Способ получения композиционного материала биотехнологического назначения

Изобретение относится к области биотехнологий и наномедицины, в частности, к способам получения композиционного материала с антимикробными свойствами на основе оксида графена и наночастиц серебра и может найти применение, главным образом, для изготовления препаратов, подавляющих жизнедеятельность микроорганизмов.

Серебро, в отличие от органических (химических) консервантов и дезинфектантов, - природный элемент, не загрязняющий природу. Являясь сильным биоцидом для микробов и вирусов, серебро, в отличие от других металлов, в то же время гораздо менее токсично для многоклеточных организмов. В последние десятилетия в связи с широким использованием антибиотиков и химических консервантов ускоряется процесс появления резистентных штаммов микроорганизмов. Тогда как серебро не создает резистентных штаммов, убивая возбудителей на 100% и не давая им мутировать и размножаться. Однако разные виды серебра в разных формах обладают разными свойствами. Наиболее широко известны препараты на основе катионного серебра (Ag⁺), в том числе, в составе оксида серебра, солей серебра (нитратов, сульфатов, фосфатов), комплексов серебра (цитратов или лактатов), свободных аквакатионов серебра, а также препараты на основе коллоидного серебра, содержащие, особенно в случае коллоидного серебра, полученного электрохимически, в качестве примесей к металлическому серебру значительное количество катионного серебра в виде оксида или соли.

Препараты так называемого металлического микродисперсного или нанодисперсного серебра, кластерного серебра, в которых основное количество серебра находится в малотоксичной металлической форме Ag⁰, обладают высокой эффективностью и существенно более низкой токсичностью для людей, чем катионное серебро.

На сегодняшний день предложено большое количество препаратов на основе коллоидного металлического серебра, которые находят широкое применение в медицине как антисептические средства наружного применения. Для стабилизации частиц серебра в этих препаратах используются различные матрицы.

В настоящее время в связи с широким распространением антибиотикорезистентности микробов наблюдается усиление интереса к препаратам серебра. Так, получены соединения серебра с гистидином, триптофаном и аргинином по реакции комплексообразования с содержанием серебра 40-50% (Химико-фармацевтический журнал, 2000, №34(5), с. 34-35; Химико-фармацевтический журнал, 2001, №35(9), с. 35-36). Эти соединения проявляют антимикробную активность в отношении Staphylococcus aureus, Candida albigans, Bacillus subtilis и некоторых других бактерий.

Недостатками указанных соединений является то, что они плохо растворимы в воде (0,1%); наличие аминокислот в составе может вызывать побочные негативные воздействия; серебро в них связано с органическим лигандом в виде комплекса.

Известен способ получения нанокомпозита серебра, обладающего антимикробным действием (Патент РФ №2611999; МПК A61K 9/14, A61K 33/38, A61K 47/36, A61K 47/22, А61Р 31/00, А61Р 35/00, B82Y 5/00; опубл. 05.08.2015). В качестве стабилизатора наночастиц применяется природный биоконъюгат арабиногалактана с флавоноидами с размером наночастиц серебра 1.7-90.0 нм и их содержанием в композите - 1.3-17.5%.

Находящиеся в макромолекулах арабиногалактана высокоактивные восстановители (флавоноиды) могут выступать в роли восстановителя катионов серебра до нуль-валентного состояния этого металла (Журнал физической химии, 2003, Т. 77, №9, с. 1683-1692), что позволяет проводить реакцию в среде с нейтральными значениями рН без нагревания и без деградации молекулы арабиногалактана.

Известен способ получения нанокомпозитного материала оксида графена с наночастицами серебра (Physical Chemistry Chemical Physics, 2015, №17, с. 18443-18448), не требующий дополнительных стадий и реагентов и состоящий в нагревании водной суспензии оксида графена (Chemistry of Materials, 1999, №11, с. 771-778) с раствором нитрата серебра с прикапыванием цитрата натрия. Получаемый гибридный материал следующего состава: наночастицы серебра (≈ 15.6 нм) - наночастицы серебра (≈ 57.5 нм) - оксид графена - позволяет мультиплексно детектировать различные аналиты на уровне концентраций 10-6-10-12 М.

Недостатком известного способа является невозможность контроля процессов зародышеобразования и получения наночастиц серебра с узким распределением частиц по размерам, что не позволяет использовать получаемый нанокомпозитный материал в качестве активного слоя в сенсорном устройстве для количественного определения актуальных аналитов.

