БИОТРАНСФОРМАЦИЯ КОЛХИЦИНОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Настоящее изобретение относится к способу биотрансформации, осуществляемой посредством отобранных микробных штаммов, для получения 3-О-гликозильных производных колхициноидных соединений.

В частности, способ по настоящему изобретению предоставляет колхициноидное соединение, эксклюзивно гликозилированное по С-3 ароматического кольца А, исходя их колхицина, тиоколхицина или их производных. Способ, дающий в результате высокую производительность и чистоту полученного продукта, основан на ранней активации гликозилирующего фермента, определенной интермедиатом деметилированного колхицина. Предпочтительно способ по изобретению состоит из процесса ферментации с многократной загрузкой сырья, включающего дробную подпитку источником азота, источником углерода и субстратом, который должен быть трансформирован.

Колхициноидные соединения, гликозилированные по С-3 бензольного кольца, имеют большое фармацевтическое значение ввиду их высокой эффективности и как промежуточные при получении новых лекарств.

В частности, тиоколхицид (3-О-глукозилтиоколхицин) является привлекательным и интересным активным ингредиентом в фармацевтической области, главным образом, в терапии заболеваний скелетно-мышечной системы и как исходное вещество для получения новых противоопухолевых, иммуносуппрессорных, противопсориазных и противовоспалительных лекарств.

WO 98/15642 описывает способ получения колхициноидных гликозил-производных с высокими выходами превращения (до 90%) исходя из колхициноидных соединений, таких как колхицин, тиоколхицин и их производные, при начальной концентрации до 1 г/л. Способ основан на стадии предварительного региоселективного деметилирования С-3 метокси-группы, связанной с ароматическим кольцом колхициноида, и последующего гликозилирования деметилированного производного по тому же месту в молекуле.

Способ по настоящему изобретению, сохраняя такой же высокий выход конверсии, как предыдущий, делает возможной трансформацию значительно большего количества суммарного субстрата, улучшая тем самым и суммарную производительность, выраженную как суммарное количество полученного продукта на литр загрузки, и удельную производительность, выраженную как количество полученного продукта на литр загрузки в единицу времени (т.е. час) во время процесса биотрансформации.

Способ по изобретению характеризуется механизмом активации стадии гликозилирования, основанным на введении специфичного фермента. В действительности, было неожиданно обнаружено, что фермент, вовлеченный в стадию гликозилирования, эффективно индуцируется деметилированными колхициноидами, такими как 3-О-деметилколхицина (ДМК) или 3-О-деметилтиоколхицина (ДМТК). Добавление малых количеств (200-600 мг/л) 3-деметилпроизводного на ранних стадиях процесса биотрансформации или, предпочтительно, в предварительно инокулированную культуру, используется для ранней активации гликозилирующей системы. В таких условиях деметилированное производное, постепенно выделяемое деметилирующим ферментом, может быть эффективно конвертировано в конечное гликозил-производное, и биотрансформация может протекать очень быстро в течение первых 15-18 часов ферментации. Кроме того, отсутствует значительное накопление промежуточного соединения, что означает отсутствие ингибирования деметилирующей активности и высокую скорость конверсии. Биотрансформация завершается после 18-21 ч и является поэтому значительно более быстрой, чем биотрансформация по известному способу (26-28 ч). Выход (конверсия) остается очень высоким, от 80% до 100%, обычно около 90-95%, но со значительным увеличением суммарного трансформированного субстрата и соответственно конечного продукта.

Поэтому изобретение предлагает способ получения 3-О-гликозилколхициноидных соединений формулы (I):

где R₁ представляет О-гликозидный остаток, R₂ представляет водород или С₁-С₇ ацил, R₃ представляет С₁-С₆ алкокси или С₁-С₆ тиоалкил, включающий биотрансформацию соединений, в которых R₁ представляет ОН или метокси, посредством Bacillus megaterium, отличающийся тем, что для индуцирования гликозилирующей ферментной системы используют деметилированные колхициноиды;

R₁ предпочтительно представляет О-гликозидный остаток.

Предпочтительное осуществление способа по изобретению заключается в многократной дробной подпитке субстрата в сочетании с источником азота и углерода, подобным пептону и глюкозе. Это условие, обеспечивая стабильную скорость роста микробной культуры, позволяет значительно увеличить суммарное количество субстрата, добавляемого при загрузке ферментера (2-4 г/л вместо 1 г/л) и соответственно производительность процесса (до 2,5-5,2 г/л гликозилированного продукта на одну загрузку вместо 1-1,2 г/л) без какой-либо потери эффективности конверсии и риска токсических воздействий на бактериальную культуру из-за значительного накопления непревращенного субстрата.

