Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ ВОДЫ ОТ ТРИНИТРОТОЛУОЛА

Изобретение относится к области биологической обработки воды и может быть использовано для очистки природных и промышленных сточных вод, загрязненных преимущественно нитроароматическими ксенобиотиками.

Получение продуктов химического синтеза и их использование в различных сферах человеческой деятельности сопровождаются загрязнением почвы, поверхностных и грунтовых вод экологически опасными соединениями, в частности 2,4,6-тринитротолуолом (далее по тексту ТНТ) и его производными. Известны различные способы очистки ТНТ-загрязненных объектов. При этом процессы очистки с использованием микроорганизмов являются более экономичными и экологичными.

Известен способ [1] трансформации ТНТ свободными и иммобилизованными клетками Arthrobacter sp. 8929.

Недостатком способа [1] является то, что при его осуществлении в очищаемой среде происходит накопление 2-амино-4,6-динитротолуола (2-АДНТ), 4-амино-2,6-динитротолуола (4-АДНТ) и 2,4-диамино-6-нитротолуола (2,4-ДАНТ), в дальнейшем не разрушаемых клетками Arthrobacter sp. 8929. К тому же, потенциал трансформации ТНТ по способу [1] существенно ограничен по допустимой концентрации ксенобиотика и не превышает 60 мг/л, тогда как на практике сточные воды содержат гораздо более высокие концентрации ТНТ. Все это ограничивает возможность применения известного способа [1] в природоохранной деятельности.

Известен способ [2] удаления ТНТ из загрязненных вод иммобилизованными клетками Phanerochaete chrysosporium ATCC 24725 при различных условиях культивирования.

Недостатком способа [2] является то, что удаление ТНТ не сопровождается его (ТНТ) разрушением (деструкцией, деградацией). В результате осуществления способа [2] образуются не идентифицированные метаболиты, которые в дальнейшем не подвергаются глубокой деструкции клетками штамма Ph. chrysosporium ATCC 24725 и накапливаются, что ограничивает применение известного способа в промышленных масштабах.

Известен способ [3] трансформации ТНТ иммобилизованными на фильтрах клетками сообщества микроорганизмов. Способ осуществляют путем последовательного двухэтапного процесса очистки в анаэробных и аэробных условиях.

Недостатком способа [3] является замедленность процесса биоочистки. Так, для адаптации сообщества микроорганизмов к ТНТ требуется 8 суток при начальной концентрации исходного ксенобиотика 5 мг/л, а общая продолжительность (время) процесса занимает 150 суток. К тому же, в ходе трансформации ТНТ образуются такие метаболиты, как 2-АДНТ, 4-АДНТ, 2,4-ДАНТ и 2,6-диамино-4-нитротолуол (2,6-ДАНТ), которые сохраняют токсичность и характеризуются повышенной устойчивостью к разрушению известным сообществом микроорганизмов. Этот недостаток также ограничивает применение известного способа [3] на практике.

Известен способ [4] очистки ТНТ-содержащих сточных вод, осуществляемый путем непрерывного культивирования иммобилизованного штамма Pseudomonas fluorescens B-3468 в анаэробных и аэробных условиях.

Недостатком способа [4] является то, что при его осуществлении аккумулируются устойчивые к дальнейшему биологическому воздействию аминопроизводные ТНТ, тогда как биодеградация ТНТ отсутствует, что ограничивает возможность практического применения известного способа [4].

Наиболее близким по техническому решению к предлагаемому изобретению - прототипом, является способ удаления ТНТ из очищаемой среды клетками цианобактерий Anabaena sp. [5].

Недостатком прототипа [5] является то, что высокие концентрации ТНТ оказывают токсический эффект на цианобактерии Anabaena sp., поэтому требуются продолжительный период адаптации цианобактерий к исходному ксенобиотику путем постепенного увеличения его (ксенобиотика) концентрации (от 1 мг/л до 58 мг/л). Это продлевает и удорожает биотехнологический процесс. К тому же, трансформация ТНТ цианобактериями Anabaena sp. сопровождается аккумуляцией в очищаемой среде конечных и устойчивых к биоразрушению метаболитов, например азокси-тетранитротолуолов. Неспособность Anabaena sp. разрушать ароматическое кольцо ТНТ с отщеплением нитрогрупп существенно ограничивает возможность применения известного способа [5] в природоохранной деятельности.

