Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS VKM AС-2628D - ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм Rhodococcus erythropolis VKM As-2628D - деструктор нефти и нефтепродуктов, который может быть использован для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, керосин авиационный, бензин).

Уровень техники.

Известны штаммы: Serratia odorifera А 36 (1. Патент RU №2157839. Штамм бактерий Serratia odorifera А 36 ГКМ ВИЗР N 100 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/26, В09С 1/10 C12N 1/26, C12R1:425. Заявка: 99111625/13, 31.05.1999. Опубликовано: 20.10.2000. Патентообладатели: Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Сабаляускас Ю., Диджяпетрис А., Янкявичус К. Авторы: Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Новикова И.И., Чумакова А.Я., Сабаляускас Ю., Диджяпетрис А., Янкявичус К.); Kurthia zopfii 7-204 (2. Патент RU №2270063. Штамм бактерий Kurthia zopfii, обладающий свойством утилизировать нефть, нефтепродукты и ароматические полициклические углеводороды. С2, В09С 1/10, C02F 3/34, C12N 1/20, C12R 1/01. Заявка: 2003106326/13, 07.03.2003. Опубликовано: 20.01.2005. Патентообладатель: ООО ПКФ "БИГОР". Авторы: Бирюков В.В., Биттеева М.Б., Щеблыкин И.Н., Осипова В.Г., Коваленко Н.В., Гайтан В.И., Лобов Ю.А., Стехновская Л.Д., Разживин А.В., Барбот B.C., Васильев В.Н.); Pseudomonas putida 36 (3. Авторское свидетельство СССР №1076446, Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. А1, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20 C02F 3/34, C02F 101:32, C12N 1/20, C12R 1:40. Заявка: 3474745, 22.07.1982. Опубликовано: 28.02.1984. Заявитель: Западно-Сибирский научно-исследовательский геологоразведочный нефтяной институт. Авторы: Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н.); Acinetronacter sp. НВ-1 (4. Патент RU №2077579. Штамм бактерий Acinetobacter species, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1.01, C12N 1/20, В09С 101:00. Заявка: 94043331/13, 06.12.1994. Опубликовано: 20.04.1997. Заявитель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии. Авторы: Жиркова Н.А., Кобелев B.C., Холоденко В.П. Патентообладатель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии); Pseudomonas alcaligenes E7 (5. Патент RU N 2134723. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes Е7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12R 1:38. Заявка: 98105707/13, 25.03.1998. Опубликовано: 20.08.1999. Заявитель: Государственный научный центр прикладной микробилогии. Авторы: Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А. Патентообладатель: Государственный научный центр прикладной микробилогии).

Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Известен консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов в составе: Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ку-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 мас. % каждого микроорганизма, при этом совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин в количестве 30-120 г/м² (6. Патент RU 2191643. Способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. C1, В09С 1/10, C12N 1/20, C12N 1/20. C12R 1:01. Заявка: 2001119562/13, 09.07.2001. Опубликовано: 27.10.2002. Заявитель. Закрытое акционерное общество "Полиинформ". Авторы: Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Новикова И.И. Патентообладатель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ"). Недостатком является то, что при приготовлении рабочей суспензии микроорганизмов температура поддерживается на уровне +18+22°C, т.е. микроорганизмы, входящие в состав консорциума, не способны к деградации нефтепродуктов при пониженных положительных температурах (+2°C).

Известен штамм бактерий Bacillus subtilis Колыма 7/2 (7. Патент RU 2446900. Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis. С2. В09С 1/10 (2006.01). Заявка: 2010129158/13, 13.07.2010. Опубликовано: 10.04.2012. Авторы: Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроен М.М.. Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова A.M. Патентообладатель: Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии), обладающий способностью снижать концентрацию нефти до 0,48% в течение 3 месяцев летнего периода.

Однако штамм осуществляет деградацию только нефти и не способен утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, керосин авиационный, бензин), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +2 до +37°C.

Большую эффективность в условиях низких положительных температур показал штамм Rhodococcus erythroplis Е-15 (8. Патент RU N 2019527. Способ очистки почв от нефтяных загрязнений. C1, C02F 3/34, Е02В 15/04, C09K 17/00. Заявка: 93017464/26, 30.04.1993. Опубликовано: 15.09.1994. Заявитель: Северный государственный научно-исследовательский и проектно-конструкторский геологический центр. Авторы: Коронелли Т.В., Аракелян Э.И., Комарова Т.И., Ильинский В.В. Патентообладатель: Северный государственный научно-исследовательский и проектно-конструкторский геологический центр), но процесс биодеградация нефти протекает медленно и только при добавлении нитроаммофоски или нитроаммофоски и натриевой селитры.

