, 5].

Общим недостатком известных инактивированных вакцин является низкая иммуногенная активность по причине нестабильности при инактивации используемых штаммов. В связи с этим актуальной остается проблема разработки инактивированной высокоиммуногенной, ареактогенной и безвредной вакцины против ПГ-3 КРС на основе новых штаммов, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и сохраняющих свои нативные биологические свойства после инактивации.

В задачу создания настоящего изобретения входило расширение арсенала средств специфической профилактики ПГ-3 КРС на основе новых штаммов вируса ПГ-3 КРС, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и сохраняющих свои нативные свойства после инактивации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала средств специфической профилактики ПГ-3 КРС.

Указанный технический результат достигнут созданием инактивированной вакцины против ПГ-3 КРС, охарактеризованной следующей совокупностью признаков:
1. Инактивированная вакцина против ПГ-3 КРС.

2. Антигенный материал из штамма "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС.

3. Антигенный материал из штамма "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС в эффективном количестве.

4. Штамм "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС с инфекционной активностью не ниже 6,5 lg ТЦД₅₀/см³.

5. Инактивант.

6. Из инактивантов аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ).

7. АЭЭИ в виде 6%-ного водного раствора.

8. Адъювант.

9. Из адъювантов адсорбент гель гидроокиси алюминия (ГОА).

10. Гель ГОА в виде 3%-ного водного раствора.

11. Из адъювантов сапонин.

12. Сапонин в виде 10%-ного водного раствора.

13. Консервант.

14. Из консервантов тиомерсал (мертиолят).

15. Антигенный материал из штамма "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС, инактивант АЭЭИ, гель ГОА, сапонин и тиомерсал взяты в соотношении, мас.%:
АЭЭИ - 0,102
Гель ГОА - 1,0
Сапонин - 0,04
Тиомерсал - 0,001
Антигенный материал - До 100,0
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1. Инактивированная вакцина против ПГ-3 КРС.

2. Антигенный материал из штамма "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС.

3. Антигенный материал из штамма "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС в эффективном количестве.

4. Инактивант.

5. Адъювант.

6. Консервант.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Штамм "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС с инфекционной активностью не ниже 6,5 lg ТЦД₅₀/см³.

2. Из инактивантов АЭЭИ.

3. АЭЭИ в виде 6%-ного водного раствора.

4. Из адъювантов адсорбент гель ГОА.

5. Гель ГОА в виде 3%-ного водного раствора.

6. Из адъювантов сапонин.

7. Сапонин в виде 10%-ного водного раствора.

8. Из консервантов тиомерсал.

9. Антигенный материал из штамма "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС, инактивант АЭЭИ, гель ГОА, сапонин и тиомерсал взяты в соотношении, мас.%:
АЭЭИ - 0,102
Гель ГОА - 1,0
Сапонин - 0,04
Тиомерсал - 0,001
Антигенный материал - До 100,0
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. Инактивированная вакцина против ПГ-3 КРС.

2. Антигенный материал из штамма гомологичного вируса.

3. Инактивант.

4. Адъювант.

5. Консервант.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком изобретения является то, что из штаммов предлагаемая вакцина содержит штамм "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС, взятый в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Штамм "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС с инфекционной активностью не ниже 6,5 lg ТЦД₅₀/см³.

2. Из инактивантов АЭЭИ.

3. АЭЭИ в виде 6%-ного водного раствора.

4. Из адъювантов адсорбент гель ГОА.

5. Гель ГОА в виде 3%-ного водного раствора.

6. Из адъювантов сапонин.

7. Сапонин в виде 10%-ного водного раствора.

8. Из консервантов тиомерсал.

9. Антигенный материал из штамма "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС, инактивант АЭЭИ, гель ГОА, сапонин и тиомерсал взяты в соотношении, мас.%:
АЭЭИ - 0,102
Гель ГОА - 1,0
Сапонин - 0,04
Тиомерсал - 0,001
Антигенный материал - До 100,0
Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает защиту КРС от вируса ПГ-3, циркулирующего на территории России. Достижение технического результата от использования предлагаемой вакцины объясняется тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из нового штамма "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС, сохраняющего нативные биологические свойства после инактивации и обладающего высокой иммуногенной активностью.