Целью предлагаемого изобретения является повышение качества и эффективности очистки (обезвреживания, биоремедиации) природных и сточных вод, загрязненных токсичным 2,4,6-тринитротолуолом и его производными, сокращение времени очистки, повышение производительности очистных сооружений, расширение области применения биотехнологий для очистки загрязненных объектов, предотвращение загрязнения окружающей среды.

Цели достигают тем, что очистку ТНТ-загрязненных природных и сточных вод проводят свободными и/или иммобилизованными клетками штамма дрожжей Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 в последовательно соединенных и оснащенных соответствующим оборудованием биореакторах с непрерывным протоком загрязненной и очищаемой среды, с обеспечением (в биореакторах) оптимальных значений температуры, рН среды, аэрации, скорости перемешивания биомассы и среды.

Предлагаемый способ осуществляют в устройстве, состоящем из емкости с загрязненной средой, например резервуара и биореакторов, последовательно соединенных трубопроводами с запорно-регулирующим оборудованием. Биореакторы также оснащены пробоотборниками, отводящими воздух каналами, мешалками для перемешивания биомассы и среды, насосами для перекачивания среды, оборудованием для обеспечения аэрации среды.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что обезвреживание ТНТ-загрязненной воды осуществляют с использованием штамма дрожжей Geotrichum sp. ВКПМ F-1037. Способ осуществляют непрерывным культивированием штамма в очищаемой среде в устройстве, состоящем из не менее трех биореакторов в виде последовательно соединенных между собой емкостей, оснащенных необходимым эксплуатационным и контрольно-измерительным оборудованием. В ином варианте очистку осуществляют в последовательно соединенных между собой водоемах, например проточных прудах очистных сооружений, оснащенных необходимым эксплуатационным и контрольно-измерительным оборудованием. Штамм дрожжей Geotrichum sp. культивируют в оптимальном диапазоне температур от +24°С до +32°С, рН от 3,0 до 7,0 и при скорости перемешивания среды от 100 до 250 об/мин; при отклонении от оптимальных значений параметров процесс очистки загрязненных вод замедляется.

Сущность предлагаемого способа поясняется примерами.

Пример 1. Очистка природных и сточных вод от ТНТ свободными клетками штамма дрожжей Geotrichum sp. ВКПМ F-1037.

Способ осуществляют в устройстве, состоящем из резервуара и биореакторов, последовательно соединенных между собой трубопроводами с запорно-регулирующим оборудованием. Биореакторы оснащены пробоотборниками, отводящими воздух каналами, мешалками, например магнитными мешалками для равномерного распределения биомассы дрожжей и кислорода в толще очищаемой среды, насосами для перекачивания очищаемой среды, системой аэрации.

Очистку осуществляют в установке для непрерывного культивирования дрожжей (Фиг.), где: 1 - первый биореактор; 2 - второй биореактор; 3 - третий биореактор; 4 - резервуар, содержащий жидкую среду с ТНТ; 5, 6, 7 - пробоотборники; 8, 9, 10 - воздухоотводы, оснащенные фильтрами; 11, 12, 13 - магнитные мешалки с магнитами; 14, 15, 16, 17 - система трубопроводов с запорно-регулирующим оборудованием; 18, 19, 20, 21 - насосы; 22, 23, 24 - система аэрации.

Установка состоит из резервуара 4, содержащего жидкую очищаемую синтетическую среду с ТНТ, и трех биореакторов 1, 2, 3, последовательно соединенных системой трубопроводов 14, 15, 16, 17 и оборудованных насосами, например перистальтическими насосами 18, 19, 20, 21 для перекачивания очищаемой среды. Все биореакторы оснащены системой аэрации 22, 23, 24, обеспечивающей подачу стерильного воздуха (в биореакторы), а также отводящими воздух каналами с 0,22 µm фильтрами 8, 9, 10. Кроме этого биореакторы оснащены пробоотборниками 5, 6, 7. Процесс перемешивания очищаемой среды, инокулированной клетками дрожжей (с внесенными клетками) Geotrichum sp., осуществляют магнитными мешалками 11, 12, 13. Процесс очистки осуществляют в диапазоне температур от +24°С до +32°С.

В качестве очищаемой среды используют, например, синтетическую среду следующего состава: глюкоза - 11,2 мМ, (NH₄)₂SO₄ - 7,6 мМ, MgSO₄ -2,0 мМ, Na₂HPO₄ - 9,8 мМ, КН₂РO₄ - 6,2 мМ (рН 7,0). В синтетическую среду вносят ТНТ в концентрации 100 мг/л. Средой для поддержания штамма Geotrichum sp. и накопления биомассы (штамма) служит агаризованная среда Сабуро, содержащая глюкозу - 10,0 г/л, пептон - 10,0 г/л, дрожжевой экстракт - 5,0 г/л, NaCl - 0,25 г/л, агар - 20,0 г/л. Для приготовления всех сред используют дистиллированную воду.

