Результат интеллектуальной деятельности: Способ замещения костных дефектов челюстей

Изобретение относится к медицине, к области биотехнологии и может быть использовано с целью восполнения костных послеоперационных дефектов челюстей.

На сегодняшний день существует значительное количество способов замещения дефектов челюстей.

Из уровня техники известен способ замещения дефектов костей путем пластики с использованием аутогенного костно-хрящевого регенерата, выраженного с помощью деминерализованной костной аллоткани, отличающийся тем, что деминерализованную костную аллоткань подсаживают на фасцию или надкостницу, которые рассекают или перфорируют в нескольких местах соответственно зоне расположения деминерализованного трансплантата, выращенный аутогенный костно-хрящевой регенерат используют для замещения костных дефектов отдельно или же в комбинации с деминерализованными или недеминерализованными костными аллотрансплантатами (Патент РФ 2117453 от 20.08.2008). Известен способ замещения костных дефектов путем помещения имплантата из пористого никелида титана или сплавов на его основе в зону костного дефекта, отличающийся тем, что перед введением имплантат обрабатывают гидроксилапатитом на глубину 10 мм при комнатной температуре, причем при установке имплантата в конгруентное костное ложе последнее обрабатывают гидроксилапатитом (Патент РФ №2066982 от 27.09.1996 г.). Известен способ замещения костных дефектов челюстей, заключающийся в проведении хирургической обработки костного дефекта, деэпителизации разреза, наложении пленки «Диплен» с введенной в нее композиционной структурой, состоящей из 60 масс. % гидроксиапатита и 40 масс. % бета-трикальцийфосфата, на всю область костного дефекта, а также на его вестибулярную, внутриротовую, апроксимальные поверхности, при этом пленка должна перекрывать область костного дефекта на 3 мм по всему периметру (Патент РФ 2276587 от 20.05.2006).

К основным недостаткам указанных способов можно отнести использование остеокондуктивных синтетических или аллогенных остеонидуктивных материалов несоответствующих антигенной структурой индивидуальному организму. В настоящее время данный недостаток нивелируется использованием мезенхимальных стволовых клеток.

Выявлено, что мезенхимальные стволовые клетки обладают иммуномодулирующим эффектом, ингибируют пролиферацию Т-клеток и снижают вероятность возникновения и степень выраженности РТПХ при совместной трансплантации с гемопоэтическими стволовыми клетками. При этом они существенно ускоряют восстановление поврежденного гемопоэза. Полученные данные о том, что мезенхимальные стволовые клетки не содержат мембранных маркеров, характерных для гемопоэтических клеток, а также антигенов гистосовместимости позволяют рассматривать мезенхимальные стволовые клетки как кандидаты не только для аутологичной, но и для аллогенной клеточной терапии.

Результатом трансплантации больным мезенхимальных стволовых клеток костного мозга может быть восстановление популяции стромальных клеток в различных органах. Стромальные клетки являются источником важных цитокинов и ростовых факторов, которые способствуют активированию и нормализации иммунного ответа, сниженного в результате болезни, а также развитию регенеративных процессов в поврежденных тканях и органах.

Известен способ пролиферации мезенхимальных стволовых клеток человека, предназначенных для реконструкции костных и хрящевых сегментов, например, в травматологической хирургии. В соответствии с этим патентом образец костного мозга человека промывают в физиологическом растворе с фосфатным буфером. Клетки с ядрами подсчитывают с использованием красителя и в среде F12, включающей 10% сыворотки и 1 нг/мг FGF -2, высевают на дно культурального сосуда в количестве 5×106 клеток в виде нефракционированного костного мозга на 10 кв.см сосуда для культуры ткани. Через 48 часов эту среду удаляют, клетки промывают в физиологическом растворе с фосфатным буфером и выдерживают 24-48 часов в среде F12 без каких-либо добавок. Для поддержания остеохондрогенного потенциала в мезенхимальных стволовых клетках и способствования пролиферации клеток в среду добавляют определенную смесь факторов (Патент РФ 2272839 от 27.03.2006).