Исходный вирус для получения штамма "ВГНКИ-4" выделен из легких 2-3-месячных телят с респираторной патологией.

Производственный штамм "ВГНКИ-4" получен путем адаптации к перевиваемой культуре клеток почек теленка "Таурус-1" [6].

Полученный штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 30.09.99 г. под регистрационным наименованием "ВГНКИ-4" ДЕП.

Штамм "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.

Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления средств специфической профилактики ПГ-3 КРС. Штамм "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 обеспечивает получение эффективных живых и инактивированных вакцин, создающих защиту восприимчивых животных против указанного возбудителя заболевания.

Штамм "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства
Штамм "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 относится к семейству Paramyxoviridae, роду Parainfluenza, подтипу Parainfluenza virus 3 и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ПГ-3: полиморфной слегка овальной формы, размер вириона варьирует от 150 до 250 нм. Вирион состоит из оболочки и внутреннего компонента, который представлен рибонуклеопротеидной спиралью. Коэффициент седиментации - 1000 S в градиенте сахарозы.

Вирус ПГ-3 штамма "ВГНКИ-4" имеет 7 структурных белков:
1. Фосфопротеины (Р, мол. м. 83 кД).

2. ГА-нейраминидазный гликопротеин (HN, мол. м. 69 кД).

3. Главный нуклеокапсидный протеин (NP, мол. м. 66 кД).

4. Гликопротеин (F, мол. м. 55 кД).

5. Матричный белок (М, мол. м. 38 кД).

6. Белок L-полимераза (мол. м. 180 кД).

7. Клеточный активный белок А (мол. м. 43 кД).

Антигенные свойства
Штамм "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 агглютинирует эритроциты морской свинки, кролика, свиньи, коровы, мыши, овцы, козы, человека, белой мыши. Клетки, инфицированные вирусом ПГ-3 из штамма "ВГНКИ-4", сорбируют эритроциты морской свинки, КРС, овцы, кролика и белой мыши. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител на 8-14 сутки после ревакцинации, антитела достигают пика к 16-28 дню и сохраняются до одного года. Продолжительность и напряженность поствакцинального иммунитета обеспечивается преимущественно lgG и секреторными lgA, выработка которых стимулируется активным вакцинальным процессом. Привитые телята с титром гуморальных антител 6,0-10,3 лог₂ устойчивы к заражению вирусом ПГ-3. Полевые изоляты вируса ПГ-3 имеют близкое антигенное родство с вирусом ПГ-3 штамма "ВГНКИ-4".

Биотехнологические характеристики
Штамм "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 проявляет высокую биологическую антигенную и иммуногенную активность, как в нативном виде, так и после инактивации, соответствует полевым изолятам. Штамм "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 предназначен для использования в качестве сырья для приготовления живых и инактивированных вакцин против ПГ-3 КРС. Этот вирус репродуцируется в культурах клеток ПЭК, ПТ, МДВК, ВНК-21 и накапливается в титрах 6,5-8,5 lg ТЦД₅₀/см³. Штамм "ВГНКИ-4" является стабильным и безвредным.