Процесс биологической деструкции (биологического разрушения) ТНТ и его метаболитов осуществляют в два этапа.

Предварительно резервуар 4 заполняют жидкой ТНТ-содержащей синтетической средой.

На первом этапе биореакторы 1, 2, 3 наполняют на одну треть жидкой ТНТ-содержащей синтетической средой из резервуара 4; включают магнитные мешалки 11, 12, 13 и систему аэрации 22, 23, 24.

В биореактор 1, содержащий жидкую синтетическую среду с ТНТ, через трубопровод 14 вносят суточную культуру Geotrichum sp. до конечной оптической плотности клеток А₆₀₀ 0,2 и культивируют (Geotrichum sp.) до максимально полного превращения ТНТ в С-3 моногидридный комплекс Мейзенхеймера (3-Н^--ТНТ) темно-красного цвета. В результате трансформации ТНТ штаммом дрожжей в биореакторе 1 накапливается мажорный метаболит - 3-H^--ТНТ (до 82%). При этом поддерживают нейтральное либо слабокислое значение рН очищаемой среды.

Одновременно с началом работы биореактора 1 в биореактор 2, содержащий жидкую синтетическую среду с ТНТ, через трубопровод 15 вносят суточную культуру Geotrichum sp. до конечной А₆₀₀ 0,4 и культивируют (Geotrichum sp.) до аккумуляции желто-оранжевых С3,С5 дигидридных комплексов Мейзенхеймера (3,5-2H^--ТНТ; изомеры 3,5-2H^--ТНТ·H⁺), являющихся основными метаболитами превращения исходного ксенобиотика в биореакторе 2. В биореакторе 2 происходит снижение рН до оптимального уровня 4,7-5,4 вследствие интенсивной продукции дрожжами органических кислот.

Одновременно с началом работы биореакторов 1 и 2 в биореактор 3, содержащий жидкую синтетическую среду с ТНТ, через трубопровод 16 вносят суточную культуру Geotrichum sp. до конечной A₆₀₀ 1,0 и культивируют (Geotrichum sp.) до образования и полного разрушения ТНТ-дигидридных комплексов. Очистка в биореакторе 3 сопровождается обесцвечиванием очищаемой среды и накоплением нитрат-иона, являющегося мажорным конечным азотсодержащем неорганическим продуктом деструкции токсичного ТНТ. В биореакторе 3 происходит снижение рН до оптимальных значений от 3,0 до 3,8 вследствие интенсивного синтеза и экскреции дрожжами органических кислот. На этом завершают выполнение первого этапа.

На втором этапе включают насосы 18, 19, 20, 21, и процесс биодеградации ТНТ и его метаболитов осуществляют в условиях непрерывного режима культивирования клеток дрожжей Geotrichum. sp. с обеспечением (работы насосов и запорно-регулирующего оборудования) полного обновления среды биореакторов за промежуток времени от 18 до 24 часов.

В каждом из биореакторов 1, 2, 3 поддерживают оптимальную оптическую плотность клеток Geotrichum sp. (от А₆₀₀ 0,2 до А₆₀₀ 5,0) путем регулирования скорости поступления жидкой синтетической среды с ТНТ из резервуара 4 в биореактор 1, очищаемой среды из биореактора 1 в биореактор 2, очищаемой среды из биореактора 2 в биореактор 3 и очищенной среды из биореактора 3, например, в систему сбора и удаления очищенной среды (на Фиг. не указана, как не имеющая прямого отношения к способу очистки). Скорость протока и расход очищаемой среды через биореакторы устанавливают, сохраняя стабильность биологических процессов и обеспечивая пространственное разделение метаболитов трансформации ТНТ во всех трех биореакторах 1, 2, 3. Процесс контролируют путем отбора проб через пробоотборники 5, 6, 7 и их (проб) последующего анализа и корректируют, например, путем изменения скорости поступления среды, интенсивности перемешивания.

В результате осуществления предлагаемого способа очистки по Примеру 1 биодеградация ТНТ через разрушение промежуточных ТНТ-гидридных комплексов достигает 82% (от начальной концентрации) за 1 сутки. Такое глубокое разрушение ТНТ предлагаемым способом существенно превышает возможности прототипа и обеспечивает его (заявляемого способа) применение в промышленных условиях.

