Штамм бактерий Bacillus toyonensis ВКПМ В-13249, обладающий выраженным антагонизмом по отношению к микроорганизмам Escherichia coli, Candida albicans, Staphylococcus aureus, St. epidermidis, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии в частности к созданию нового штамма, оказывающего антагонистическое влияние на условно-патогенные и патогенные микроорганизмы. Непатогенные бактерии p. Bacillus с выраженными противомикробными свойствами активно используются в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве и других отраслях народного хозяйства [1, 2, 3]. Однако для того, чтобы бактериальные препараты длительное время сохраняли свою активность и конкурентоспособность, необходимо производить постоянную ротацию штаммов [4, 5]. В связи с этим селекция новых бактериальных штаммов с целью получения активных противомикробных агентов актуальна и в настоящее время.

Бактерии вида В. toyonensis согласно санитарно-эпидемиологическим правилам СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» [6] не относятся к патогенным для человека микроорганизмам. До заявленного штамма Bacillus toyonensis 15 ни один штамм этих бацилл не был задепонирован в ВКПМ (Всероссийской коллекции промышленных организмов), хотя за рубежом давно известны антагонистические и пробиотические свойства данного вида бактерий [7, 8, 9, 10].

Из представителей рода Bacillus схожей с заявленным штаммом антагонистической активностью по отношению к энтеропатогенным бактериям обладает штамм Bacillus subtilis В-2895 [11].

Недостатком этого штамма является то, что он обладает узким спектром противомикробной активности и к тому же давно был выделен из природной среды, поэтому в искусственных «лабораторных» условиях мог снизить свою эффективность.

Задачей изобретения является получение штамма Bacillus toyonensis, обладающего широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным, условно-патогенным микроорганизмам и дрожжеподобным грибкам, таким как Escherichia coli, Candida albicans, Staphylococcus aureus, St. epidermidis, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa.

Задача решается выделением нового штамма Bacillus toyonensis 15 (В13249) из ризосферы растений p. Helianthus.

Технический результат, получаемый от использования нового штамма, заключается в повышении эффективности уже существующих биологических препаратов или разработке новых с высоким противомикробным эффектом за счет включения в их состав заявленного штамма.

Описание изобретения

1. Видовое название штамма и его происхождение

Предлагаемый штамм бактерий Bacillus toyonensis 15 выделен из ризосферы р. Helianthus в Алтайском крае, Павловском районе, в окрестностях п. Новые Зори, осенью 2017 года. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, находящейся по адресу: Россия, Москва, 117545, 1-ый Дорожный проезд, 1. Коллекционный номер ВКПМ В13249.

2. Генетическая характеристика представленного штамма

При секвенировании вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:

Первичный скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus.

Результаты обработки секвенсов при помощи компьютерной программы находящейся на сайте RDB II (Ribosomal Database Project II), предназначенной для определения родства микроорганизмов и построения филогенетических деревьев, представляются в графическом виде.

S002289583 0.999 0.978 1465 Bacillus cereus (Т); АТСС 14579; AEO16877

S004061999 1.000 0.996 1465 Bacillus toyonensis (Т); ВСТ-7112; СР006863

S000979524 1.000 0.983 1408 Bacillus thuringiensis (Т); IAM 12077; D16281

При проведении реакции ПЦР были использованы следующие праймеры.

Праймеры, специфичные для Bacillus thuringiensis

BTf atcggtgatacagataagact

BTr ccttcatacgtatgaatattattt

Праймеры, специфичные для Bacillus cereus

BCf attggtgacaccgateaaaca

BCr tcatacgtatggatgttattc

Праймеры, специфичные для Bacillus anthracis

BAf aatcgtaatattaaactgacg

BAr cctteatacgtgtgaatgttg

Отсутствие фрагментов при использовании праймеров BTf и BTr; BAf и BAr, BCf и ВСг позволяет отнести исследуемый штамм к виду Bacillus toyonensis.

3. Микроскопические и морфолого-культуральные признаки штамма бактерий

Морфология клеток заявленного штамма: небольшие прямые палочки (около 1 мкм) с закругленными концами, чаще расположены одиночно или парами, реже - цепочками. Отмечается спорообразование по бациллярному типу.

