СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ МОНОГАЛАКТОЗИЛДИАЦИЛГЛИЦЕРИНОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

Изобретение относится к биохимии, конкретно к области получения гликолипидов, которые могут быть использованы в фармацевтической и косметологической промышленности, а также в качестве промежуточных соединений для синтеза новых материалов в биохимии, медицине, в том числе в иммунологии, и в других отраслях промышленности.

Начиная с 80-х годов прошлого столетия в связи с широкомасштабным изучением разнообразных биологических функций липидов, в том числе и гликолипидов, значительно возросла потребность в производстве как липидных фракций, так и индивидуальных препаратов из них. Было установлено, что гликолипиды являются рецепторами гормонов, токсинов, вирусов, проявляют противоопухолевую и антимикробную активности. Являясь структурными компонентами биологических мембран, гликолипиды оказывают влияние на множество мембранных процессов, в том числе на транспорт ионов и метаболитов, активность мембраносвязанных ферментов, межклеточные взаимодействия и рецепцию (Химическая энциклопедия: В 5 т.: т.2. /Редкол.: Кнунянц И.Г. (гл. ред.) - М.: Сов. энцикл., 1990. 671 с.; В.Г. Рыбин, Ю.Г. Блинов. Антимикробные свойства липидов // Изв. ТИНРО. 2001. Т.129. С.179-196.; С.В.Хотимченко. Липиды морских водорослей-макрофитов и трав: Структура, распределение, анализ. Владивосток: Дальнаука, 2003. 234 с.).

Было показано, что гликолипиды, в основном в виде глицерогликолипидов: моногалактозилдиацилглицеринов и дигалактозилдиацилглицеринов, присутствуют во всех растениях, но их количество и соотношение между ними в каждом растении индивидуально.

Определенный набор липидов выделяют из хвойных растений, однако содержание гликолипидов в них незначительно (патент РФ №2089208, опубл. 10.09.1997; Кислухина О.В. Выделение биологически активных липидов из низко-масличного сырья. Пищ. и перераб. Пром-сть: Сер. Масло-жировая пром-сть: Научно-технический инфор. Сб. 1995 Вып.1. - С.10-17). Как правило, они представляют собой набор неполярных и кислых липидов, получаемых путем обработки измельченного сырья 5-10% водным раствором щелочи при комнатной температуре и последующего их извлечения из полученной эмульсии экстракцией петролейным и диэтиловым эфирами.

Минимальное количество диглицеридов выделено из рисовой соломы (до 0,19% от общего количества экстрактивных веществ) в аппаратах Сокслета экстракцией с использованием набора экстрагентов (толуол-этанол 2:1), хлороформа, петролейного эфира, дихлорметана (В. Xiao X.F. Sun RunCang Sun. Extraction and characterization of lipophilic extractives from rice straw, i. Chemical composition // Journal of Wood Chemistry and Technology. 2001. Vol.21. №4. Р.397-411).

Большой набор гликолипидов (ГЛ), включающий галактозилглицерины (ТТЛ) - ацил-моногалактозилдиацилглицерины (Ас-МГДГ), моногалактозилдиацилглицерины (МГДГ), а также сфинголипиды (СФЛ), цереброзиды (ЦЗ) и керамидолигогексозиды (КОГ) - содержит экстракт липидной фракции семян аконита северного. Идентификацию этих соединений проводили по данным ИК-спектроскопии, химических превращений и хроматографической подвижности (С.Г.Юнусова, Э.Г.Зинурова, М.С.Юнусов. Гликолипиды семян аконита северного. Всероссийская конференция «Химия и технология растительных веществ», Сыктывкар, 25-30 сентября 2000 г, 48 с.).

Однако разделение полученной смеси ГЛ с выделением отдельных фракций, в том числе фракции моногалактозилдиацилглицеринов (МГДГ), из этой смеси известными методами колоночной хроматографии и препаративной хроматографии на силикагеле является чрезвычайно трудоемким и неэффективным процессом, в том числе и из-за используемого сырьевого источника, запасы которого незначительны.

На сегодняшний день актуальной задачей является не только поиск нетрадиционных источников липидов, но и получение липидов определенного состава, тем более, что растительные ГЛ и их отдельные фракции являются остродефицитной продукцией, а их выделение связано с переработкой значительного количества растительного сырья, в частности пищевого зерна, и большими капиталовложениями.

О возросших потребностях в липидных препаратах говорит и появление ряда фирм, которые стали выпускать разные вещества этого класса, в том числе МГДГ (Galactosyi diglyceride), структурной формулой

где R₁ и R₂ - ацильные остатки. Gal - галактоза.