Другим преимуществом предлагаемого способа биологического разрушения ТНТ и его метаболитов в устройстве является возможность обезвреживания ТНТ-загрязненных вод при помощи клеток, иммобилизованных на различных носителях, что показано в следующих примерах.

В качестве носителей для иммобилизации клеток штамма дрожжей Geotrichum sp. применяют различные носители, например: твердые (хитин, целлюлозу, кремнезем, керамику, стекловолокно) и гелевые (альгинатный, полиакриламидный и агарозный гели, криогель поливинилового спирта).

Пример 2. Очистка природных и сточных вод от ТНТ иммобилизованными на твердом носителе клетками штамма дрожжей Geotrichum sp. ВКПМ F-1037.

Предварительно клетки штамма дрожжей Geotrichum sp. иммобилизуют на носитель, например на ткань из стекловолокна (стеклоткань). Для этого жидкую среду Сабуро инокулируют дрожжевыми клетками Geotrichum sp. и культивируют в течение 18 часов. Затем в жидкую среду Сабуро с клетками вносят кусочки стеклоткани и культивируют (клетки) в присутствии носителя в течение 4 часов. Клетки дрожжей адсорбируются на носителе. Затем кусочки стеклоткани с иммобилизованными клетками дрожжей переносят в биореакторы 1, 2, 3 с очищаемой средой.

Следующий этап, этап биологического разрушения ТНТ, осуществляют по Примеру 1. Осуществлением процесса по Примеру 2 достигают деструкции ТНТ в пределах 75-80%.

Пример 3. Очистка природных и сточных вод от ТНТ иммобилизованными в гелевом матриксе клетками штамма дрожжей Geotrichum sp. ВКПМ F-1037.

Предварительно клетки штамма дрожжей Geotrichum sp. включают в структуру геля, например альгинатного геля, известными способами [6, 7].

Затем носитель с иммобилизованными клетками дрожжей переносят в биореакторы 1, 2, 3 с очищаемой средой.

Далее процесс биологической деструкции ТНТ осуществляют по Примеру 1. Осуществлением процесса по Примеру 3 достигают деструкции ТНТ в пределах 75-80%.

Эффективность процесса очистки предлагаемым способом существенно превосходит эффективность прототипа, что позволяет повысить производительность очистных сооружений. Кроме того, предлагаемый способ позволяет использовать как свободные, так и иммобилизованные клетки штамма дрожжей Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 для осуществления биотехнологического процесса очистки загрязненных вод. Универсальность применения способа очистки от ТНТ обеспечивают тем, что в зависимости от условий осуществления процесса обезвреживания используют иммобилизованные на различных носителях клетки Geotrichum sp. Возможность иммобилизации штамма Geotrichum sp. позволяет повысить устойчивость иммобилизованных клеток к высоким концентрациям ТНТ. Это расширяет область применения биотехнологий для детоксикации природных и сточных вод, загрязненных нитроароматическими ксенобиотиками.

Динамика трансформации ТНТ и его метаболитов, сопровождающаяся изменением цвета очищаемой среды в биореакторах, позволяет осуществлять визуальный (без применения аналитического оборудования) контроль за процессом очистки в производственных условиях. Это существенно упрощает контроль за работой очистных сооружений. При необходимости, динамику процесса биоремедиации отслеживают путем анализа отобранных проб из биореакторов 1, 2, 3 с помощью пробоотборников 5, 6, 7. В практике очистки природных и сточных вод, загрязненных ТНТ и его метаболитами, достаточен визуальный контроль процесса биоремедиации.

Продукты трансформации ТНТ определяют различными физико-химическими методами, например УФ-видимой спектрофотометрией, высокоэффективной жидкостной и ионной хроматографией.

Спектрофотометрические измерения выполняют на спектрофотометре, например Lambda 35 (Perkin Elmer, USA). Биомассу оценивают по изменению оптической плотности среды с клетками при длине волны 600 нм. Контролем служит лишенная клеток среда. 3-H^--THT обнаруживают по пику поглощения при 476 нм, аккумуляцию 3,5-2H^--ТНТ и сумму изомеров 3,5-2H^--THT·H⁺ - по спектральным сдвигам в область 440-445 нм.