Для штамма Bacillus toyonensis 15 характерны колонии мутно-бежевого цвета на МПА, с максимальным диаметром 0,9-1,1 см, блестящие, приподнятые, с неровным краем. На L-твердой среде: колонии грязно-белого цвета, 1,0-1,2 см, блестящие, приподнятые, с неровным краем.

4. Физиолого-биохимические признаки заявленного штамма

Для штамма Bacillus toyonensis 15 установлена: положительная окраска по Граму и отрицательная реакция Грегерсена, положительная реакция на каталазу и отрицательная - на лецитиназу, а также подвижность, способность к спорообразованию и рост исключительно в аэробных условиях.

5. Способ, условия и состав сред для размножения и ферментации штамма

Заявленный штамм микроорганизма культивируется 24 ч при 37°С в шейкер-инкубаторе на L-бульоне (г/л): дрожжевой экстракт - 5,0, пептон - 15,0, NaCl - 5,0, вода дистиллированная - 1,0 л. Для приготовления твердой среды необходимо добавить к указанным выше ингредиентам 15,0 г/л агара.

Состав ферментационной питательной среды (г/л): меласса - 25, кукурузный экстракт - 12,5, дрожжевой экстракт - 1, триптон - 0,5, MgSO4 - 0,25, MnSO4 - 0,03, CoCl2 - 0,046, CaCl2 - 1, солевой сток - 10 мкл, лапрол - 2, вода водопроводная - 1 л. Начальное рН - 7,0, аэрация - 300 л/ч, постоянное перемешивание 250 оборотов в минуту, время - 20-24 ч.

6. Антибиотикорезистентность штамма

Штамм Bacillus toyonensis 15 чувствителен к: цефалексину, олеандомицину, энрофлоксацину и мономицину. Устойчив к бензилпеницилину и оксациллину.

7. Антагонистическая активность представленного штамма

Антагонистическая активность штамма Bacillus toyonensis 15 была зафиксирована в отношении Escherichia coli, Candida albicans, Staphylococcus aureus, St. epidermidis, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Выделение штамма Bacillus toyonensis 15.

Штамм Bacillus toyonensis 15 был получен из ризосферы p. Helianthus. В общем виде этапы выделения бактерий p. Bacillus представлены на фиг. 1. О патогенности/непатогенности выделенного штамма судят по реакции на лецитиназу (для непатогенных представителей p. Bacillus она отрицательна).

Для определения видовой принадлежности выделенного штамма была произведена молекулярно-генетическая идентификация.

Пример 2. Определение антагонистической активности штамма Bacillus toyonensis 15.

Антагонистическое действие штаммов Bacillus toyonensis 15 и Bacillus subtilis В-2895 проверялось в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Для этого применялся один из методов отсроченного антагонизма - перпендикулярных штрихов. В качестве тест-культур использовали: Е. coli, St. aureus, St. epidermidis, S. typhimurium, S. abony, Sh. sonnei, Ps. aeruginosa, C. albicans.

Штаммы-антагонисты высевали штрихами на чашки с L-твердой средой и культивировали при 37°С в течение 48 часов, после этого к выросшим штрихам перпендикулярно подсевали культуры патогенных тест-штаммов. Высевы бактерий выдерживали в течение 24 часов при температуре 37°С, дрожжеподобных грибов - при температуре 28°С 5 суток. Положительный результат по определению антимикробной активности исследуемых бактерий учитывали по наличию лизиса патогенов в зоне диффузии выделяемых ими в среду роста водорастворимых метаболитов (табл. 1).

Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что заявленный штамм Bacillus toyonensis 15 обладает более широким спектром антагонистического действия по сравнению со штаммов Bacillus subtilis В-2895.

Помимо этого, антагонистическую активность бацилл в отношении Е. coli проверяли также другим диффузионным методом - агаровых блоков. Для этого культуры штаммов-антагонистов высевали поверхностным газоном на твердой L-среде и инкубировали при температуре 37°С в течение 24 ч для образования и накопления в агаре ингибиторных соединений. Затем стерильным пробочным сверлом вырезали агаровые блоки с выросших культур бацилл и устанавливали их в чашки Петри на поверхности агаровой среды, только что глубинно засеянные культурой тест-штамма. Чашки выдерживали в течение суток в холодильнике (во избежание преждевременного роста тест-штамма) для диффузии ингибиторных соединений из блоков в толщу агара с тест-штаммом, а затем инкубировали в течение 24 ч при температуре 37°С. О степени антагонистической активности испытуемых бактерий судили по величине зоны ингибирования роста тест-штамма вокруг агарового блока (табл. 2).