Устойчивость к внешним факторам
Вирус ПГ-3 штамма "ВГНКИ-4" быстро разрушается под действием высокой температуры. Возбудитель чувствителен к хлороформу, эфиру, формалину, детергентам.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ПГ-3.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое решение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1
Для изготовления инактивированной вакцины против ПГ-3 из штамма "ВГНКИ-4" используют как перевиваемую монослойную культуру клеток ВНК-21, так и перевиваемую монослойную культуру клеток ВНК-21, адаптированную к суспензионному культивированию. При суспензионном культивировании в качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла или раствор Хенкса без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 6,7-7,2. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,90-0,12 ТЦД₅₀/клетка. Культивирование вируса ведут при температуре 36-37^oС в течение 24-32 часов до появления ЦПД на 80-90%. После замораживания и оттаивания вируссодержащую суспензию сливают в емкость и отбирают пробы для контроля стерильности и биологической активности вируссодержащего материала. Для составления серии вакцины используют только стерильные вируссодержащие жидкости, прошедшие контроль на МПА, МПБ и тиогликолевой среде. Одновременно берут пробы (1-2 см³) для определения титра вируса. Биологическая активность вируссодержащего материала должна быть не ниже 6,5-8,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Полученную вируссодержащую суспензию очищают от балластных примесей центрифугированием.

Затем вирусную суспензию подвергают инактивации рабочим раствором аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ). Рабочий раствор АЭЭИ готовят за 30-60 минут до внесения в вирусную суспензию путем разбавления исходного препарата (15-19%-ного водного раствора АЭЭИ) стерильной деминерализованной водой до 6% концентрации. Во избежание изменения рН суспензии рабочий раствор АЭЭИ предварительно доводят 5М раствором уксусной кислоты до рН 7,8-8,2.

Очищенную вирусную суспензию перед внесением инактиванта нагревают до 36-37^oС и добавляют в нее рабочий раствор АЭЭИ до конечной концентрации 0,1%. Инактивацию проводят в течение 24 часов при 36-37^oС и рН 7,0-7,6 с периодическим перемешиванием (3-5 мин через 5-6 часов). После окончания инактивации суспензию охлаждают до 4-6^oС и берут пробу для проверки на остаточную вирулентность. Для нейтрализации АЭЭИ в суспензию инактивированного и охлажденного вируса добавляют 1 М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ. Сорбирование полученного антигена осуществляют 3% гелем гидроокиси алюминия (ГОА) из расчета 330 см³ на 1000 см³ антигена и в полученную смесь добавляют мертиолят (тиомерсал) из расчета 10 мг на 1000 см³ антигена. После седиментации ГОА в течение 2-3 суток сливают расчетный объем надосадочной жидкости в количестве 330 см³. К полученному адсорбату добавляют 10%-ный водный раствор сапонина из расчета 4,0 см³ на 1000 см³ суспензии. Полученная таким образом вакцина представляет собой суспензию розового цвета. При хранении выпадает рыхлый осадок, легко разбивающийся при встряхивании. Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные флаконы и подвергают контролю на стерильность по ГОСТу 28085-89. Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на лабораторных животных. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на антигенную активность на КРС, морских свинках и кроликах.

Полученная адсорбат-вакицина против ПГ-3 имеет оптимальный компонентный состав, мас.%:
ГОА (3%-ный раствор) - 1,0
АЭЭИ (6%-ный водный раствор) - 0,102
Сапонин (10%-ный водный раствор) - 0,04
Тиомерсал - 0,001
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС с инфекционной активностью не ниже 6,5 lg ТЦД₅₀/см³ - До 100,0
Полученную вакцину применяют в неблагополучных по ПГ-3 КРС хозяйствах для профилактики этого заболевания. Вакцинации подлежат клинически здоровые животные. Телят вакцинируют в возрасте 25-30 суток. Вакцину вводят внутримышечно в области крупа или средней трети шеи двукратно с интервалом 14-20 суток в объеме 5 см³. В организме привитых животных вакцина индуцирует образование гуморального и клеточного иммунитета. Иммунитет формируется через 2 недели после начала вакцинации, после повторной вакцинации иммунитет сохраняется не менее 6 месяцев.

Пример 2
Проведены испытания предлагаемой вакцины против ПГ-3 КРС, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
АЭЭИ (6%-ный водный раствор) - 0,102
Гель ГОА (3%-ный раствор) - 1,0
Сапонин (10%-ный водный раствор) - 0,04
Тиомерсал - 0,001
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС с инфекционной активностью 7,2 lg ТЦД₅₀/см³ - До 100,0
Эффективность сорбированной инактивированной вакцины из штамма "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС, изготовленной так, как описано в примере 1, проверена в хозяйствах Шахунского района Нижегородской области на 58 телятах 30-45-дневного возраста. Вакцину применяли так, как описано в примере 1.