Известен способ культивирования фибробластов для заместительной терапии, включающий выделение клеток и инкубирование в питательной среде, отличающийся тем, что выделение фибробластов осуществляют из биоптатов кожи человека путем ферментативной обработки в растворе DMEM/5% ЭБС/0,2% диспазы/0.1 мг/мл коллагеназы I типа при постоянном помешивании и пипетировании при температуре 37°С в течение 1,5 ч в стерильных условиях, полученную суспензию клеток центрифугируют 5 мин при 200 g, супернатант сливают, осевшие клетки ресуспендируют в среде DMEM/10% ЭБС/100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 100 ед/мл фунгизона и высевают на чашки, затем фибробласты переводят на длительное культивирование в среде с собственной сывороткой крови пациента: DMEM/10% ССКП/100 ед/мл стрептомицина, 100 ед/мл фунгизона или в терапевтической среде AIM-V, перед введением пациентам клетки несколько раз отмывают в буфере Krebs-Ring, обрабатывают раствором 0,25% трипсина/0,02% ЭДТА для снятия клеток с подложки, добавляют 1 мл Krebs-Ringer, центрифугируют 5 мин при 200 g, супернатант сливают, клетки ресуспендируют в новой порции раствора Krebs-Ringer для введения пациентам (Патент РФ 2320720 от 27.03.2008).

Известен способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека ex vivo включает по меньшей мере два цикла культивирования ядросодержащих костномозговых клеток в ростовой среде до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток. В процессе каждого цикла высевают выделенные клетки в соответствующий культуральный сосуд, регулярно определяют рН ростовой среды и заменяют ростовую среду, рН которой менее 6,0 или более 8,0, на ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0, при этом регулярно элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток. Процесс культивирования в каждом цикле ведут до образования сплошного монослоя популяции МСК, который извлекают из культурального сосуда путем его обработки 0,03-0,1%-ным раствором трипсина, а перед и после указанной обработки МСК отмывают в изотоническом растворе от следов ростовой среды и следов трипсина соответственно. Изобретение позволяет за достаточно короткий период (приблизительно 40 суток) вырастить из 0,5-1,0 мл пунктата костного мозга эффективную терапевтическую дозу МСК (по меньшей мере 5⋅107-108) (Патент РФ 2323252 27.04.2008).

Задачей изобретения является ускорение процесса регенерации костной ткани в послеоперационных дефектах челюстей.

Техническим результатом изобретения является восстановление архитектоники челюсти путем стимулирования регенерации костной ткани индивидуальными остеоиндуктивными и синтетическими остеокондуктивными средствами.

Технический результат достигается за счет того, что способ замещения костных дефектов челюстей заключается в проведении под инфильтрационной местной анестезией забора фрагмента десны размером два на два миллиметра у пациента с планируемым послеоперационным дефектом челюсти, культивировании из полученной ткани мезинхимальных стволовых клеток, имбибировании указанными клетками остеопластическим материалом Bio-oss до полного насыщения, проведении операции пациенту, адекватной установленному диагнозу, с формированием разреза и костного дефекта, внесении в интраоперационный дефект полученной композиции объемом соответствующего 80% от объема костного дефекта, перекрытии на 3 мм по периметру костного дефекта коллагеновой мембраной, наложении швов.

Выделение мезенхимальных стволовых клеток из слизистой оболочки щеки обеспечивает индивидуализацию остеоиндукции замещения дефекта челюсти.

Использование в процессе остеокондуктивного остеопластического материала Bio-oss обеспечивает восстановление архитектоники челюсти осуществляя профилактику патологических переломов, а перекрытие в процессе операции периметра дефекта коллагеновой мембраной, профилактику образования втянутых рубцов слизистой прикрепленной десны и выпадении остеопластической композиции в подслизистое пространство. В предлагаемом композиционном материале, в отличие от известных ранее, применяется препарат Bio oss, органического происхождения в котором из базового вещества - гидроксиапатита вымыт ранее считавшийся незаменимым и наиболее активным компонентом бета три кальций фосфат.

Пример применения способа замещения костных дефектов челюстей:

У пациента под инфильтрационной анестезией хирургическим скальпелем осуществляется забор поверхностного слоя слизистой оболочки прикрепленной десны. Полученный фрагмент помещается в 0,05% раствор коллагеназы 2-го типа на 16 часов в термостат при +37°С, с дальнейшим проведением пипетирования осадка и добавления полной питательной среды, состоящей из DMEM/F12 (Invitrogen, США), содержащей 10% телячью фетальную сыворотку («HyCloneDefined», HyClone, США), инсулин 0,4 мкМ, 0,25 мг/л гентамицина.

