Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ АНАПЛАЗМ "ANAPLASMA SPECIOSUS OMSK" НОВОГО ГЕНОТИПА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ АНАПЛАЗМ И ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм "Anaplasma speciosus Omsk" является первым представителем анаплазм данного генотипа. На основании изучения фенотипических и генотипических признаков штамм отнесен к порядку Rickettsiales семейству Anaplasmatacea роду Anaplasma. По результатам изучения и сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК имеет 99,7% гомологии с Anaplasma marginale и Anaplasma centrale. Штамм “Anaplasma speciosus Omsk” культивируется в культуре клеток Vero.

Штамм “Anaplasma speciosus Omsk" выделен в 2004 году из селезенки коровы с клиническими проявлениями анаплазмоза в Большереченском районе Омской области.

Штамм нового генотипа "Anaplasma speciosus Omsk" хранится во Всероссийском музее риккетсиозных культур ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН под инвентарным номером 138 от 19 сентября 2005 г.

Задача изобретения - оригинальный штамм "Anaplasma speciosus Omsk" нового генотипа анаплазм.

Технический результат - использование первого выделенного в России штамма возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота - "Anaplasma speciosus Omsk", отнесенного по филогенетическим критериям к новому генотипу рода Anaplasma, меняет представление о популяции анаплазм, циркулирующих в Евразии.

Гипериммунная сыворотка, полученная с использованием изученного штамма, строго специфична к антигену, против которого она получена, и демонстрирует в реакции непрямой иммунофлюоресценции высокий уровень антител (1:160), что позволяет оценивать данный штамм как кандидат для разработки диагностических препаратов.

Это обусловливает необходимость изменения методических подходов к диагностике анаплазмозов и мониторингу анаплазм.

Выделенный штамм "Anaplasma speciosus Omsk" нового генотипа характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Типичны для анаплазм. В окрашенных по Романовскому - Гимзе мазках из периферической крови от больного животного анаплазмы обнаруживаются в виде одного-двух, реже трех в одном эритроците розовато-фиолетовых точкоподобных включений округлой или овальной формы. Расположение в эритроците преимущественно периферическое, иногда эксцентричное. Грамотрицательны.

Культуральные свойства. Успешно пассируются в культуре клеток Vero с накоплением от единичных до 90 микробных тел в поле зрения.

Пассажная характеристика. Культура штамма "Anaplasma speciosus Omsk" лиофильно высушена на 7 пассаже в культуре клеток Vero.

Антигенные свойства. Антигенные детерминанты выявляются методом непрямой флюоресценции с гомологичной кроличьей иммунной сывороткой к штамму.

Вирулентные свойства. Оказывает цитопатическое действие в культуре клеток Vero. Вызывает клинические проявления анаплазмоза у сельскохозяйственных (коровы) и экспериментальных лабораторных животных (кролики, белые мыши), зараженных штаммом.

Генотипические характеристики. Получена последовательность нуклеотидов гена 16S рРНК длиной 613 п.о. (номер в GenBank AY649325):

ttaacacatg caagtcgaac ggaccataca cgcagcttgc tgcgtgtatg gttagtggca gacgggtgag taatgcatag gaatctacct agtagtatgg gatagccact agaaatggtg ggtaatactg tataatccct gcgggggaaaa gatttatcgc tattagatga gcctatgtca gattagctag ttggtggggt aatggcctac caaggcggtg atctgtagct ggtctgagag gatgatcagc cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggcgc aagcctgatc cagctatgcc gcgtgagtga ggaaggcctt agggttgtaa aactctttca gtagggaaga taatgacggt acctacagaa gaagtcccgg caaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggggca agcgttgttc ggaattattg ggcgtaaagg gcatgtaggc ggtttggtaa gttaaaggtg aaataccagg gcttaaccct ggggctgctt ttaatactgc aggactagag tccggaagag gatagcggaa ttcctagtgt agaggtgaaa ttc.

При идентификации в Genbank приведенная последовательность нуклеотидов является уникальной. На основании филогенетических данных штамм "Anaplasma speciosus Omsk" является наиболее близким к Anaplasma marginale и Anaplasma centrale (степень гомологии 99,7%).

На основании морфологических, антигенных и генетических признаков изолированный штамм относят к роду Anaplasma, новому генотипу “Anaplasma speciosus Omsk".