Стоимость реактива "Galactosyl diglycerid "с содержанием основного вещества примерно 95%, получаемого из непросеянной пшеничной муки, высушенного в вакууме, составляет (долл. США): 1 мг - 12.10; 5 мг - 39.30 и 10 мг - 65.00. (SIGMA (Chemical company): Biochemicals organic compounds for research and diagnostic reagents. 1992. P.454).

Основным источником выделения МГДГ на сегодня остается пшеничная мука, содержащая смесь гликолипидов, главным образом моногалактозилдиацилглицеринов - МГДГ и дигалактозилдиацилглицеринов - ДГДГ. Способ выделения фракции МГДГ из нее является наиболее близким к заявляемому. Способ состоит из нескольких стадий, включающих экстракцию и переэкстракцию общих липидов (ОЛ) с применением в качестве экстрагентов метанола и гексана, затем выделение из полученного экстракта смеси неочищенных ГЛ с последовательным использованием эфира и системы растворителей (бензол - ацетон и метанол) для очистки полученной фракции ГЛ, последующее разделение МГДГ и ДГДГ с помощью одномерной тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе хлороформ - уксусная кислота - вода и на заключительном этапе - выделение МГДГ экстракцией соответствующей зоны метанолом (Препаративная биохимия липидов. Под ред. Л.Д.Бергельсона. М.: Наука, 1981. 256 с.).

Однако известный способ выделения моногалактозилдиацилглицеринов основан, во-первых, на использовании сырья, представляющего собой ценный пищевой продукт и, во-вторых, содержащего как минимум смесь двух ГЛ, что приводит к необходимости использования больших объемов растворителей и делает известный способ многостадийным, а использование одномерной ТСХ не позволяет разделить с достаточной полнотой близкородственные по структуре гликолипиды.

Задача изобретения состоит в упрощении способа выделения фракции МГДГ из растительного сырья и повышении ее чистоты, что достигается за счет использования нового источника растительного происхождения.

Поставленная задача решается тем, что в способе выделения моногалактозилдиацилглицеринов из растительного сырья путем экстракции общих липидов, последующего их разделения и выделения целевого продукта, в качестве исходного сырья используют отходы переработки риса, а разделение липидов осуществляют с использованием двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Отходы переработки риса (РО) представляют собой возобновляемую биомассу, образующуюся в качестве отхода при очистке зерна на крупяных заводах и состоящую из рисовой шелухи, мучки или рисовых отрубей. Как правило, непереработанный отход риса используют как упаковочный материал, термо- и звукоизолирующий наполнитель в пластмассах, в производстве стройматериалов, в качестве адсорбента маслоподобных веществ, абразивов, топлива, в сельском хозяйстве в качестве добавки в корм животным, подстилочного материала, разрыхлителя почв. Подвергнутый физико-химической переработке отход используют для получения неорганических соединений кремния, углерода, а также ксилозы, сахарозы, фруктозы, фурфурола и фитиновых кислот.

Проведенные заявителем исследования состава липидных фракций из различных растительных отходов показали, что в отличие от известных растительных источников липидов, в том числе и пшеничной муки, липидная фракция отходов переработки риса содержит один доминирующий гликолипид - моногалактозилдиацилглицерин. Впервые обнаруженное заявителем данное свойство рисового отхода позволило значительно упростить процесс выделения МГДГ за счет сокращения количества технологических операций, повысить чистоту выделяемого продукта и дополнительно значительно удешевить стоимость способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Путем экстракции органическими растворителями исходного сырья выделяют фракцию общих липидов (ОЛ). Выделение ОЛ проводят стандартными методами, например, с использованием в качестве экстрагентов этанола и хлороформа - метод Блайя и Дайера (E.G Bligh, W.J. Dyer. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. Physiol.,1959. - Vol.37, P.911-917) или смеси растворителей изопропанол-гексан - метод Шафера для растительных тканей (К. Schafer. Accelerated solvent extraction of lipids for determining the fatty acid composition of biological material // Anal. Chim. Acta, 1998, - Vol.358, P.69-77) с последующим вакуумным испарением растворителей. Как показали проведенные эксперименты, выход общих липидов (ОЛ) из образцов РО составляет 1,4-2,7 мас.% и зависит в общем случае от способа очистки зерна на предприятии, но не от примененного метода выделения ОЛ. Полученный маслообразный остаток ОЛ затем растворяют в одном из растворителей и проводят разделение липидов методом двумерной ТСХ в системе растворителей, которую, как правило, подбирают экспериментально по эффективности разделения компонентов липидов. Выделение МГДГ с хроматограммы осуществляют стандартным образом путем десорбции (элюирования) пятна МГДГ с адсорбентом этанолом или раствором хлороформа с метанолом, отделения адсорбента либо на воронке Бюхнера под вакуумом, либо центрифугированием и последующего вакуумного испарения растворителя.