Известен консорциум штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus erythropolis IT ВКМ Ac-1769 и Pseudomonas fluorescens ВКМ B-6847 (9. Патент РФ №2428471. Экобиопрепарат «Центрум-MMS» для очистки от нефти и нефтепродуктов. C12N 1/26, C02F 3/34, В09С 1/10. Дата подачи заявки: 11.05.2010. Опубликовано: 10.09.2011. Авторы: Забокрицкий А.Н., Забокрицкий Н.А., Минягин М.С. Патентообладатель: Забокрицкий А.Н.), входящих в состав экобиопрепарата «Центрум-MMS», предназначенного для очистки от загрязнителей углеводородной природы, в первую очередь от нефти и горюче смазочных веществ и позволяющего повысить эффективность очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов.

Недостатком известного изобретения является то, что культивирование микроорганизмов различной таксономической и видовой принадлежности, а также различающихся по скорости роста, субстратной специфичности, температурному оптимуму роста приводит к их конкурентной борьбе и снижает их выживаемость, и как следствие усложняет и делает процесс выращивания более материально и энергозатратным.

В качестве прототипа служит штамм бактерий Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D, обладающий утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам в широком диапазоне температур (от +4 до +30°C) (10. Патент RU №2558299. Штамм бактерий Rodococcus sp. - деструктор нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/07. Заявка: 2014138257/10, 22.09.2014. Опубликовано: 27.07.15 г. Бюл. №21. Авторы: Ерофеевская Л.А., Чернявский В.Ф. Патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук).

Недостатком является не способность штамма развиваться при более низких (+2°C) и более высоких (+37°C) положительных температурах, что могло бы обеспечить более широкое применение штамма и его использование в регионах с различными климатическими условиями, кроме того, не выявлена его способность утилизировать бензин и керосин авиационный.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих утилизирующей способностью по отношению, как к нефти, так и нефтепродуктам (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +2 до +37°C, которые могут быть использованы для очистки объектов окружающей среды от загрязнений, как нефтью, так и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).

Поставленная задача решена тем, что получен новый бактериальный штамм бактерий Rhodococcus erythropolis VKM As-2628D, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).

Штамм может быть использован для очистки объектов окружающей среды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в широком диапазоне температур от +2 до +37°C, в относительно короткие сроки (3-60 суток).

Заявляемый штамм бактерий Rhodococcus erythropolis VKM As-2628D (авторский номер LER-9.2) выделен из проб снежного покрова, загрязненного нефтепродуктами (бензин, дизельное топливо), отобранных с территории автозаправочной станции «АЗС «Парiтет», ул. Автострада 50 лет Октября 10/1а, г. Якутск, Республика Саха (Якутия).

Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным номером VKM As-2628D.

Полученный штамм Rhodococcus erythropolis VKM As-2628D характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Грамположительные, не подвижные палочки; спор и капсул не образуют.

Кулътуральные характеристики.

На мясопептонном агаре (МПА) (масс. %: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) и ГРМ агаре (на основе гидролизата рыбной муки), масс. %: гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная остальное; pH 7,1-7,5, формирует бежевые, выпуклые, блестящие колонии, диаметром 1-5 мм; консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.

На среде Сабуро (состав, г/л: пептон - 10,0 мальтоза - 40,0; агар - 12,0±2,0; вода очищенная до 1 л), формирует бежево-розоватые блестящие колонии.

На агаризованной среде Мюнца (11. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки - Микробиология, 1963, №5 - С. 1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, бензин, керосин авиационный) следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgSO₄ ⋅ 7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, pH - 7,2, растет в виде бежевых выпуклых колоний диаметром 1 мм.

В мясо-пептонном бульоне промышленного производства образует муть с обильным придонным осадком.

Отношение к кислороду: аэробы.

Растет в диапазоне pH 5,5-8,5, при температуре от +2 до +37±1°C.

Используемые источники углерода: сорбит.

Проверенные не используемые источники углерода: лактоза, глюкоза, цитрат натрия, малонат натрия.

Другие проверенные тесты: оксидаза-отрицательный, не декарбоксилирует лизин и орнитин, не способен расщеплять фенилаланин, индол-отрицательный, с ероводород не продуцирует, активный в отношении инозита, уреаза-отрицательный, тест с - отрицательный.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Штамм не патогенен для растений (проверка на фитотоксичность проведена на семенах овса посевного ( sativa) сорт «Скакун», пшеницы (Triticum) сорт «Приленская-19» и клевера лугового (Trifolium pretense).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 14 дней) на скошенном МПА или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах в условиях холодильника.

При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:

Результаты определения родовой принадлежности штаммов и процента сходства с ближайшими известными видами, представлены в таблице №1.

Штамм может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН), по адресу: 677980, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Октябрьская, 1.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение и культивирование штамма Rhodococcus erythropolis VKM As-2628D

Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis VKM As-2628D выделен из снежного покрова, загрязненного нефтепродуктами (бензин, дизельное топливо), методом накопительных культур на минеральной среде с нефтью с последующим пересевом на МПА.

Для этого, пробу снежного покрова поместили в стерильную емкость с крышкой для оттаивания до жидкого состояния.

Оттаивание пробы проводили при комнатной температуре.