Настоящее изобретение является также выгодным уменьшенным временем процесса, приводящим в результате к высокой жизнестойкости культуры и ограниченному клеточному лизису с уменьшенным образованием остатков клеток и значительными преимуществами для переработки выходящего потока и извлечения продукта. Это преимущество может быть дополнительно усилено использованием абсорбционных смол, подобных XAD 1180 (Rohm and Haas) или НР 21 (Mitsubishi), используемых для селективной абсорбции колхициноидных соединений и эффективного извлечения продукта из ферментационного бульона.

Дополнительное преимущество касается возможности проведения полунепрерывного процесса путем извлечения основной части (75-90%) конечного ферментационного бульона, содержащего продукт, добавления новой ферментационной среды к оставшейся части бульона в биореакторе и начала новой операции. Этот подход может быть распространен на повторные стадии ферментации с пропорциональным увеличением суммарной производительности.

Кроме того, постоянная региоселективность катализа обеспечивает, в добавление к поразительно высоким выходам продукции, высокое качество получаемого продукта, позволяющее получить чистоту 99% при простой переработке выходного потока и пониженной нагрузке на стадию очистки и извлечения продукта. Этот аспект означает дополнительные преимущества в показателях сокращения растворителей и высокой экологической совместимости процесса.

Микроорганизмы Bacillus megaterium, используемые в настоящем изобретении, являются микроорганизмами, описанными в WO 98/15642, введенном в описание настоящей ссылкой.

Они могут быть выведены на различных агаровых средах, содержащих источник органического азота (пептоны, экстракты дрожжей, мясные экстракты, аспарагин и т.п.), источник углерода (глицерин, крахмал, мальтоза, глюкоза и т.п.) с рН от 5 до 8, предпочтительно 6-7. Температура инкубации лежит в интервале от 20°С до 45°С, предпочтительно 28-40°С.

Культуральные среды, используемые для сохранения культуры, являются типичными микробиологическими субстратами, содержащими источники органического азота (пептоны, экстракты дрожжей, триптон, мясные экстракты и т.п.), источник углерода (глюкоза, мальтоза, глицерин и т.п.), при рН от 5 до 8, предпочтительно 6-7. Температура инкубации лежит в интервале от 20°С до 45°С, предпочтительно 28-40°С.

Отобранные микроорганизмы могут быть испытаны на способность роста в погруженной культуре в присутствии колхициноидных соединений, добавленных, как описано в настоящем изобретении, и трансформации последних в соответствующие 3-гликозильные производные.

Указанные испытания проводили в 100 мл колбах, содержащих 20 мл жидкой среды различного состава, включающие один или несколько источников органического азота (экстракты дрожжей, пептоны, триптон, гидролизаты казеина, мясной экстракт, кукурузный сироп и т.п.), один или несколько источников углерода (глюкоза, глицерин, крахмал, сахароза и т.п.), источники неорганического фосфора и азота и неорганические соли различных ионов (K⁺, Na⁺, Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, Fe⁺⁺, Mn⁺⁺ и т.п.).

Образцы культуры могут быть, необязательно, подвергнуты мутагенным обработкам посредством обычных методов мутагенеза (облучение УФ-лучами и т.п.), чтобы индуцировать мутанты, имеющие специфическую активность в отношении биоконверсии, которая может быть оценена такой же методикой, как описана выше.

Способность выведенных бактерий трансформировать в соответствующие 3-гликозильные производные колхициноидные субстраты, добавленные в культуральный бульон повторяющимися долями вместе с источниками азота и углерода, была подтверждена посредством испытаний биоконверсии в колбах 300 мл объема, содержащих среды различного состава, включающие один или несколько источников органического азота (экстракты дрожжей, пептоны, триптон, гидролизаты казеина, мясной экстракт, кукурузный сироп и т.п.), один или несколько источников углерода (глюкоза, глицерин, крахмал, сахароза и т.п.), источники неорганического фосфора и азота и неорганические соли различных ионов (K⁺, Na⁺, Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, Fe⁺⁺, Mn⁺⁺, NH₄ ⁺⁺ и т.п.).