В качестве отхода рисового производства используют отходы переработки зерна риса (РО), которые образуются при получении крупы на заводах. В частности, были исследованы образцы РО, полученные на крупяных заводах в Краснодарском крае (образцы РО1-3) и Ростовской области (образец РО-4). Для сравнения липидного состава использовали также образец зерна сои, выращенной в Амурской обл.

Двумерную ТСХ проводили по общепринятым методикам с использованием смеси известных растворителей, взятых в определенном соотношении, которая показала наилучший результат: 1-е направление: хлороформ, ацетон, метанол, муравьиная кислота, вода; 2-е направление: ацетон, бензол, муравьиная кислота, вода (М.Кейтс. - Техника липидологии. М.: Мир, 1975. 221 с.).

Качественный состав ОЛ различных образцов РО определяли по известной методике с помощью одномерной ТСХ с использованием одного из реагентов, проявляющих пятна (например, раствора серной кислоты в метаноле или раствора фосфорномолибденовой кислоты), а их идентификацию проводили по литературным значениям величин R_f (М.Кейтс. - Техника липидологии. М.: Мир, 1975. 221 с.; W.W. Christie. - Lipid analysis. Isolation, separation, identification and structural analysis of lipids - L., 1973. - P.153-154). Результаты представлены в табл. 1, где приведен состав полярных липидов в образцах РО и для сравнения - сои.

Анализ полярных липидов, полученных по заявляемому способу из отходов рисового производства, проведенный с помощью двумерной ТСХ, представлен в табл.2 и на фиг.1, где приведена двумерная микро-ТСХ полярных липидов образца РО-1: 1-ФИ; 2-ФХ; 3-МГДГ. Для остальных образцов микро-ТСХ идентичны. Для сравнения на фиг.2 приведена двумерная микро-ТСХ полярных липидов образца сои, где 1-ФИ, 2-ФХ, 3-МГДГ, 4-ФС, 5-ФЭ, 6-СХДГ: 7-ДГТС, 8-Х₁, 9-X₂, где X₁ и Х₂ - неидентифицированные соединения.

Полученные данные показывают, что во всех образцах РО идентифицированы по одному ГЛ, представляющему собой МГДГ, и по два фосфолипида (ФЛ): ФИ, ФХ. По составу полярных липидов (ПЛ) образцы РО существенно отличаются от образца сои, который демонстрирует наличие большего числа полярных липидов.

Известно, что длина цепи ацильных групп и их степень ненасыщенности влияют на хроматографическую подвижность ГЛ (С.В.Хотимченко. Липиды морских водорослей-макрофитов и трав: Структура, распределение, анализ. Владивосток: Дальнаука, 2003, 234 с.). Поскольку при хроматографическом разделении ГЛ и ФЛ методом ТСХ не наблюдается деления МГДГ на две зоны, т.е. МГДГ образует одно пятно (пятно 3 на фиг.1), можно считать, что ацильные остатки моногалактозилдиацилглицерина R₁ и R₂ одинаковы, и следовательно, выделяемый МГДГ является гомогенным соединением, в котором R₁ равно R₂.

Предложенный способ иллюстрируется следующим примером.

Навеску 20 г сырья - РО-2 - заливают 200 мл смеси хлороформ-этанол (2:1) и экстрагируют ОЛ. Полученный экстракт упаривают на роторном испарителе при температуре 40°С, высушивают под вакуумом до постоянной массы и получают 0.52 г ОЛ, которые затем растворяют в 5 мл гексана и проводят двумерную ТСХ на хроматографической пластине в следующей системе растворителей: 1-е направление: хлороформ, ацетон, метанол, муравьиная кислота, вода; 2-е направление: ацетон, бензол, муравьиная кислота, вода. Для количественного выделения МГДГ хроматограмму опрыскивают дистиллированной водой, проявляющей пятна; отмечают нужное пятно, соскребают его с хроматографической пластины вместе с адсорбентом и помещают в сосуд. Затем проводят десорбцию (элюирование), обрабатывая вещество с адсорбентом этанолом. Раствор отфильтровывают от адсорбента центрифугированием и проводят вакуумное испарение растворителя. Выход МГДГ составляет 0.0057 г или 1,1 мас.% от массы общих липидов.