Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛИЧИНОК СТРОНГИЛЯТ ЛОШАДЕЙ ТАБУННОГО СОДЕРЖАНИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЯИЦ ПРИ ДЕЙСТВИИ КРИТИЧЕСКИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности ветеринарии и может быть использовано для определение интенсивности инвазии лошадей находящихся в круглогодичном пастбищном содержании, для определения развития и выживаемости яиц стронгилят при критически низких температурах -45°С; -50°С; -55°С, для использования культивированных личинок стронгилят в лабораторных опытах.

Стронгиляты пищеварительного тракта лошадей - геогельминты. Цикл развития разных видов в общих чертах одинаков. В яйцах, выделившихся во внешнюю среду, при температуре 20-25°С за 12-17 часов развиваются личинки 1-й стадии (Л-I), которые (в большинстве случаев) покидают яйцо, растут и дозревают, превращаясь после двух линек в инвазионную стадию (Л-III) примерно за 4-5 суток. При пониженной температуре развитие продолжается несколько недель. Личинки Л-I и Л-II живут, как свободноживущие организмы, питаются органическими субстратами, Л-III - не питаются. Личинки способны мигрировать по листьям, стеблям растений и влажной почве. Дальнейшее развитие их в организме лошадей протекает неодинаково.

Известен способ культивирования личинок стронгилят по методу П.А. Величкина (1967), по этому методу свежие пробы фекалий весом 50 г помещают в чашки Петри, слегка увлажняют, закрывают крышкой и ставят в термостат при температуре 30°С на 7-10 дней. Начиная с 7 дня пробы берут по 5 г навески, заворачивают в марлю и помещают в воронки аппарата Бермана, в воронки заливается теплая вода (до +35°С). Аппарат с пробами фекалий оставляют при комнатной температуре на 2-3 часа. За это время личинки нематод выпадают из пробы на дно воронки или до места перекрытия трубки зажимом, осадок разливают на предметные стекла и микроскопируется.

Имеются данные о способе диагностики стронгилятозов желудочно-кишечного тракта жвачных животных, заключающийся в том, что берут пробу фекалий весом 3-5 г, помещают в стакан, заливают небольшим количеством флотационной жидкости, состоящей из насыщенного раствора натрия хлорида и глицерина в соотношении 2:1, процеживают в чистый стакан, дают взвеси отстояться в течение 15-30 мин, петлей снимают поверхностную пленку (через 15 мин определяют яйца кишечных стронгилят, а через 30 мин - личинок при их наличии), переносят ее на предметное стекло и микроскопируют (патент RU 2007138691, 2014 г.). Однако данные методы культивирования личинок нематод показывают только условную интенсивность стронгилятозной инвазий лошадей в теплое время года.

Технической задачей заявляемого изобретения является определение выживаемости яиц стронгилят и интенсивности выделения из них личинок стронгилят при содержании лошадей в экстремальных условиях Якутии, при критически низких температурах: -45°С; -50°С; -55°С и ниже.

В основу способа изобретения положена задача культивирования и интенсивности выделения личинок стронгилят, определение выживаемости яиц стронгилят при низких -45°С; -50°С; -55°С и ниже температурах, выхода личинок определяет вероятность круглогодичной реинвазии лошадей.

Технический результат изобретения - определение выживаемости яиц в зимний период и выхода из них личинок в лабораторных условиях. Технический результат изобретения достигается следующим образом: определяется интенсивность выделения из яиц инвазионных личинок, который определяет выживаемость яиц при низких -45°С; -50°С; -55°С и ниже температурах, интенсивность инвазии лошадей стронгилятами при круглогодичной тебеневке в условиях Якутии.

До постановки проб фекалий в термостат при флотационном методе исследования проб фекалий по методу Фюллеборна, обнаруживаются яйца стронгилят.

Исследование начинают при температурах воздуха -5°С; -10°С; -15°С; -25°С, опытные пробы фекалий (целыми комками) ставят в холодильник с температурой +8°С на 24 часов, затем переносят при комнатной температуре +22°С на 12 часов, переносят в термостат при температуре +28°С. При температуре наружного воздуха -25°С; -30°С; -35°С, замерзшие пробы фекалий ставят в холодильник с температурой +8°С на 24 часа, затем переносят при комнатной температуре +22°С на 12 часов, переносят в термостат при температуре +28°С. При температуре наружного воздуха -35°С; -40°С; -45°С, замерзшие пробы фекалий (комки) переносят в помещение с постоянной температурой -10°С на 24 часа, переносят в холодильник с температурой +8°С, выдерживают в течение 24 часа, затем переносят при комнатной температуре +22°С на 12 часов, после ставят в термостат при температуре +28°С. При температуре наружного воздуха -45°С; -50°С; -55°С замерзшие пробы фекалий (комки) переносят в помещение с постоянной температурой -15°С на 24 часа, переносят в холодильник с температурой +8°С, выдерживают в течение 24 часа, затем переносят при комнатной температуре +22°С на 24 часов, после ставят в термостат при температуре +28°С.

Гельминтоовоскопия по Фюллеборну. Но диагноз в данном случае ставится как групповой - трихостронгилидозы или стронгилятозы. Это обусловлено тем, что яйца стронгилят сходны и невозможно определить к какому виду, роду и семейству нематод они относятся.

Яйца светло-серые с тонкой гладкой оболочкой, величиной 0,0750,120 × 0,040-0,050 мм, внутри зародыш в виде шаров дробления. Лишь яйца нематодир отличаются своей величиной - 0,160-240 × × 0,075-0,130 мм - и сравнительно легко поддаются определению.

Начиная с 5 дня после постановки в термостат, берут из проб фекалий навески по 5 г, закладывают в воронки Бермана для сбора инвазионных личинок в пробирки объемом 5 мл, который содержит 30 капель объема взвеси личинок - 2,1 мл. Одна капля взвеси личинок соответствует 0,07 мл. После образования в пробирках плотного осадка из личинок надосадочную жидкость осторожно удаляют. Исследуя надосадочную жидкость, определяют выживаемость яиц стронгилят. Живые личинки стронгилят находятся в движении или в искривленном, скрученном состоянии, что существенно затрудняет изучение их морфологии и оценку размеров. Поэтому был необходим способ обездвиживания личинок, который фиксирует их в прямом состоянии, не разрушая их морфологию и не осветляя, что позволяет осуществить исследования и возможность использования культивированных личинок для дифференциальной диагностики вида гельминта. Для обездвиживания живых личинок в 2,1 мл взвеси личинок добавляют 0,7 мл раствора Мелисептол рапид (содержащий в 100 грамме раствора - пропанол 50 грамм, дидецилдиметиламмониум хлорид - 0,075 грамм, неионные сурфактанты, отдушки).

Для определения интенсивности инвазии и подсчета личинок пробирки тщательно перемешивают, берут одну каплю - 0,07 мл взвеси, наносят на предметное стекло и под малым и большим увеличением микроскопа подсчитывают количество выделенных личинок. Данные по подсчету личинок используются как показатели условной интенсивности стронгилятозной инвазий табунных лошадей при круглогодичном пастбищном содержании в условиях критически низких температур Якутии. Постановка точного прижизненного диагноза стронгилятозной инвазии лошадей, определения выращенных инвазионных личинокдо вида, применение культивированных личинок для проведения лабораторных опытов.