Рост бактерий и биотрансформация поддерживаются одним или несколькими источниками органического азота, предпочтительно мясным экстрактом, пептоном, триптоном, гидролизатами казеина, кукурузным сиропом и т.п. Источниками углерода, используемыми для роста и биотрансформации, являются глюкоза, фруктоза, сахароза, глицерин, солодовый экстракт и т.п., предпочтительно глюкоза, фруктоза и глицерин. Культуральная среда содержит, кроме того, источники неорганического фосфора и соли K⁺, Na⁺, Mg⁺⁺, Mn⁺⁺, NH₄ ⁺⁺ и т.п.

Источниками углерода, используемыми при подпитке процесса, предпочтительно являются глюкоза и фруктоза. Источником азота для подпитки процесса предпочтительно является источник органического азота, подобный пептону, гидролизата казеина, триптону, или неорганический источник, подобный сульфату аммония, или сочетание обоих.

Предварительные эксперименты показали, что ввод до стадии биотрансформации погруженной инокулированной культуры, содержащей среду, имеющую состав подобный составу продуктивной среды, дает в результате очень однородную и высоко активную микробную популяцию в начале биотрансформации.

Были проведены дополнительные эксперименты с использованием различных параметров ферментации, таких как количество, время, форма и состав добавляемого субстрата, кратность подпитки, время инкубации, степень инокуляции и т.д.

Раннее добавление деметилированного колхициноида в качестве индуктора в начале стадии биотрансформации или, лучше, во время предварительного инокулируемой культуры, может значительно повысить эффективность конверсии и суммарную производительность процесса.

Дополнительное увеличение может быть достигнуто подпиткой субстрата, который должен конвертироваться, несколькими частями во время процесса в сочетании с источником углерода и источником азота.

Типичная процедура, объединяющая описанные выше параметры, может поэтому основываться на следующей программе:

- предварительное добавление 3-О-деметилколхициноида (200-600 мг/л, предпочтительно 300-500 мг/л) в инокулированную культуру;

- добавление аликвот (300-800 мг/л, предпочтительно 500-600 мг/л) колхициноидного субстрата, который должен быть конвертирован, в начале и каждые 1-3 часа, предпочтительно 1,5-2,5 часа, в течение первых 14-18 часов, предпочтительно 15-16 часов, биотрансформации;

- добавление при каждой подпитке субстратом раствора, содержащего следующие исходные материалы:

пептон или триптон, или гидролизат казеина с конечной концентрацией между 2 и 4 г/л, предпочтительно 2,5-3,5 г/л (также в сочетании с 1-3 г/л, предпочтительно 1,5-2,5 г/л, сульфата аммония;

глюкозу или фруктозу с конечной концентрацией между 5 и 15 г/л, предпочтительно 8-12 г/л.

Принимая во внимание общее время ферментации 20 часов, начальную концентрацию субстрата 500 г/л, интервал подпитки в ходе процесса 3 часа и общее число стадий подпитки 7 (последнее добавление субстрата на 14-ом часу ферментации), к культуре будет добавлено суммарное количество субстрата 4 г/л (вместо 1 г/л/ как описано в WO 98/15642).

Биотрансформация может быть проведена при 25-35°С, предпочтительно при 28-32°С, и при рН между 4 и 8, предпочтительно 5-7, в колбах и перемешиванием на ротационном встряхивателе.

Биотрансформация по изобретению может быть увеличена в масштабе до уровня ферментационного танка при сохранении неизменными условий состояния культуры, в особенности в том, что касается культуральной среды, температуры и временного графика операций. Для того чтобы получить хороший рост, важны соответствующие уровни перемешивания-аэрации, в частности требуются уровни аэрации 1-2 литра воздуха на литр культуры в минуту (vvm), предпочтительно 1,4-1,8 vvm. При таких условиях процесс идет очень быстро, и после 20-21 ч биотрансформация завершается.

Продукт является внеклеточным и может быть экстрагирован из культурального бульона после отделения биомассы от жидкой фракции центрифугированием и извлечением супернатанта или микрофильтрацией и извлечением пермеата. Культура может быть обработана спиртами для оптимального извлечения продукта.

Очистка может проводиться методами хроматографии, жидкостной экстракции спиртами и липофильными органическими растворителями и кристаллизацией, как описано в WO 98/15642.

Нижеследующие примеры более подробно раскрывают настоящее изобретение.