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Идентификация на основании генотипических признаков.

Экстракция ДНК.

Экстракцию ДНК из пробы культур клеток осуществляют с использованием набора «Проба НК» (ДНК-технология, Москва) в соответствии с протоколом фирмы-производителя.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенс-реакция.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и секвенс-реакцию выполняют, применяя родоспецифичные праймеры из области гена 16S рРНК Ehrl (5'-gaacgaacgctggcggcaagc-3') и Ehr2 (5'-agta(t/c)cg(a/g)accagatagccgc-3').

Реакционная смесь для каждой пробы содержит 0,3 pmol каждого праймера, 1 единица Tag-полимеразы, 0,2 mM каждого дезоксинуклеотида, 2 mM MgCl₂ и 2 мкл ДНК от каждой пробы, финальный объем составляет 100 мкл. Амплификацию выполняют по следующей программе: 3 минуты инициальной денатурации при температуре 94°С, в последующих 35 циклах 1 минута денатурации при температуре 94°С, 1 минута отжиг праймеров при температуре 57°С, элонгация в течение 1,5 минуты при температуре 72°С и 5 минут финальная элонгация при температуре 72°С. Каждая постановка включает отрицательный и положительный контроль.

Пурификацию ПЦР-продукта проводят с использованием GFX колонок («Amersham Biosciences", США). Нуклеотидные последовательности определены в Центре секвенирования ДНК СО РАН, г.Новосибирск.

Пример 2. Идентификация на основании фенотипических (культуральных и антигенных) свойств.

Культивирование анаплазм.

Монослой культуры клеток Vero во флаконе заражают 10% суспензией, которая была получена из селезенки коровы с клиническими проявлениями анаплазмоза, в дозе 0,5 мл на флакон. Флаконы с зараженными клетками центрифугируют при 8000 об/мин при температуре 22°С в течение 30 минут. После центрифугирования во все флаконы добавляют среду поддержки (Игла MEM с добавлением 1% эмбриональной сыворотки) в объеме 1,5 мл на флакон. Флаконы с зараженными клетками культивируют в углекислотном термостате при температуре 35,6°С в течение 8 суток. После завершения инкубации все флаконы подвергают замораживанию в низкотемпературном холодильнике при температуре -20°С, затем размораживают для разрушения клеток и максимального выхода из них микроорганизмов. Наличие анаплазм, так же как и стерильность культуры клеток, определяют в мазках, окрашенных по методу Романовского-Гимзе.

Изучение антигенных свойств.

Получение гипериммунной сыворотки.

В качестве антигена для гипериммунизации используют 8-суточную культуру штамма "Anaplasma speciosus Omsk”, полученную на культуре клеток Vero. Для максимального выхода анаплазм из клеток применяют метод попеременного замораживания (при температуре -20°С в течение 30 минут) и размораживания при комнатной температуре. После оттаивания клеточную взвесь центрифугируют при 3000 g в течение 15 минут. Для дальнейшей работы используют супернатант, который центрифугируют при 6000 g в течение 1 часа. Полученный осадок трижды отмывают стерильным физиологическим раствором, центрифугируя в том же режиме, и доводят до концентрации 1,7×10⁹ микробных тел в 1 мл по ОСМ ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Гипериммунизацию проводят на кроликах. Титры антител учитывают на 7, 14, 22 и 30 сутки после введения антигена.

Получение корпускулярного антигена.

После завершения культивирования в течение 8 суток зараженную штаммом "Anaplasma speciosus Omsk” культуру клеток Vero замораживают и размораживают, как описано ранее. Материал центрифугируют 15 минут при 3000 оборотах в минуту. Супернатант доводят до концентрации 1 млрд микробных тел в 1 мл, инактивируют в водяной бане 30 минут при температуре 70°С и используют для нанесения в качестве корпускулярного антигена на стекла. Полученный корпускулярный антиген применяют в реакции непрямой иммунофлюоресценции и других серологических реакциях для выявления антител к анаплазмам данного генотипа.

Таким образом, на основании приведенных выше примеров показана возможность применения штамма “Anaplasma speciosus Omsk" для идентификации анаплазм на основании генотипических (пример № 1) и фенотипических (пример № 2) признаков и получения диагностических препаратов.