Указанный препарат оказался безвредным, авирулентным и иммуногенным для телят.

Пример 3
Проведены испытания предлагаемой вакцины против ПГ-3 КРС, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
АЭЭИ - 0,102
Гель ГОА (3%-ный раствор) - 1,0
Сапонин (10%-ный водный раствор) - 0,04
Тиомерсал - 0,001
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС с инфекционной активностью 7,0 lg ТЦД₅₀/см³ - До 100,0
Эффективность инактивированной сорбированной вакцины из штамма "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС, изготовленной так, как описано в примере 1, проведена на 200 телятах 20-30-дневного возраста в колхозе им. Крупской Шуйского района Ивановской области. До вакцинации в хозяйстве отмечалось массовое заболевание среди телят 1-3-месячного возраста со следующей клинической картиной: угнетение, ухудшение аппетита, серозные или серозно-гнойные истечения из носа, кашель, пневмонии. Гибель среди заболевшего молодняка достигала ~30%. Вакцину применяли так, как описано в примере 1. Падеж телят в хозяйстве сократился с начала применения вакцины с 27,2 до 7,3%, а болезнь у отдельных животных протекала с более сглаженной клинической картиной.

Таким образом, вакцина против ПГ-3 КРС сорбированная инактивированная является безвредной и способствует профилактике данного заболевания.

Пример 4
Проведены испытания предлагаемой вакцины против ПГ-3 КРС, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
АЭЭИ - 0,102
Гель ГОА (3%-ный раствор) - 1,0
Сапонин (10%-ный водный раствор) - 0,04
Тиомерсал - 0,001
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС с инфекционной активностью 7,5 lg ТЦД₅₀/см³ - До 100,0
Эффективность инактивированной сорбированной вакцины из штамма "ВГНКИ-4" вируса ПГ-3 КРС, изготовленной так, как описано в примере 1, проверена на 1929 телятах в хозяйствах Уренского района Нижегородской области. Вакцину применяли так, как описано в примере 1. Наблюдения за привитыми телятами показали, что испытуемая вакцина является безвредным препаратом, позволившим ликвидировать респираторные болезни молодняка и снизить его гибель.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- инактивированная вакцина против ПГ-3 КРС, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно, в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- при использовании предлагаемой вакцины достигается технический результат, предусмотренный задачей создания изобретения.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации
1. Инфекционные болезни животных. Справочник/ Под ред. Д.Ф.Осидзе. - М.: Агропромиздат, 1987, 19-99.

2. Сюрин В. Н. и др. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998, 242-251.

3. Жестеров В. И. и др. Сероконверсия у животных, привитых инактивированной вакциной против парагриппа-3 КРС // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных. - Мат. межд. научно-практ. конф., посвящ. 40-летию ВНИИВВиМ, 9-10 декабря 1998 г., г. Покров, полиграф. база 1998, 230-231.

4. Иванов И.В. Сравнительная активность вируса парагриппа-3, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13 и МДВК суспензионным и псевдосуспензионным способами // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. - Тез. докл. Всеросс. научно-практ. конф., посвящ. 30-летию ВНИТИБП. - Щелково, 2000, с. 40-41 (прототип).

5. Иванов И.В. Иммуногенность сухой инактивированной вакцины из вируса ПГ-3 "ЗКСМ", репродуцированного в монослое клеток МДВК на микроносителях // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. - Тез. докл. Всеросс. научно-практ. конф. , посвящ. 30-летию ВНИТИБП. - Щелково, 2000, с. 41-43.

6. Миронова Л.А., Преображенская Н.К. и др. Отечественные линии перевиваемых клеток почек теленка - субстрат для биотехнологии // Биотехнология, 1998, 5, 25-31.