Известен способ получения композиционного материала на основе оксида графена и наночастиц серебра (Journal of Nanobiotechnology, 2016, 14:12, с. 2-17), включающий синтез оксида графена (GO), синтез наночастиц чистого серебра (AgNP) и синтез нанокомпозита оксидов серебра и графена (GOAg). Принят за прототип.

Синтез оксида графена (GO). Пластинки оксида графена синтезированы модифицированным методом Хаммерса (Journal of the American Chemical Society, 1958, 80(6), с. 1339; Carbohydrate Polymers, 2015, 123, с. 217-227). Природный графит был предварительно обработан для обеспечения полного окисления. Для этого графитовый порошок (1.0 г) нагревали при температуре 90°С в концентрированной серной кислоте H₂SO₄ (4.4 мл), содержащей персульфат калия K₂S₂O₈ (0.8 г) и пентоксид фосфора P₂O₅ (0.8 г).

Кислотную смесь выдерживали, помешивая на конфорке, в течение 4.5 ч. Затем смесь разбавляли в дистиллированной воде и оставляли на выдержку на ночь. Далее ее фильтровали через 0.22 мкм мембранный фильтр (миллипору), промывая дистиллированной водой, и полученный осадок сушили при комнатной температуре в течение ночи.

Для окисления графен предварительно добавляли в охлажденную колбу (0°С), содержащую H₂SO₄ (40 мл), в которую постепенно добавляли перманганат калия KMnO₄ (5.0 г), и контролировали температуру во избежание превышения 10°С посредством ледяной бани. Затем смеси позволяли реагировать при температуре 35°С в течение 2 ч, после чего была добавлена дистиллированная вода небольшими дозами в ледяной бане для поддержания температуры ниже 50°С, и смесь перемешивали еще 2 часа. Окисление графена осуществляли добавлением перекиси водорода H₂O₂ (30 объемн. %). Полученную ярко-желтую смесь оставляли отстаиваться на 2 дня. Смесь фильтровали через 0.22 мкм мембранный фильтр с последующим центрифугированием при добавлении соляной кислоты HCl (10 мас. %) и дистиллированной воды для удаления ионов металлов и кислоты. Полученный продукт диализовали (трубка диализа fisherbrand 12.000-14.000 da) в течение 10 дней для удаления остаточных солей. Дисперсию оксида графена сохраняли в герметичной емкости, защищенной от влажности и света.

Синтез наночастиц чистого серебра (AgNP). Наночастицы чистого серебра были синтезированы по методу Туркевича (Discussions of the Faraday Society, 1951, 11, с. 55-75). Нитрат серебра AgNO₃ (8.4 мг) растворяли в 40 мл дистиллированной воды и нагревали с обратным холодильником. После закипания раствора в него прикапывали раствор цитрата натрия (10 мл, 1 ммоль л^-1). Реакцию проводили при температуре 110-130°С в течение 30 мин. Дисперсию серебра диализовали в течение 48 ч в токе дистиллированной воды для удаления остаточных солей (трубка диализа fisherbrand 12.000-14.000 da) и помещали для хранения в охлаждаемом сосуде, защищенном от света.

Синтез нанокомпозита оксидов серебра и графена (GOAg). Композит GOAg синтезировали по модифицированный методу Туркевича (Colloids and Surfaces В: Biointerfaces, 2014, 113, с. 115-124; International Journal of Nanomedicine, 2015, 10, c. 6847-6861). Для этого оксид графена (6.2 мг) диспергировали в дистиллированной воде (20 мл) и обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин. Далее AgNO₃ (8.4 мг), растворенный в дистиллированной воде (20 мл), добавлялся к предыдущему и обрабатывался ультразвуком в течение 30 минут. Затем смесь нагревали с обратным холодильником, и при достижении температуры около 110°С добавляли по каплям раствор цитрата натрия (10 мл, 1 ммоль л^-1). Реакцию выдерживали при температуре 130°С в течение 50 мин. Полученная дисперсия GOAg диализировалась в течение 48 ч для удаления остатков солей (трубка диализа fisherbrand 12.000-14.000 da). Полученную дисперсию хранили в герметически закрытом сосуде, защищенном от света.

Однако данный способ получения композиционного материала на основе оксида графена и наночастиц серебра предполагает осуществление большого количества трудоемких и длительных стадий синтеза, что приводит к неполной воспроизводимости свойств получаемых материалов. Кроме того, из-за использования дополнительных реагентов - стабилизаторов и поверхностно-активных веществ (ПАВ) - необходимым этапом получения геля являются многократные промывки. Неполнота отмывки наночастиц серебра от ПАВ и стабилизаторов приводит к появлению значительного количества балластных веществ, приводящих к снижению эффективности применения композитного материала.

Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в упрощении технологии, снижении затрат на изготовление композиционного материала и повышении воспроизводимости его свойств.

Это достигается тем, что в способе получения композиционного материала биотехнологического назначения, обладающего антимикробным действием, включающем синтез композиционного материала, состоящий из смешения наночастиц серебра с нулевой валентностью и стабилизатора наночастиц, поддержания температуры и воздействия ультразвуком, осаждение композиционного материала, фильтрование, промывку осадка и сушку, согласно изобретению, в качестве стабилизатора наночастиц используют оксид графена «Таунит» в виде водной суспензии, а синтез композиционного материала осуществляют смешением водной суспензии оксида графена «Таунит» с водной суспензией наночастиц серебра с нулевой валентностью, в качестве которой используют концентрат коллоидного серебра КНД-С-К 1% (10000 мг/дм³), в количестве от 0.3 до 1.5 объемов на 1 объем водной суспензии оксида графена «Таунит» при температуре 20-40°С и воздействии ультразвуком в течение 30 мин.

Осаждение композиционного материала производят в этаноле с последующим фильтрованием через воронку Шотта под вакуумом, осадок промывают тем же этанолом, и полученный композиционный материал высушивают в эксикаторе над безводным хлоридом кальция.

Использование в качестве стабилизатора наночастиц оксида графена и осуществление синтеза композиционного материала смешением водной суспензии оксида графена с водной суспензией наночастиц серебра с нулевой валентностью в количестве от 0.3 до 1.5 объемов на 1 объем водной суспензии графена при температуре 20-40°С и воздействии ультразвуком в течение 30 мин. обеспечивает:

- упрощение технологии синтеза композиционного материала за счет сокращения номенклатуры применяемых материалов, проведения технологического процесса при комнатной температуре, снижения продолжительности синтеза композиционного материала и уменьшения расхода воды;

- минимизацию количества применяемого оборудования и соответственно снижение капитальных затрат;

- повышение качества за счет изготовления компонентов на специализированных предприятиях.

Осаждение композиционного материала в этаноле с последующим фильтрованием через воронку Шотта под вакуумом, промывка осадка тем же этанолом и высушивание полученного композиционного материала в эксикаторе над безводным хлоридом кальция обеспечивает расширение номенклатуры выпускаемого композиционного материала (как в виде суспензии, так и в виде порошка).

Использование в качестве водной суспензии оксида графена водной суспензии оксида графена «Таунит» и в качестве водной суспензии наночастиц серебра с нулевой валентностью концентрата коллоидного серебра КНД-С-К 1% (10000 мг/дм³) обеспечивает повышение качества за счет применения серийно выпускаемых продуктов.

Для осуществления изобретения применялись следующие исходные вещества.

Оксид графена «Таунит» представляет собой окисленные двумерные графеновые пластины толщиной до 15 нм в виде водной пасты. Основой оксида графена «Таунит» является химически диспергированный графит, содержащий незначительное количество неуглеродных примесей в виде серы. Оксид графена предназначен для использования в химической и нефтеперерабатывающей промышленности в качестве сырьевого компонента для придания конечному продукту (смазочным материалам, противоизносным составам и т.д.) триботехнических и противоизносных свойств.

Концентрат коллоидного серебра КНД-С-К 1%. Концентрация металлического серебра составляет 1% (10000 мг/дм³). Состоит из наночастиц серебра, взвешенных в деминерализованной (деионизированной) воде, не содержит вредных, токсичных и аллергенных компонентов и добавок. Преимущества: устойчивость, инертность, открывающая широкую возможность комбинации с другими микроэлементами и биологически активными веществами; повышенная биодоступность активных компонентов; не содержит ионные ассоциаты и ионы металлов; гипоаллергенность, отсутствие «эффекта привыкания» - исключается образование резистивных (устойчивых) форм микроорганизмов. Коллоидная форма металлического серебра наиболее эффективна, так как металл в виде катионов высвобождается из частиц только по мере его расходования, обеспечивая постоянный и долговременный эффект. Условия хранения: в стеклянной посуде или пищевых ПЭТФ-бутылках в сухом, темном, прохладном месте.

Способ получения композиционного материала биотехнологического назначения может быть осуществлен по указанным примерам.

Пример 1.

Смешивали водную суспензию оксида графена «Таунит» в количестве 2 мл с 5 мл концентрата коллоидного серебра КНД-С-К 1% (10000 мг/дм³) при постоянном перемешивании при температуре 20-40°С и воздействии ультразвуком в течение 30 мин. Выход полученного композиционного материала составил 98% с содержанием в нем серебра 0.5%. Размер наночастиц серебра по данным просвечивающей электронной микроскопии - 1.7-8.0 нм. Средний размер наночастиц - 5.0 нм.