Культивирование мезенхимальных стволовых клеток (МСК) осуществляется в стандартных условиях в СO2-инкубаторе с концентрацией СO2 5%, атмосферного воздуха 95% и с повышенной влажностью. Замену культуральной среды на свежую осуществляется каждые 72 часа. Пассирование клеток осуществляли следующим образом: после образования субконфлюэнтногомонослоя (80-90%о площади культурального пластика) клетки однократно отмывают раствором Версена, затем снимают с помощью раствора Версена с 0,25% трипсином, центрифугируют при 350g, убирают надосадок, осадок ресуспендируют в полной питательной среде и разливали в новую культуральную посуду. Стандартизованную дифференцировку МСК КМ осуществляли в соответствии с протоколами STEMPRO® MSC SFM; StemPro® AdipogenesisDifferentiationKit; StemPro® ChondrogenesisDifferentiationKit; StemPro® OsteogenesisDifferentiationKit. Иммунофенотипирование осуществляли на проточномцитофлуориметре Gallios (БекманКультер, США). Анализ проводили при помощи ПО AN43172 SoftwareVersion.

Далее гранулы остеопластического материала Bio-oss (Щвецария) были приведены к приблизительно одному размеру и форме - гранулы 150-400 мкм, путем стерильного измельчения при температуре жидкого азота, после чего их отмывали 3 раза в забуференном физиологическом растворе (PBS) следующим образом:

- гранулы были разложены в одинаковом количестве в стерильные пробирки объемом 2 мл в 4 повторах;

- в каждую пробирку вводили 2 мл PBS и встряхивали на лабораторном шейкере (shaker) 60 сек., после чего давали материалу осесть и супернатант удаляли отсасыванием.

В применяемом композиционном материале, для усиления адгезивных и пролиферативных свойств применяется материал Bio oss, который после стерильного измельчения при температуре жидкого азота и трехкратного отмыва забуферным физиологическим раствором, подвергается циклической тепловой обработке в термостате при температуре от 70 до 90 градусов Цельсия, три раза по 90 минут

К отмытому материалу добавили 1 мл питательной среды и помещали на 24 часа в СO₂-инкубатор, к не промытому материалу также добавили среду на 24 часа для проверки стерильности.

Для проведения скрининга остеопластических материалов при исследовании пролиферационной активности применяли перевиваемую линию фибробластов 3T3/NIH, которая входит в список рекомендованых ГОСТ Р ИСО 10993.5-99.

В результате серии экспериментов in vitro нами доказано что, отмыв всех прочих остеопластических материалов, ухудшают адгезивные и пролиферативные свойства.

Считая, что поверхность гранул с контролем (50 мкл суспезии Цитодекс №3) составляет 8 см², была рассчитана посевная концентрация клеток линии 3Т3, которая составила 30% от 100% монослоя. Конечный объем среды после засева составил 1,5 мл на диаметр раневой поверхности 10 мм Изменение количества применяемого для лечения клеток в ту или другую сторону даже на 3 процента приводит к ингибирующему эффекту и останавливает как адгезию, так и рост и размножение клеток.

Пробирки с образцами материалов с клетками помещали в программируемый ротатор RM-1 (Elmi), скорость вращения 2 об/мин.

Культивирование продолжали в ротаторе, помещенном в термостат, в течение 96 часов при 37°С.

Следует отметить что в существующей лечебной практике дефекты с раневой поверхностью 5 мм и более полностью не восстанавливаются. В нашем случае при применении композиционного материала получено восстановление дефекта с раневой поверхностью диаметром 10 мм Пациенту проводили операцию на челюсти с формированием костного дефекта. Полученную композицию остеоконуктивного материала имбибированного МСК вводили в образованный костный дефект в объеме, составляющем 80% от общего объема дефекта. Края дефекта перекрывали коллагеновой мембраной по периметру, перекрывая 3 мм собственной костной ткани. Рану ушивали наглухо узловыми швами.

Таким образом, благодаря полученному с учетом требований к композиционному материалу, впервые в мире удалось получить эффект полноценного (100%) заживления дефекта костной ткани челюсти диаметром более 5 мм и восстановление оптической плотности кости в срок на 3 месяца раньше по сравнению с естественным течением репаративного процесса (6 месяцев). В случае естественного репаративного процесса помимо длительных сроков заживления, заполнение дефекта осуществляется в объеме не более 70 процентов, что наряду с несостоятельностью костной ткани в месте дефекта является основной причиной осложнений при последующей иплантации (протезирования). Ниже приведены данные по плотности кости в единицах Хаунсфилда

Срок 3 месяца, плотность кости при использовании композиционного материла с мезенхимальными стволовыми клетками из десны составляет (761.45. HU) по сравнению с контролем (566.23).в то время как плотность кости на 6 месяце составляет (851.21. HU). Сокращение сроков восстановления костной ткани крайне существенно, поскольку позволяет вдвое сократить срок перевода пациентов на полноценное питание и осуществить полноценное протезирование, в том числе установку дентальных имплантатов в восстановленную костную ткань.