После чего, соблюдая правила асептики, 10 мл оттаявшей пробы, при помощи пипетки Пастера, вносили в колбы емкостью 250 мл, с содержанием 100 мл, заранее подготовленной минеральной среды следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное, pH 7,2.

В качестве источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в подготовленную среду в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды.

Инкубация проводилась в качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +20±1°C.

Рост бактерий наблюдали уже через 24 часа инкубации по образованию мутной эмульсии и дезинтеграции слоя нефти.

Чистая культура бактерий получена путем культивирования при выше перечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с МПА (масс. %): ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2.

Далее посевы инкубировали в стационарных условиях при различных температурах (+2, +4, +10, +20, +30 и +37°C).

Рост бежевых, выпуклых, блестящих колоний, диаметром 1-5 мм на МПА наблюдали:

- через 18-24 ч., при культивировании культуры при температурах +10 и +20°C;

- через 48-72 ч., при культивировании культуры при температурах +30 и +37°C;

- через 18-20 суток при культивировании культуры при температурах +2 и +4°C.

По культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16SpPHK и ключевых фенотипических признаков, согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (12. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact; July 1985, p. 408.), полученная культура бактерий идентифицированна, как Rhodococcus erythropolis.

Пример 2. Приготовление бактериального препарата на основе клеток штамма Rhodococcus erythropolis VKM As-2628D

Изолированные колонии, полученные по примеру 1, пересевают на скошенный МПА и инкубируют 24-48 часов при температуре +20±1°C. Клетки смывают 0,9% раствором NaCl и готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята с титром 1×10⁹ микробных клеток/см по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Для получения препарата готовят жидкую минеральную среду с нефтью (нефтепродуктами) следующего состава (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; нефть (нефтепродукты) - 1,0; вода дистиллированная - остальное; pH среды - 7,2.

Культивирование проводят в колбах в качалочных условиях в течение 48-72 часов, при температуре плюс 20±1°C, при 200 об/мин.

Через 48-72 часов получают жидкую мутноватую смесь клеток штамма Rhodococcus erythropolis VKM As-2628D с титром 1-5×10⁹ клеток/см³, которую можно использовать в качестве препарата для обработки почвы или воды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Rhodococcus erythropolis VKM As-2628D

Клетки штамма Rhodococcus erythropolis VKM As-2628D смывают 0,9% раствором NaCl со скошенного МПА (по примеру 2), готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Полученный бактериальный изолят штамма Rhodococcus erythropolis VKM As-2628D культивируют в водной среде с минеральным составом (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное; pH среды - 7,2.

В колбочки объемом 200,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти (нефтепродуктов).

Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1×10⁹ клеток/см³.

В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь.

Опыт проводят в трех повторностях.

Колбы культивируют при температурах +20, +30 и +37°C в течение 3 суток в условиях постоянной аэрации и, при температурах +2, +4 и +10°C - в течение 20 суток.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-0,25» (13. ФР. 1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117. Методка выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-0,25»).

Данные эксперимента показывают (таблица 2), что в водной среде с минеральными компонентами предлагаемый штамм Rhodococcus erythropolis VKM As-2628D через 3 суток культивирования, в условиях постоянной аэрации деструкция нефти и нефтепродуктов составила:

- от 64,57 до 69,76%, при температуре +20°C;

- от 45,59 до 48,79%, при температуре +30°C;

- тот 41,98 до 46,36% - при температуре +37°C.

Показатели снижения содержания нефтепродуктов при культивировании в условиях пониженных положительных температур через 20 суток составили:

- от 3,36 до 3,58% - для температуры +2°C;

- от 14,0 до 17,98% - для температуры +4°C;

- от 32,8 до 34,0% - для температуры +10°C.

Пример 4. Очистка воды от нефти с помощью клеток штамма Rhodococcus erythropolis VKM As-2628D

В эксикатор объемом 5,0 дм³ вносят 3,0 дм³ водопроводной воды, отстоявшейся в течение суток при комнатной температуре.

8 воду добавляют 30000 мг сырой неочищенной нефти (нефтепродукта) и 30,0 см³ бактериального изолята штамма Rhodococcus erythropolis VKM As-2628D, приготовленного по примеру 2, содержащего 1,0-10⁹ клеток/см³ суспензии.

В качестве контроля используют воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30000 мг нефти (нефтепродукта) и без внесения микробной суспензии бактериального изолята.

Эксперимент проводят в течение 60 суток, поддерживая температуру воды в интервале +15+20°C.

Полученные результаты (таблица 3) показали, что в воде, деструкция нефти под влиянием штамма Rhodococcus erythropolis VKM As-2628D за 60 суток составила 79,26% для нефти и 79,93% для дизельного топлива.

Деструкция в контрольной емкости существенно не изменилась (таблица 3).

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки (от 3 до 60 суток), в широком диапазоне температур от +2 до +37°C, который может быть использован для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, керосин авиационный, бензин).