Пример 2.

Смешивали водную суспензию оксида графена «Таунит» в количестве 5 мл с 10 мл концентрата коллоидного серебра КНД-С-К 1% (10000 мг/дм³) при постоянном перемешивании при температуре 20-40°С и воздействии ультразвуком в течение 30 мин. Выход полученного композиционного материала составил 95% с содержанием в нем серебра 2.6%. Размер наночастиц серебра по данным просвечивающей электронной микроскопии - 1.7-8.0 нм. Средний размер наночастиц - 5.0 нм.

Раствор выдерживали при перемешивании при комнатной температуре 20-25°С, осаждали композиционный материал в 25 мл этанола с последующим фильтрованием через воронку Шотта под вакуумом. Осадок промывали на Шотте тем же этанолом и высушивали полученный композиционный материал в эксикаторе над безводным хлористым кальцием. Выход полученного композиционного материала составил 95% с содержанием в нем серебра 20.4%. Размер наночастиц серебра по данным просвечивающей электронной микроскопии - 2.0-25.0 нм. Средний размер наночастиц - 6.5 нм.

Пример 3.

Смешивали водную суспензию оксида графена «Таунит» в количестве 3 мл с 10 мл концентрата коллоидного серебра КНД-С-К 1% (10000 мг/дм³) при постоянном перемешивании при температуре 20-40°С и воздействии ультразвуком в течение 30 мин. Выход полученного композиционного материала составил 99% с содержанием в нем серебра 0.6%. Размер наночастиц серебра по данным просвечивающей электронной микроскопии - 1.7-8.0 нм. Средний размер наночастиц - 5.0 нм.

Пример 4.

Смешивали водную суспензию оксида графена «Таунит» в количестве 5 мл с 20 мл концентрата коллоидного серебра КНД-С-К 1% (10000 мг/дм³) при постоянном перемешивании при температуре 20-40°С и воздействии ультразвуком в течение 30 мин. Затем раствор выдерживали при перемешивании при комнатной температуре 20-25°С, осаждали композиционный материал в 15 мл этанола с последующим фильтрованием через воронку Шотта под вакуумом. Осадок промывали на Шотте тем же этанолом и высушивали полученный композиционный материал в эксикаторе над безводным хлористым кальцием. Выход полученного композиционного материала составил 96% с содержанием в нем серебра 3%. Размер наночастиц серебра по данным просвечивающей электронной микроскопии - 2.0-9.0 нм. Средний размер наночастиц серебра - 5.3 нм.

Изучение антимикробного действия полученного композиционного материала с содержанием серебра 12.5% проводили методом двукратных серийных разведений на референтных штаммах, полученных из коллекции микроорганизмов (Candida albicans АТСС №24433, Staphylococcus aureus АТСС №25923, Escherichia coli АТСС №25922, Enterococcus faecalis АТСС №22212, Pseudomonas aeruginosa ATCC №27853).

Чувствительность опытных штаммов микроорганизмов к наночастицам серебра определяли in vitro на виноградно-сахарном бульоне (ВСБ) и среде Сабуро (по стандартам МУК 4.21890-04) на основании динамики роста культуры. Антимикробную активность оценивали в диапазоне концентраций от 0,1% до 0,01% (от 1 мг/мл до 0,01 мг/мл). Препарат предварительно разводили в ВСБ. Тестируемые штаммы микроорганизмов добавляли по 0,1 мл (0,6 единиц по стандарту мутности МакФарланда) в 5 мл каждого разведения исследуемого вещества.

В результате проведенных экспериментов установлено, что серебряный композиционный материал, полученный с использованием в качестве стабилизирующей матрицы оксида графена, сорбирующего коллоидное серебро, обладает антимикробной активностью в отношении исследуемых штаммов микроорганизмов (таблица 1). В контрольных пробах, т.е. в отсутствие серебра, наблюдается рост тест-культур.

Антибактериальная эффективность наносеребра настолько высока, что для стерилизации достаточно 0,5-1 мг/дм³. Из этого следует, что при использовании полученного композита ОГ-Ag его необходимо разбавлять водой по меньшей мере в 2×10³-2×10⁴ раз, учитывая синергетическое воздействие оксида графена.

Заявляемый способ получения композиционного материала биотехнологического назначения позволяет упростить технологию, снизить затраты на изготовление композиционного материала и повысить воспроизводимость его свойств.