Согласно данным, приведенным в таблице 2, видно, что заявленный штамм Bacillus toyonensis 15 обладает большей антагонистической активностью по отношению Е. coli в сравнении со штаммов Bacillus subtilis В-2895.

Пример 3. Изучение резистентности к антибиотикам штамма Bacillus toyonensis 15.

Антибиотикорезистентность заявленного штамма определяли диско-диффузионным методом на твердой L-среде. Для этого на поверхность агара сплошным газоном рассевали культуру бацилл. На среду помещали диски с различными антибиотиками. Учет проводили по зонам отсутствия или подавления роста бактерий вокруг дисков с антибиотиками (табл. 3).

Чувствительность к антибиотикам штамма Bacillus toyonensis 15 является одним из показателей его безопасности, ведь в таком случае он не сможет передавать гены антибиотикорезистентности патогенным бактериям.

Литература

1. Jeong J.S., Kim I.H. Effect of Bacillus subtilis C-3102 spores as a probiotic feed supplement on growth performance, noxious gas emission, and intestinal microflora in broilers // Poult. Sci. - 2014. - Vol. 93. - Is. 12. - P. 3097-3103.

2. Beric Т., Kojic M., Stancovic S., Topisirovic L. Antimicrobial Activity of Bacillus sp. Natural isolates and their potential use in the biocontrol of phytopathogenic bacteria // Food Technology and Biotechnology, 2012. Vol. 50. - P. 25-31.

3. Poulsen A.R., Jonge N., Nielsen J.L., Hojberg O., Lauridsen C., Cutting S.M., Canibe N. Impact of Bacillus spp. spores and gentamicin on the gastrointestinal microbiota of suckling and newly weaned piglet // PLoS One, 2018. - Vol. 13. - Is. 11. - e0207382. doi: 10.1371/journal.pone.0207382.

4. Евстигнеева Т.Н., Кудрявцева T.A. Селекция промышленных штаммов микроорганизмов. - СПб.: Университет ИТМО, 2017. - 59 с.

5. Иркитова А.Н., Гребенщикова А.В., Мацюра А.В. Антагонистическая активность штаммов Bacillus subtilis, выделенных из различных источников // Ukrainian Journal of Ecology, 2018, - Vol. 8. - Is. 2. - P. 354-364. doi: 10.15421/2018_354

6. СП 1.3.2322-08 Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней, с изменениями на 29 июня 2011 года.

7. Kantas D., Papatsiros V.G., Tassis P.D., Giavasis I., Bouki P, Tzika E.D. A feed additive containing Bacillus toyonensis (Toyocerin(®)) protects against enteric pathogens in postweaning piglets // Journal of Applied Microbiology, 2015. - №118(3). - P. 727-738. doi: 10.1111/jam.12729.

8. Santos F.D.S., Menegon Y.A., Piraine R.E.A., Rodrigues P.R.C., Cunha R.C. Leivas Leite F.P. Bacillus toyonensis improves immune response in the mice vaccinated with recombinant antigen of bovine herpesvirus type 5 // Beneficial Microbes, 2017. - №9(1). - P. 133-142. doi: 10.3920/BM2017.0021.

9. Roos T.B., de Moraes С.М., Sturbelle R.T., Dummer L.A., Fischer G., Leite F.P.L. Probiotics Bacillus toyonensis and Saccharomyces boulardii improve the vaccine immune response to Bovine herpesvirus type 5 in Sheep // Research in Veterinary Science, 2018. - №117. - P. 260-265. doi: 10.1016/j.rvsc.2017.12.022.

10. Choudhury P., Jawed A., Saha P. Optimization of phytostimulatory potential in Bacillus toyonensis isolated from tea plant rhizosphere soil of Nilgiri Hills, India // International Journal of Engineering Science Invention, 2017. - Vol. 6. - Is. 11. - P. 13-18.

11. Забокрицкий H.А. Фармако-микробиологические аспекты разработки, конструирования и создания экспериментального образца биогепатопротектора // Здоровье и образование в XXI веке, 2014. - Т. 16. - № 3. - С. 81-85.