Пример 1

Аликвоту замороженной культуры Bacillus megaterium использовали как инокулят посевных культур (т.е. предкультуру) в 1000 мл колбе Эрленмейера, содержащей 250 мл среды SF2 (таблица) с добавлением 3-О-деметилтиоколхицина до конечной концентрации 0,4 г/л. Указанные культуры инкубировали в течение ночи при 30°С на ротационном встряхивателе при 250 об/мин. После инкубации 500 мл предкультуры переносили стерильно в 14 л ферментер, содержащий 9,5 л свежей среды SF2 (см. таблицу 2) с добавленным тиоколхицином до конечной концентрации 0,5 г/л. Ферментацию проводили при 30°С, поддерживая требуемые уровни перемешивания-аэрации (перемешивание до 900 об/мин, аэрация от 1 до 1,8 vvm в зависимости от роста культуры). Каждые 2 часа в течение первых 14 часов ферментации к культуре добавляли тиоколхицин (конечная концентрация 0,5 г/л), пептон (2 г/л), сульфат аммония (2 г/л) и глюкозу (10 г/л). Перед каждым добавлением (т.е. каждые 2 часа) из культуральных бульонов отбирали пробы и подвергали их следующим анализам:

- Уровень роста как оптическая плотность (ОП) на 600 нм;

- Анализ на стерильность и чистоту штамма на LB агаре;

- Микроскопическая морфология (окраска по Граму);

- Анализ содержания тиоколхикозида методами ТСХ и ЖХВР.

Анализ ТСХ проводили на силикагеле с элюентной системой ацетон:этилацетат:вода 5:4:1. Для анализа ЖХВР 1 мл фракций культурального бульона разбавляли 9 мл метанола и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 2 минут. Содержание тиоколхикозида в супернатанте анализировали ЖХВР обратной фазы с изократическим элюированием элюентной системой вода:ацетонитрил 80:20. Анализ ЖХВР доказывает, что превращение тиоколхицина в тиоколхикозид начинается очень рано и почти полностью завершается спустя 20 часов. Суммарное количество 4 г/л тиоколхицина превращается в 5,2 г/л тиоколхикозида с конверсией 96% и удельной производительностью 0,26 г/л·ч гликозилированного колхициноида.

Пример 2

Конечный культуральный бульон с ферментации (общий объем около 10 л), содержащий около 5,2 г/л тиоколхикозида по определению анализом ЖХВР, подвергали микрофильтрации с поперечным потоком на керамическом картридже 0,22 мкм, чтобы отделить клетки от бульона. Пермеат абсорбировали на колонке, заполненной абсорбционной смолой XAD 180 (Rohm and Haas). После промывки водой продукт элюировали метанолом. Метанольный элюат концентрировали до сухого остатка под вакуумом, затем снова растворяли в метаноле. После экстракции метиленхлоридом спиртовую фракцию концентрировали до сухого остатка и перерастворяли в смеси этанол-метиленхлорид 1:1. После осветления силикагелем раствор концентрировали под вакуумом; затем метиленхлорид замещали этанолом. Результирующую суспензию концентрировали и оставляли кристаллизоваться. Вторую кристаллизацию с этанолом проводили после дополнительных стадий перерастворения твердого вещества в смесях этанол-хлороформ и осветления на силикагеле. После очистки получали суммарное количество продукта 49,9 г с выходом очистки 96% и чистотой 99,5%.

Полученный в результате продукт, проанализированный методами ЖХВР, С-ЯМР, Н-ЯМР и масс-спектроскопии, оказывается таким же, как стандартный тиоколхикозид.

Сравнительный пример 3

Повторяли процедуру, описанную в примере 1, но тиоколхицин полностью добавляли в один прием при конечной концентрации 4 г/л в начале ферментации. Полученный в результате рост был очень слабым и практически блокировался после нескольких часов инкубации. Явный лизис клеток обнаруживался микроскопическим анализом. Анализ ТСХ и ЖХВО не показал заметной биотрансформации.

Сравнительный пример 4

Повторяли процедуру, описанную в примере 1, но тиоколхицин полностью добавляли в один прием при конечной концентрации 1 г/л в начале ферментации, используя ферментационную среду ST, которая описана в WO 98/15642. Биотрансформация протекает медленнее, чем в примере 1, и была остановлена после 28 часов при конечной конверсии 90%, суммарной производительности 1,22 г/л и удельной производительности 0,044 г/л·ч тиоколхикозида.

Таблица 1 показывает сравнение величин общей производительности, удельной производительности и конверсии тиоколхицина в тиоколхикозид по способу настоящего изобретения (А) и по способу по WO 98/15642 (В).

*добавленный субстрат (тиоколхицин); 4 г/л (А); 1 г/л (В).