ТНТ и продукты его трансформации анализируют высокоэффективной жидкостной хроматографией, например, на хроматографе Series 200 (Perkin Elmer, USA), в обращеннофазовом варианте с использованием колонки Supelcosil octyl C-8 (150×4,6 мм; 5 мкМ), с детекцией при 254 и 476 нм. Первоначально мобильная фаза состоит из 99% Na-фосфатного буфера (рН 7,0; 25 мМ) и 1% метанола. В течение 2,0 мин количество метанола увеличивают до 30%, в течение следующих 13,0 мин - до 43%. В последующие 12,5 мин содержание метанола увеличивают с 43% до 100%. Данный градиент оставляют неизменным в течение 0,5 мин. В дальнейшем за 1,0 мин соотношение мобильной фазы возвращают к первоначальному уровню и оставляют постоянным в течение следующих 5,0 мин. Скорость потока 1,0 мл/мин, температура плюс 50°С.

Нитрит- и нитрат-ионы определяют с помощью ионного хроматографа, например 761 Compact IC (Metrohm AG, Швейцария), оснащенного разделительной колонкой Metrosep A Supp 5 - 150 (6.1006.520). Элюцию проводят растворами 1,0 мМ NaHCO₃ и 3,2 мМ Nа₂СО₃ со скоростью 0,7 мл/мин.

Существенным отличием заявляемого способа многостадийного культивирования штамма дрожжей Geotrichum sp. BKПM F-1037 в присутствии ТНТ является высокая (до 82%) эффективность биодеградации ТНТ и его метаболитов за короткий промежуток времени (за 1 сутки), тогда как трансформация ТНТ прототипом ведет лишь к накоплению метаболитов исходного ксенобиотика при отсутствии их разложения. Накопление устойчивых продуктов трансформации ТНТ, происходящее при использовании прототипа, не позволяет решать проблему очистки ТНТ-загрязненных объектов, а только способствует вторичному загрязнению окружающей среды образовавшимися метаболитами.

Другим преимуществом заявляемого способа с использованием штамма Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 является возможность его применения для очистки вод, загрязненных высокими концентрациями ТНТ, так как штамм Geotrichum sp. обладает повышенной (по сравнению с аналогами и прототипом) устойчивостью к токсическому действию ТНТ (до 200 мг/л).

Возможность осуществления процесса очистки с использованием иммобилизованных клеток штамма Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 позволяет существенно расширить область применения биотехнологий для охраны окружающей среды.

Применение предлагаемого способа способствует повышению качества и упрощению процесса биоочистки природных и сточных вод, загрязненных токсичными нитроароматическими соединениями (на примере особо устойчивого к биологическому разрушению ТНТ и его производных), сокращению времени очистки, расширению области применения биотехнологий для очистки экологически опасных объектов, предотвращению загрязнения природной среды.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружены способы, которым присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявленный способ имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.

Заявленное техническое решение можно реализовать на очистных сооружениях промышленных предприятий, синтезирующих нитроароматические соединения, а также в деятельности природоохранных организаций, используя известные стандартные технические устройства и оборудования. Это соответствует критерию "промышленная применимость", предъявляемому к изобретениям.

Источники информации

1. Торе A.M., К. Jamil, Т. R. Baggi. Transformation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) by immobilized and resting cells of Arthrobacter sp. // J. Hazard. Subst. Res. - 1999. - V. 2. - P. 3-1-3-9.

2. Sublette К. L., E. V. Ganapathy, S. Schwartz. Degradation of munition wastes by Phanerochaete chrysosporium // Appl. Biochem. Biotechnol. - 1992. - V.34/35. - P.709-723.

3. Wang Zh., Zh. Ye, M. Zhang, X. Bai. Degradation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) by immobilized microorganism-biological filter // Process Biochem. - 2010. - V.45. - P.993-1001.

4. Патент РФ «Способ биологической очистки сточных вод» RU №1471493, МПК⁶ C02F 3/34, приоритет от 08.12.1986. Текст описания от 10.09.1995.

5. Pavlostathis S.G., G. H. Jackson. Biotransformation of 2,4,6-trinitrotoluene in a continuous-flow Anabaena sp. system // Water Res. - 2002. - V. 36. - P.1699-1706.

6. Flink J.M., A. Johansen. A novel method for immobilization of yeast cells in alginate gels of various shapes by internal liberation of Ca-ions // Biotechnol. Lett. - 1985. - V.7. - P.765-768.

7. Stormo К.Е., R.L.Crawford. Preparation of encapsulated microbial cells for environmental applications // Appl. Environ. Microbiol. - 1992. - V.58. - P.727-730.